C. elegans Dissection de gonade et fissure de congélation pour immunofluorescence et coloration DAPI

Résumé

Il s’agit d’une méthode couramment utilisée pour la dissection de gonades de C. elegans suivie d’une fissure de congélation, qui produit des échantillons germinaux pour l’immunofluorescence via la coloration des anticorps, ou pour la coloration DAPI simple pour visualiser l’ADN. Ce protocole a été couronné de succès pour les étudiants de premier cycle dans un laboratoire de recherche et dans une expérience de recherche de premier cycle basée sur des cours.

Résumé

La lignée germinale de C. elegans constitue un excellent modèle pour l’étude de la méiose, en partie en raison de la facilité d’effectuer des analyses cytologiques sur des animaux disséqués. Les préparations de montage entier préservent la structure des noyaux méiotiques et, surtout, chaque bras de gonade contient tous les stades de la méiose, organisés selon une progression temporelle et spatiale qui facilite l’identification des noyaux à différents stades. Les hermaphrodites adultes ont deux bras gonades, chacun organisé comme un tube fermé avec des cellules souches germinales proliférantes à l’extrémité fermée distale et des ovocytes cellularisés à l’extrémité ouverte proximale, qui se rejoignent au centre de l’utérus. La dissection libère un ou les deux bras gonades de la cavité corporelle, ce qui permet de visualiser l’intégralité de la méiose. Ici, un protocole commun d’immunofluorescence contre une protéine d’intérêt est présenté, suivi d’une coloration DAPI pour marquer tous les chromosomes. Les jeunes adultes sont immobilisés dans le lévamisole et rapidement disséqués à l’aide de deux aiguilles de seringue. Après extrusion germinale, l’échantillon est fixé avant de subir une fissure de congélation dans l’azote liquide, ce qui aide à perméabiliser la cuticule et d’autres tissus. L’échantillon peut ensuite être déshydraté dans de l’éthanol, réhydraté et incubé avec des anticorps primaires et secondaires. Le DAPI est ajouté à l’échantillon dans le support de montage, ce qui permet une visualisation fiable de l’ADN et facilite la recherche d’animaux à imager au microscope fluorescent. Cette technique est facilement adoptée par ceux qui sont familiers avec la manipulation de C. elegans après quelques heures passées à pratiquer la méthode de dissection elle-même. Ce protocole a été enseigné aux lycéens et aux étudiants de premier cycle travaillant dans un laboratoire de recherche et intégré à une expérience de recherche de premier cycle basée sur des cours dans un collège d’arts libéraux.

Introduction

La méiose est la division cellulaire spécialisée utilisée pour créer des gamètes (ovules et spermatozoïdes/pollen) dans tous les organismes à reproduction sexuée ^1,2. La recombinaison croisée est l’échange réciproque d’ADN entre chromosomes homologues; Il est essentiel pour la méiose, à la fois en fournissant une source importante de diversité génétique et en favorisant la stabilité du génome à travers les générations. Les chromosomes qui ne parviennent pas à former au moins un croisement au cours de la méiose se séparent au hasard, ce qui peut entraîner une non-disjonction chromosomique, créant des gamètes avec le nombre incorrect de chromosomes – une condition qui est généralement fatale pour la descendance^{résultante 3}. Au cours de la méiose, les croisements sont induits par des cassures programmées de l’ADN double brin⁴. Un sous-ensemble de ces cassures sera réparé sous forme de croisements qui fournissent des liaisons physiques de l’ADN, appelées chiasmata, qui aident à orienter les chromosomes homologues en préparation de la division cellulaire⁵. Les stades méiotiques sont hautement conservés chez tous les eucaryotes, et leur conformation chromosomique permet de les identifier facilement.

En tant que concept fondamental en biologie, la méiose est un sujet que les étudiants rencontrent plusieurs fois dans différents cours de biologie. Ils sont souvent initiés à la mécanique de la ségrégation chromosomique méiotique au lycée, tandis que les cours de niveau collégial se concentrent sur la biologie cellulaire de la ségrégation et l’impact génétique de la recombinaison croisée. Cependant, la méiose est un concept notoirement délicat pour de nombreux étudiants¹. L’incapacité à comprendre la relation entre les gènes, l’ADN, les chromosomes et la méiose peut générer des idées fausses et des lacunes dans la compréhension des élèves qui empêchent une compréhension complète de l’héritage génétique ^6,7. Une façon d’améliorer la compréhension des sujets abstraits par les élèves est de proposer des activités concrètes et pratiques. Par exemple, lorsqu’ils enseignent la méiose, les instructeurs peuvent choisir parmi des activités qui émulent l’analyse moléculaire⁸, des modèles 3D qui permettent aux élèves de manipuler des molécules⁹ ou des jeux de rôle où les élèves eux-mêmes jouent la chorégraphie moléculaire¹. L’intégration de la recherche dont les résultats sont inconnus est un moyen particulièrement efficace d’améliorer la compréhension des élèves. Cette pratique est connue sous le nom d’expérience de recherche de premier cycle basée sur des cours (CURE) et a l’avantage supplémentaire de renforcer les attitudes et l’action des étudiants, en particulier pour ceux qui appartiennent à des groupes qui restent sous-représentés dans STEM^10,11. Le ver nématode Caenorhabditis elegans se prête particulièrement bien aux études en classe du comportement, de la fertilité et des croisements génétiques, et constitue un modèle efficace pour initier les étudiants à la recherche biologique¹².

C. elegans fait un puissant organisme modèle pour la biologie cellulaire en combinant la génétique moléculaire avec une analyse cytologique simple. Il est également particulièrement bien adapté à une utilisation dans une classe de biologie ^13,14,15. Ils sont faciles et économiques à entretenir en laboratoire, produisant des centaines de descendants tous les 3 jours, à la fois à température ambiante standard ou à 20 ° C, la température d’incubation la plus courante. Il est important de noter qu’ils peuvent être congelés sous forme de stocks de glycérol et conservés dans un congélateur à -80 ° C, ce qui signifie que toute erreur d’élevage commise par des chercheurs débutants peut être facilement corrigée¹⁶. De plus, son génome bien annoté permet des techniques génétiques ascendantes et inverses^17,18, permettant à C. elegans d’être utilisé pour aborder des questions biologiques allant du moléculaire à l’évolutionnaire. Enfin, les chercheurs de C. elegans ont créé une communauté de soutien qui est souvent disposée à fournir de l’aide et des conseils aux scientifiques en herbe¹⁹. Ces avantages ont conduit à l’intégration de C. elegans dans un certain nombre de CURE dans divers types d’institutions 12,19,20,21,22,23.

En plus de ses avantages pour la recherche et l’enseignement, C. elegans est devenu un modèle populaire pour les études de la méiose et du développement de la lignée germinale^24,25,26. La clarté optique de ces animaux simplifie les approches cytologiques²⁷, et chez les adultes, les gonades représentent près de la moitié de l’animal, fournissant des centaines de cellules méiotiques à étudier. Dans les gonades, les noyaux germinaux méiotiques sont disposés comme une chaîne de montage (Figure 1); La réplication mitotique se produit à l’extrémité distale de la gonade, les noyaux progressant à travers les stades méiotiques en migrant vers l’extrémité proximale de la gonade, où les embryons fécondés émergent de la vulve. Parce que l’organisation spatiale stéréotypée représente également une progression temporelle à travers la méiose, différents stades peuvent être facilement identifiés en fonction de leur organisation chromosomique et de leur emplacement dans la gonade. Enfin, les processus qui perturbent la méiose et provoquent l’aneuploïdie créent des phénotypes simples à caractériser, même pour les novices : stérilité, létalité embryonnaire, ou une forte incidence de mâles (phénotype Him)²⁸.

Il s’agit d’un protocole simple pour visualiser les chromosomes méiotiques chez C. elegans. Le montage, la dissection, la fixation et la coloration des anticorps sont tous effectués sur la même lame de microscope, ce qui simplifie le protocole et permet une récupération presque parfaite de l’échantillon. Cette méthode fonctionne pour la coloration DAPI simple pour visualiser les chromosomes et peut être utilisée pour l’immunofluorescence pour visualiser la localisation des protéines dans la gonade. Les élèves dissèquent les gonades à l’aide de microscopes à dissection de base, génèrent des préparations complètes pour la visualisation de l’ADN ou de l’immunofluorescence et les imagent sur un microscope fluorescent composé. Ce protocole a été enseigné aux élèves du secondaire et aux étudiants de premier cycle travaillant dans un laboratoire de recherche de C. elegans et incorporé dans un CURE dans un collège d’arts libéraux¹². Bien que le CURE ait une taille de classe relativement petite, ce protocole se prêterait à des cours dans divers établissements en raison du coût relativement faible des souches et des réactifs de vers. Les instructeurs ne seraient limités que par le nombre de microscopes à dissection disponibles. La mise en œuvre précédente demandait aux étudiants de travailler en groupes de trois pour partager un seul microscope et s’est déroulée sur trois séances de 90 minutes : la première pour pratiquer la dissection, la deuxième pour mettre en œuvre la dissection et la coloration DAPI, et la troisième pour imager des lames sur un microscope à fluorescence à grand champ. La participation à la recherche de premier cycle offre de nombreux avantages aux étudiants^11,29, tant académiques que personnels. L’intégration de la recherche dans les cours via CUREs permet aux étudiants de participer à la recherche pendant les heures normales^{de classe 11,30,31, ce} qui rend l’exposition à ces avantages plus accessible et équitable.

Protocole

1. Élevage de C. elegans

REMARQUE : Voir le protocole d’entretien¹⁶ de C. elegans et Elgin et coll.32 pour plus de détails. Les souches de C. elegans peuvent être facilement acquises auprès du Caenorhabditis Genetics Center (https://cgc.umn.edu) et sont expédiées par courrier ordinaire à n’importe quel endroit aux États-Unis. Chaque souche coûte 10 $ et chaque laboratoire/utilisateur paie des frais annuels de 30 $.

1. En utilisant une technique stérile, préparer des plaques de gélose à milieu de croissance de nématodes de 6 cm (plaques de gélose NGM).
   REMARQUE: Les assiettes coulées peuvent être stockées à l’envers dans leurs manchons en plastique d’origine ou leurs récipients hermétiques à 4 ° C pendant plusieurs mois.
   1. Pour faire des plaques de gélose NGM, ajouter 3 g de NaCl, 2,5 g de peptone Botto, 20 g de gélose NGM et ddH₂O à 1 L (~975 mL). Autoclaver le média à l’aide d’un cycle liquide maintenu à 121 °C pendant 20 min. Laisser refroidir à 55 °C et, à l’aide d’une technique stérile, ajouter 1 mL de cholestérol, 0,5 mL de 1 M CaCl₂, 1 mL de 1 M MgSO₄ et 25 mL de tampon phosphate de potassium 1 M (pH 6).
      NOTE: Pour faire 1 M tampon phosphate de potassium, mélanger 108,3 g de KH₂PO 4 (monobasique) et 35,6 g de_K2HPO4 (dibasique); si nécessaire, ajustez le pH à 6 en utilisant KOH. Ajouter_ddH2Ojusqu’à 1 L (habituellement ~900 mL) et autoclaver pendant 40 min à 121 °C. 1 L de NGM fait environ 100 plaques contenant 10 mL chacune.
2. À l’aide d’une pipette sérologique ou de transfert, repérer les plaques avec trois gouttes de cultures bactériennes d’E. coli OP50 (~150 μL). Essayez de repérer au centre de la plaque et évitez de placer des endroits trop près des bords de la plaque; Cela découragera les animaux de ramper sur les côtés des assiettes et de dessécher.
3. Une fois la pelouse bactérienne sèche, conservez les plaques tachetées à l’envers à température ambiante (RT) jusqu’à 2 semaines. Repérer les plaques au moins 1-2 jours avant l’utilisation permettra aux pelouses bactériennes de devenir plus épaisses et de supporter une densité plus élevée d’animaux.
   REMARQUE: Pour préparer des cultures bactériennes OP50, OP50 peut être commandé auprès du Centre de génétique Caenorhabditis. La bactérie OP50 est striée à partir d’un stock de glycérol sur une plaque LB pour assurer des colonies uniques et maintenue à 4 ° C pendant 4-6 semaines. Les cultures bactériennes OP50 sont cultivées en LB pendant la nuit à 37 °C à partir d’une seule colonie – aucune agitation n’est nécessaire. Pour préparer les milieux LB, ajouter 10 g de tryptone, 10 g de NaCl, 5 g d’extrait de levure, 950 mL de ddH2O, ajuster le pH à 7 avec 10 N NaOH et ajuster le volume final à 1 L avec ddH 2O. Aliquote en quantités de 100 mL et autoclave pendant₂₀min à₁₂₁°C.
4. Pour créer un stock de travail pour chaque souche, choisissez trois hermaphrodites au stade L4 sur une plaque NGM tachetée. Conserver les assiettes entre 15 et 25 °C. Les conditions normales de culture sont de 20 °C. Si l’accès à des incubateurs à température contrôlée n’est pas disponible, entretenez les cultures sur la paillasse à RT.
   REMARQUE: Les hermaphrodites au stade L4 peuvent être facilement stadifiés à la fois par la taille (plus petit que les adultes) et la présence d’un demi-cercle distinct à mi-chemin de leur corps (la vulve en développement). À 20 °C, les animaux atteindront le stade L4 34-46 h après l’éclosion (soit environ 40-52 h après la ponte des embryons). Voir Corsi et ^coll.14 pour plus de détails sur le moment des stades de développement.
   1. Déplacer les cultures à différentes températures pour contrôler le taux de développement. Les animaux grandiront plus vite à des températures plus élevées et plus lentement à des températures plus basses. Ils commenceront à devenir stériles à des températures supérieures à 25 °C.
      REMARQUE: Certains génotypes mutants sont sensibles à la température et afficheront différents phénotypes en fonction de la température de culture.
5. Maintenir les stocks de travail en choisissant trois hermaphrodites à l’étage L4 sur une nouvelle plaque NGM tachetée tous les 4 jours. Cela garantira une population constante et bien nourrie avec un large éventail de stades de développement.

2. Dissection des gonades

1. Collecte d’adultes appariés selon l’âge : 12 à 24 heures avant la dissection, choisissez des hermaphrodites au stade L4 sur une nouvelle plaque NGM tachetée – ceux-ci deviennent de jeunes adultes le lendemain, ce qui est idéal pour la dissection. Le nombre d’hermaphrodites au stade L4 dépendra de l’analyse cytologique effectuée; Habituellement, 10 à 20 hermaphrodites sont disséqués par lame, avec deux à quatre lames générées par condition.
   NOTE: Les gonades sont extrudées plus efficacement chez les animaux bien nourris. Assurez-vous de choisir des hermaphrodites L4 parmi les stocks de travail qui ne sont pas affamés (c.-à-d. qu’il y a encore une pelouse bactérienne visible présente dans l’assiette). Les animaux affamés ont tendance à subir des extrusions de gonades incomplètes, ce qui les rend difficiles à visualiser.
   1. Si vous évaluez les stades ultérieurs de la méiose, comme la diakinésie, disséquez les personnes âgées (48 h après L4) parce qu’elles accumulent plus de noyaux au stade de la diakinésie, ce qui simplifie l’analyse. Cependant, les chercheurs devraient noter la possibilité que certains effets puissent être causés par l’âge avancé de la mère.
2. Préparez-vous à la dissection.
   1. Préparer M9 : Ajouter 3 g de KH₂PO₄ (monobasique), 6 g de_Na2HPO4(dibasique), 5 g de NaCl, et ajouter ddH2O à 100 mL. Autoclaver la solution pendant 20 min à 121 °C, laisser refroidir, puis ajouter 1 mL de 1 M MgSO4 en utilisant une technique stérile.
   2. Préparer le tampon de dissection : Mélanger 1 μL de Tween 20 à 10 %, 12 μL de lévamisole 100 mM, 10 μL de 10x M9 et 77 μL de_ddH2O.
      REMARQUE: Tween 20 est inclus dans le tampon de dissection pour réduire la tension superficielle et perméabiliser davantage les membranes tissulaires.
   3. Préparer la solution fixe (PFA à 2 % [100 μL]) : Mélanger 12,5 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 16 %, 10 μL de 10x M9 et 77,5 μL de_ddH2O; assurez-vous d’utiliser une ampoule fraîche de PFA (ouverte pendant pas plus de 2 semaines).
      ATTENTION : Le PFA est un produit chimique dangereux et une solution fixe doit être préparée dans la hotte.
   4. Configurez la méthode de congélation - l’azote liquide est plus facile à gérer, mais si nécessaire, un bloc d’aluminium peut être utilisé sur de la glace sèche.
      1. Méthode à l’azote liquide: Placez un bécher en plastique ou un pot en plastique Coplin dans une boîte en polystyrène. Remplissez le bécher avec de l’azote liquide (le débordement dans le récipient en polystyrène est très bien). Placez la pince à épiler à proximité. Idéalement, le bécher doit être suffisamment étroit pour empêcher les lames de microscope de tomber complètement horizontalement - les lames doivent être inclinées et faciles à saisir avec une pince à épiler.
         REMARQUE: Il est important d’utiliser des contenants en plastique lorsque vous travaillez avec de l’azote liquide plutôt qu’avec du verre pour éviter les éclatements dus à un refroidissement rapide.
      2. Méthode de glace carbonique:
         1. Placez un bloc d’aluminium plat sur de la glace sèche dans un contenant en polystyrène ou un seau à glace rectangulaire. Il est plus facile de geler les lames si le haut du bloc se trouve au-dessus du haut du conteneur.
         2. En portant des gants, appuyez doucement sur le bloc d’aluminium pour assurer un bon contact avec la glace sèche et accélérer le processus de refroidissement (il peut libérer un cri lorsque le métal refroidit rapidement). Placez une lame de rasoir à proximité.
         3. Laissez le bloc d’aluminium sur de la glace sèche pendant au moins 30 minutes avant l’arrêt du gel-fissure pour permettre un refroidissement complet, ce qui est nécessaire pour une congélation rapide.
            REMARQUE: Idéalement, des blocs solides de glace sèche devraient être utilisés, ce qui aide la surface à rester plane. Si nécessaire, un bloc d’aluminium peut être placé sur des granulés de glace carbonique, mais il faut veiller à ce que la surface reste plane.
         4. La surface du bloc d’aluminium recueillera le givre, ce qui peut empêcher un contact étroit entre les glissières et le bloc. Utilisez la lame de rasoir pour gratter le givre de la surface, en dégageant une zone pour chaque glissade. Couvrir le contenant en polystyrène avec un couvercle aidera à prévenir l’accumulation excessive de gel.
   5. Remplissez un pot Coplin avec ~40 ml d’éthanol à 95%.
   6. Remplissez trois pots Coplin avec ~40 ml de PBS-T.
      REMARQUE: Pour faire du PBS-T, mélanger 100 mL de PBS 10x, 5 mL de Triton X-100 et 2 mL de 0,5 M EDTA (pH 8). Ajouter 873 mL de ddH2O. Agiter vigoureusement pour dissoudre le Triton X-100. Pour obtenir 10x PBS, mélanger 25,6 g de_Na2HPO4·7H2O, 80 g de NaCl, 2 g de KCl, et 2 g de_KH2PO4. Ajouter_ddH2Opour porter le volume à 1 L. Autoclave pendant 40 min à 121°C. Le détergent Triton X-100 est inclus dans le tampon de lavage PBS-T pour réduire la tension superficielle et améliorer la rétention des animaux entiers sur la lame.
3. Disséquer les animaux sur une glissière de verre de 18 mm x 18 mm. Cette étape est sensible au temps en raison de l’évaporation du tampon de dissection. Cela devrait prendre moins de 5 minutes pour terminer les dissections.
   REMARQUE: Le lévamisole est utilisé pour immobiliser les animaux afin de les rendre plus faciles à disséquer, mais les laisser dans le lévamisole trop longtemps entraînera une mauvaise extrusion des gonades. Il est plus facile de réduire le nombre d’animaux disséqués par diapositive afin de tenir dans le délai de 5 minutes.
   1. Placez une lame de maintien sur la scène d’un microscope à dissection - la lame de maintien est utilisée pour déplacer la lame de couverture plus facilement et peut être réutilisée indéfiniment (Figure 2A, photo de gauche).
   2. Placer le couvercle sur la lame de maintien et pipeter 4 μL de la solution de dissection au centre du couvercle. Déplacez la diapositive d’attente d’un côté de la scène pour libérer la vue.
   3. Choisissez 10-20 hermaphrodites dans la goutte de solution disséquante. Choisissez suffisamment d’animaux à imager ~10 par diapositive, mais pas au point qu’ils ne puissent pas être disséqués en 5 minutes.
   4. Disséquer les animaux à l’aide de deux aiguilles de seringue, une pour chaque main (figure 2A).
      1. Croisez les pointes des aiguilles pour former un X et utilisez le bas du X pour épingler un adulte à la surface de la lamelle de couverture.
         REMARQUE: Il peut falloir de la pratique pour découvrir la meilleure façon de tenir chaque aiguille en termes d’angle et de rotation. Commencez par tenir les aiguilles avec leurs biseaux (bord incliné) vers le bas. Voir la discussion pour des suggestions sur l’apprentissage initial à disséquer dans un volume plus grand (Figure 2D).
      2. Placez la forme en X immédiatement derrière le pharynx, à environ 1/5 de la longueur du corps d’un jeune adulte, ou juste en dessous de la partie claire de la tête (Figure 2A, diagramme de droite).
      3. Décapitaisez l’animal d’un seul mouvement de ciseaux (comme trancher de la nourriture avec un couteau et une fourchette). Une bonne extrusion entraînera la libération complète d’un bras de la gonade (ou parfois des deux bras) de la cavité corporelle, ainsi que d’une ou des deux moitiés de l’intestin (Figure 2B, image de gauche). L’intestin apparaîtra plus sombre et de largeur uniforme, tandis que la gonade apparaîtra claire avec une pointe effilée distale.
         1. Chaque animal ne doit être coupé qu’une seule fois; Si la gonade n’extrude pas après avoir fait la coupe, passez simplement à l’animal suivant. La première coupe réduit considérablement la pression hydrostatique dans le corps, ce qui rend toute coupe supplémentaire peu susceptible d’aboutir à une meilleure extrusion. Les extrusions incomplètes ou médiocres sont facilement visibles lors de l’imagerie et peuvent être ignorées (Figure 2B, image de droite).
            REMARQUE: N’essayez pas de séparer la gonade de la carcasse, cela déchirera généralement le tissu et limitera le nombre de stades méiotiques pouvant être analysés.
      4. Répétez la dissection pour les animaux restants sur le bordereau de couverture.
4. Fixez l’échantillon avec du formaldéhyde.
   1. En travaillant doucement, pipeter 4 μL de la solution fixe sur la lamelle de couverture très près de la goutte avec les animaux. Idéalement, les gouttes sont assez proches pour fusionner; Évitez de pipeter directement dans la goutte de dissection et de déplacer les carcasses disséquées.
   2. Épinglez le bordereau de couverture à la lame de maintien à l’aide d’un doigt. De l’autre main, effleurez doucement le bordereau plusieurs fois pour mélanger les gouttes. La concentration finale fixée est de 0,8 % de PFA.
   3. En tenant une glissière chargée positivement vers l’avant, utilisez-la pour ramasser la glissière au centre de la glissière. Touchez doucement la goutte d’échantillon, et la tension superficielle de la goutte ramassera la lamelle de couverture.
      REMARQUE: Les lames chargées positivement ont un revêtement électrostatique qui aide les tissus à adhérer à la surface pour éviter la perte d’échantillon.
      1. Si vous le souhaitez, placez la lamelle de couverture en diagonale, de telle sorte qu’un coin pend de 1 mm du bord supérieur ou inférieur de la glissière. Si vous laissez un porte-à-faux, il sera plus facile de fissurer la lamelle de couverture après le gel (figure 2C).
   4. Placez la glissière sur le banc et fixez pendant exactement 5 minutes à RT. Pendant ce temps, étiquetez la diapositive avec un crayon.
      REMARQUE: Il est courant de surfixer les échantillons, ce qui peut être détecté par une exclusion d’anticorps des noyaux ou même de tous les tissus. De plus, certains anticorps sont particulièrement sensibles au formaldéhyde. Dans ces cas, réduire le temps de fixation, ou diminuer la concentration finale de formaldéhyde utilisée.
5. Gel-fissure
   1. Immédiatement après la correction, figez les diapositives.
      1. Si vous utilisez de l’azote liquide : Tenez le bord étiqueté de la lame avec une pince à épiler et abaissez-le doucement en azote liquide. Relâchez la glissière de telle sorte qu’elle s’appuie contre le côté du bécher, côté couvercle vers le haut. Les lames sont congelées en 10 s (une fois que le liquide cesse de bouillir).
      2. Si vous utilisez de la glace sèche: grattez le givre de la surface du bloc d’aluminium avec un rasoir. Tenez fermement le bord étiqueté de la glissière et placez-le sur la surface dégagée, en appliquant une certaine pression vers le bas pour assurer un contact complet avec le bloc. Le capot doit être complètement sur la surface du bloc. La congélation a lieu dans les 10 s et peut être confirmée visuellement lorsque l’échantillon sous la lamelle de couverture se transforme en glace.
      3. Pour les deux méthodes, laissez les lames pendant au moins 5 minutes pour les congeler complètement.
         REMARQUE: Une fois congelées, les lames peuvent être laissées dans de l’azote liquide ou sur le bloc pendant 15-20 minutes, tant qu’elles restent gelées. Cela permet de collecter plusieurs lames à ce stade avant de passer à l’étape de fissuration.
   2. En travaillant rapidement, déchiffrez le bordereau de couverture de l’échantillon. Cette étape est urgente. Retirez la lamelle de couverture et immergez la lame dans de l’éthanol avant que l’échantillon ne commence à décongeler.
      1. Retirez la lame congelée (à l’aide d’une pince à épiler pour l’azote liquide).
      2. Saisissez fermement le bord court étiqueté de la glissière et attachez un long bord contre le banc.
      3. De l’autre main, saisissez fermement un rasoir et faites glisser le bord du rasoir le long de la lame pour retirer le couvercle et l’éloigner de l’échantillon. Cette étape est légèrement plus facile si la lamelle de couverture est positionnée avec un porte-à-faux d’angle (Figure 2C).
6. Placez immédiatement la lame dans un pot Coplin contenant 95% d’éthanol à TA. Laissez les lames dans l’éthanol pendant au moins 5 minutes.
   REMARQUE: Les lames peuvent être laissées dans de l’éthanol pendant un certain temps, ce qui permet de recueillir plusieurs lames à cette étape avant de procéder aux lavages. Les diapositives peuvent également être stockées à cette étape pendant plusieurs jours. En cas de stockage, déplacer le pot Coplin de lames dans de l’éthanol à -20 °C.
7. Lavez les lames dans PBS-T trois fois pendant 5 minutes chacune à RT. Utilisez du PBS-T frais pour chaque lavage.
8. En cas de coloration avec des anticorps, passez à l’étape 3 (coloration des anticorps). Si seulement la coloration avec DAPI pour visualiser les chromosomes, passez à l’étape 4 (montage et imagerie).

3. Coloration des anticorps

1. Incubation d’anticorps primaires
   REMARQUE : Lors de l’élaboration de conditions appropriées pour les nouveaux anticorps, il est important d’inclure les témoins négatifs suivants pour vérifier la spécificité du signal fluorescent : 1) Une lame dépourvue d’anticorps primaire et d’anticorps secondaire seulement; 2) une lame avec un anticorps primaire seulement qui n’a pas d’anticorps secondaire. Chacun de ces contrôles négatifs devrait produire une absence totale de signal. Si la fluorescence est identifiée sur la lame d’anticorps secondaires seulement, la dilution de l’anticorps secondaire doit être augmentée ou un autre secondaire doit être utilisé. Si la fluorescence est identifiée sur la lame d’anticorps primaires seulement, elle est probablement due à l’autofluorescence ou à d’autres contaminants potentiels.
   1. Diluer l’anticorps primaire dans un tampon de dilution d’anticorps (50 mg de BSA + 50 μL d’azoture de sodium à 10 % + 10 mL de PBS-T) - préparer suffisamment de dilution d’anticorps pour utiliser 20 à 30 μL par lame.
   2. Préparez une chambre humide : Tapisser le fond d’un contenant en plastique d’un couvercle hermétique avec des serviettes en papier humides. Posez une seule couche de pépins Pasteur en verre sur les serviettes en papier. Ces pipets créent une surface qui permet aux glissières de rester à niveau et les maintient surélevées par rapport aux serviettes en papier.
      REMARQUE: Pour les chambres humides, il est préférable d’utiliser des récipients de stockage des aliments en plastique avec des couvercles à pression, ce qui facilite l’ouverture et la fermeture du récipient sans perturber les glissières à l’intérieur. Recherchez-en un qui est assez long pour les pipets Pasteur, mais qui a également un fond relativement plat sans indentations pour permettre aux glissières de reposer complètement horizontalement.
   3. Retirez la lame du lavage PBS-T final. Travaillez rapidement à partir de cette étape pour garder l’échantillon humide en tout temps et éviter l’évaporation. Si l’échantillon se dessèche, la coloration des anticorps sera affectée négativement.
   4. Sécher toute la surface de la lame à l’aide d’un mouchoir d’essuyage plié en un rectangle compact. Essuyez l’avant et l’arrière de la lame, mais laissez beaucoup d’espace autour de l’échantillon. Faites particulièrement attention lorsque vous séchez la surface près de l’échantillon - évitez de vous approcher trop près de l’échantillon, ce qui laisse une zone de la taille de la lamelle de couverture non séchée. Cependant, assurez-vous que le périmètre de l’échantillon est sec pour l’étape suivante.
   5. Dessinez un cercle autour de l’échantillon à l’aide d’un stylo PAP hydrophobe. Prenez soin de fermer toute la zone d’échantillonnage, mais évitez de perturber les carcasses d’animaux visibles sur la surface de la lame. Attendez ~5 s pour permettre à la barrière de sécher complètement.
      REMARQUE: Une barrière hydrophobe est nécessaire pour contenir la solution d’anticorps primaires parce que la surface de la lame a été recouverte de PBS-T, qui contient un détergent. Le stylo PAP fonctionne mieux sur une surface de lame sèche, il est donc important de créer un périmètre sec autour de l’échantillon. Laisser la zone la plus proche de l’échantillon non séchée protège l’échantillon pendant cette étape
   6. En travaillant rapidement, utilisez le coin ou le bord du tissu d’essuyage plié pour évacuer le liquide de l’échantillon à l’intérieur de la barrière hydrophobe. Prenez soin d’éviter de perturber les carcasses d’animaux.
   7. Injecter immédiatement 20 μL de la solution d’anticorps primaire dans le cycle créé par la barrière hydrophobe. Prenez soin de pipeter doucement et en biais pour éviter de perturber les carcasses. Évitez de pipeter directement sur une carcasse.
   8. Inclinez doucement la lame pour vous assurer que toute la surface à l’intérieur de la barrière hydrophobe est recouverte par la solution.
      REMARQUE: Il est préférable que les barrières hydrophobes aient une circonférence intérieure de 1 à 1,5 cm, entièrement recouverte de 20 μL de la solution d’anticorps. La largeur de circonférence dépendra de la façon dont les carcasses sont réparties pendant l’étape de gel-fissure. Des barrières plus larges peuvent nécessiter un volume plus élevé de solution d’anticorps. Si vous le souhaitez, de petits carrés de parafilm (coupés à la taille de la lamelle de couverture de 18 mm x 18 mm) peuvent être délicatement placés sur l’échantillon. Les carrés du parafilm garantiront que la solution d’anticorps couvre tout l’échantillon et aideront également à prévenir l’évaporation.
   9. Répétez les étapes 3.1.3 à 3.1.8 pour le reste des diapositives.
   10. Transférez soigneusement les lames dans la chambre humide, en vous assurant que la solution reste contenue dans la barrière hydrophobe et que les lames reposent complètement à niveau.
   11. Incuber les lames pendant la nuit à TA. Selon l’anticorps, cette étape pourrait être raccourcie à 6 h ou réalisée pendant la nuit à 4 °C en conservant la chambre humide dans une chambre froide ou un réfrigérateur.
       REMARQUE: L’utilisation d’une chambre humide et de barrières hydrophobes est généralement suffisante pour empêcher l’évaporation de la solution d’anticorps, même pour de longues incubations nocturnes. Cependant, si l’évaporation s’avère être un problème, de petits carrés de parafilm peuvent être placés doucement sur chaque échantillon, ce qui aidera à prévenir l’évaporation. Ceux-ci peuvent être enlevés lors de la première étape de lavage : immergez chaque lame dans un pot Coplin rempli de PBS-T (ne contenant pas d’autres lames) et laissez le parafilm flotter loin de l’échantillon. Retirez le parafilm du pot Coplin avant d’utiliser le même pot pour retirer le parafilm de la diapositive suivante.
2. Lavez les lames dans des bocaux Coplin contenant ~40 mL de PBS-T trois fois pendant 5 minutes chacune à TA. Utilisez du PBS-T frais pour chaque lavage.
   1. Pendant ces lavages, diluer l’anticorps secondaire dans un tampon de dilution d’anticorps. Préparer suffisamment de dilution d’anticorps pour utiliser 20-30 μL par lame. Il est courant d’utiliser des anticorps secondaires conjugués Alexa Fluor dilués à 1:200.
3. Incubation d’anticorps secondaires
   1. Retirez la lame du lavage PBS-T final. Travaillez rapidement à partir de cette étape pour garder l’échantillon humide en tout temps et éviter l’évaporation.
   2. Sécher la lame à l’aide d’un mouchoir d’essuyage plié. Évitez de dessécher la zone contenue par la barrière hydrophobe.
   3. En travaillant rapidement, utilisez le coin ou le bord du tissu d’essuyage plié pour évacuer le liquide de l’échantillon à l’intérieur de la barrière hydrophobe. Prenez soin d’éviter de perturber les carcasses d’animaux.
   4. Injecter immédiatement 20 μL de la solution d’anticorps secondaire dans le cycle créé par la barrière hydrophobe. Prenez soin de pipeter doucement et en biais pour éviter de perturber les carcasses.
   5. Évitez de pipeter directement sur une carcasse. Assurez-vous que toute la surface à l’intérieur de la barrière hydrophobe est recouverte par la solution. Des circonférences de barrière plus larges peuvent nécessiter un volume plus élevé de solution d’anticorps. Si vous le souhaitez, couvrir l’échantillon d’un petit carré de parafilm (voir la remarque ci-dessous à l’étape 3.1.8).
   6. Transférez soigneusement la lame dans la chambre humide, en vous assurant que la solution reste contenue dans la barrière hydrophobe et que la lame repose complètement à niveau. Replacez le couvercle de la chambre humide pour garder la lame dans l’obscurité.
   7. Répétez les étapes 3.3.1 à 3.3.6 pour le reste des diapositives.
   8. Incuber dans le noir pendant 4 h à RT.
      REMARQUE: Selon l’anticorps, cette étape peut être raccourcie à 2 h ou prolongée à 6 h. Si la chambre humide n’est pas sombre, placez-la dans un tiroir ou recouvrez-la d’une boîte en carton. Alternativement, la chambre humide peut être enveloppée dans du papier d’aluminium pour garder les lames dans l’obscurité.
4. Lavez les lames dans des bocaux Coplin contenant ~40 mL de PBS-T trois fois pendant 5 minutes chacune à TA. Utilisez du PBS-T frais pour chaque lavage.

4. Montage et imagerie

1. Préparez-vous pour le montage de l’échantillon en ayant un support de montage + DAPI (2 μg/mL), des lamelles de verre de 18 mm x 18 mm et du vernis à ongles à portée de main.
2. Retirez la lame du lavage final et séchez-la à l’aide d’un mouchoir d’essuyage plié. Évitez de dessécher la zone contenue par la barrière hydrophobe.
3. À l’aide du coin du tissu d’essuyage plié, évacuez soigneusement le liquide de l’échantillon à l’intérieur de la barrière. Retirez la plupart du liquide à cette étape, mais sans laisser les carcasses sécher complètement.
4. En travaillant rapidement, ajoutez 8 μL du support de montage à l’échantillon. Pipeter doucement et en biais pour éviter de perturber les carcasses. Évitez de pipeter directement sur les carcasses.
5. Toujours en travaillant rapidement, abaissez soigneusement une lamelle de verre sur l’échantillon.
   1. Les bulles d’air peuvent perturber l’imagerie et entraîner la dégradation des échantillons. Pour minimiser les bulles d’air, posez un bord de la lamelle de couverture sur la lame à côté de l’échantillon, de sorte qu’elle soit maintenue en diagonale au-dessus de l’échantillon. Il peut être utile de reposer le bord supérieur de la lamelle de couverture sur un crayon ou une pince à épiler. Ensuite, abaissez lentement le bord supérieur de la glissière de couverture vers le bas - ce mouvement permet au support de montage de créer un joint liquide progressant d’un bord au bord opposé.
6. Répétez les étapes 4.2 à 4.5 pour le reste des diapositives.
7. Scellez les lamelles avec du vernis à ongles. Prenez soin d’éviter d’appuyer sur la lamelle de couverture (ce qui écrasera l’échantillon) ou de déloger la lamelle horizontalement (ce qui enduira l’échantillon).
   1. Ajouter un petit point de vernis à ongles à chaque coin d’une lamelle de couverture (~1 mm de large). Ceux-ci aideront à maintenir le bordereau de couverture en place. Laissez les points sécher complètement.
   2. Lorsque les coins sont complètement secs, scellez les bords avec du vernis à ongles. Assurez-vous que le vernis remplit complètement l’espace entre le couvercle et la lame, mais évitez de trop couvrir le bordereau de couverture de l’échantillon. Il est préférable de maintenir un chevauchement de 1 mm sur la lamelle de couverture. N’utilisez que la quantité de vernis à ongles nécessaire. Évitez d’en utiliser trop ou d’avoir un excès de vernis, ce qui peut prendre beaucoup de temps à sécher et risque d’endommager l’objectif du microscope.
      REMARQUE: Il est préférable d’utiliser du vernis à ongles coloré au lieu de transparent, ce qui facilite la visualisation de la limite du joint et aide à prévenir l’imagerie des animaux qui se trouvent sous la limite du vernis à ongles.
   3. Laissez le vernis à ongles sécher complètement avant l’imagerie. Cette étape est importante, car le vernis à ongles humide peut gravement endommager les objectifs du microscope.
      REMARQUE: Les diapositives doivent être conservées dans l’obscurité autant que possible à partir de maintenant. Utilisez une boîte en carton plate pour les couvrir pendant qu’ils sèchent sur le banc.
8. Conservez les lames dans l’obscurité à 4 °C pendant 1 à 2 semaines avant l’imagerie. Si nécessaire, conservez les lames à -20 °C pendant une plus longue durée.
9. Image utilisant la microscopie optique composée de fluorescence standard.
   1. Pour chaque lame, examinez d’abord l’échantillon entier à 10x dans le canal DAPI pour identifier les gonades bien extrudées et noter leur emplacement. Pour la plupart des applications, évitez d’imager les gonades sectionnées, incomplètes ou partiellement recouvertes par une autre partie de l’animal. Pour la plupart des animaux, un seul bras de gonade sera entièrement extrudé et visible.
      REMARQUE: Il peut être utile de prendre une image à faible grossissement à 10x de la gonade entière dans le canal DAPI pour l’utiliser pour une orientation ultérieure ou identifier l’emplacement de noyaux spécifiques.
   2. Selon l’application, les images peuvent être prises à 40x, 63x ou 100x. Si la gonade entière doit être capturée, créez un montage avec des limites qui se chevauchent. Lors de l’imagerie, rappelez-vous que la gonade est un tube creux, avec des noyaux plus denses en haut et en bas.

Résultats

Le DAPI se lie fortement à l’ADN et sa coloration est robuste même dans une grande variété de conditions (Figure 3A,B). Il doit être présent dans tous les noyaux et constitue donc un contrôle positif efficace de la présence de tout tissu de ver sur la lame et de la capacité de détecter la fluorescence au microscope. La coloration est efficace lorsque l’anticorps est présent dans les noyaux méiotiques (Figure 3A,B). Par exemple, la figure 3A,B montre des noyaux de pachytène moyen colorés avec du DAPI et un anticorps ciblant RAD-51, un marqueur des cassures double brin. KLE-2 est un composant de la condensine, un complexe protéique hautement conservé qui structure les chromosomes en préparation de la mitose et de la méiose. Les mutants kle-2/+ présentent des défauts mineurs dans la structure chromosomique, comme le montrent une coloration DAPI légèrement désordonnée et une augmentation du nombre de cassures double brin reflétée dans le nombre plus élevé de foyers RAD-51 (Figure 3B). Une erreur courante pour l’immunofluorescence est de laisser l’échantillon dans la solution fixe trop longtemps. Une fixation excessive peut entraîner une coloration infructueuse, car elle empêche généralement les anticorps de diffuser dans les noyaux. Cette erreur peut être identifiée lorsque l’anticorps est diffusé dans les régions cytoplasmiques de la gonade, mais semble être exclue des noyaux.

Dans la lignée germinale (Figure 1), les noyaux prolifèrent mitotiquement à l’extrémité distale, entrent dans la méiose pendant la zone de transition, et progressent à travers le pachytène (qui est souvent divisé en trois stades égaux par un certain nombre de rangées de noyaux) avant d’entrer dans le diplotène et enfin la diakinésie. Les ovocytes en diakinésie sont numérotés en fonction de leur proximité avec la spermathèque, l’ovocyte -1 étant le plus proche de la spermathèque, l’ovocyte -2 étant le prochain distal, et ainsi de suite. C. elegans a six chromosomes, qui se manifestent par des ovales compacts dans les noyaux de diakinésie. Chacune d’elles représente une paire homologue de deux chromatides sœurs maintenues ensemble par un chiasma, également appelé bivalent (Figure 3C). Les mutants, comme spo-11, qui perturbent la formation de croisements ne parviendront pas à former des chiasmata; par conséquent, les noyaux de diakinésie auront 12 corps DAPI distincts (également appelés univalents), un pour chaque chromatide sœur (Figure 3D).

Figure 1 : Les noyaux germinaux sont disposés d’une manière spatio-temporelle qui représente leur progression à travers la méiose. (A) Jeune adulte hermaphrodite de montage entier coloré avec DAPI. Les stades gonade et méiotique sont soulignés, de la pointe distale (astérisque) à la région proximale (l’ovocyte -1, indiqué par une flèche), qui contient la spermathèque (triangle). La barre d’échelle représente 100 μm. (B) Image de fluorescence projetée d’une gonade hermaphrodite disséquée colorée au DAPI. Les stades méiotiques sont notés, avec des noyaux représentatifs représentés dans des encarts (tous les encarts sont montrés à l’échelle les uns avec les autres). Les noyaux peuvent être facilement stadifiés en fonction de leur emplacement dans la lignée germinale et de la morphologie chromosomique caractéristique, progressant de la zone mitotique à l’extrémité distale (astérisque) à la zone de transition, en passant par le pachytène, le diplotène et la diakinésie. La spermathèque est marquée par un triangle. Cette figure a été adaptée de Hillers et al. sous licence CC BY 3.0²⁸. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Démonstration de la configuration de la dissection. (A) Stade du microscope pendant la dissection. Les animaux sont disséqués dans 4 μL de solution de dissection sur une lamelle de couverture placée sur la lame de maintien, qui est utilisée pour déplacer la lamelle de couverture vers la vue. Le diagramme montre le placement idéal de l’aiguille. Les aiguilles sont maintenues avec un bord biseauté tourné vers le bas, croisé sur la région pharyngée. Les flèches roses montrent un mouvement en forme de ciseaux pour les aiguilles. La ligne pointillée rose indique l’emplacement idéal de la coupe. (B) Images d’animaux disséqués, avec un exemple d’extrusion complète et d’extrusion incomplète. Les sections de gonades extrudées et de boyaux sont étiquetées. (C) Image illustrant l’étape de gel-fissure. La glissière doit être tenue fermement dans une main, le côté de la glissière de couverture étant tourné vers l’extérieur du corps. Le bord opposé est contreventé contre le banc. Le rasoir doit être tenu dans l’autre main. La flèche rose indique la direction du mouvement pour que le rasoir effleure la glissière, avec un léger virage tel que la lamelle de couverture s’éloigne du corps. Notez que la lamelle de couverture a été placée de telle sorte qu’un coin pend au-dessus du long bord de la glissière. (D) Image de l’installation pour la pratique de la dissection dans une boîte de coloration d’embryon de verre. Les animaux sont placés dans 50 à 200 μL de solution de dissection, ce qui élimine le problème de l’évaporation et prolonge le temps de dissection. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Résultats de fluorescence représentatifs des noyaux germinaux. (A,B) projections Z-stack de noyaux de pachytène tardif colorés avec l’anticorps RAD-51 (vert) et DAPI (rouge) chez (A) les hétérozygotes de type sauvage et (B) kle-2/+. (C, D) Projections Z-stack d’un seul noyau de diakinésie coloré avec DAPI dans (C) de type sauvage (avec six corps colorants DAPI) et (D) de mutants spo-11 (avec 12 corps colorants DAPI). Les barres d’échelle représentent 5 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

La reproduction sexuée nécessite la création de gamètes haploïdes, qui sont produits via la division cellulaire spécialisée de la méiose. C. elegans est devenu un modèle populaire pour l’étude cytologique de la méiose en raison de sa transparence optique, de son anatomie germinale pratique et de sa génétique puissante²⁸. Des expériences simples sur des organismes évaluant la fertilité et la létalité embryonnaire peuvent être combinées à la génétique moléculaire pour répondre à de nombreuses questions en laboratoire ou en classe. Par exemple, parce que les croisements sont essentiels pour une bonne ségrégation chromosomique, les processus qui perturbent leur formation ou leur résolution généreront des gamètes aneuploïdes. À son tour, l’aneuploïdie conduit à une descendance non viable, qui peut facilement être évaluée en comptant la descendance, ou par la méthode légèrement plus compliquée de détermination de la létalité embryonnaire. Cytologiquement, un manque de croisements affectera le nombre de corps colorants DAPI observés pendant la diakinésie. La robustesse de la coloration DAPI et la facilité de notation en font une expérience idéale pour enseigner les techniques cytologiques. La disposition temporelle et spatiale des noyaux dans la lignée germinale hermaphrodite fournit un instantané de chaque stade de la méiose à un moment donné. Les noyaux prennent environ 54 heures pour passer de l’extrémité mitotique distale de la lignée germinale à l’extrémité proximale (par exemple, voir Jaramillo-Lambert et al.33, Stamper et al.34 et Libuda et ^al.35). Ce calendrier bien établi des progrès méiotiques permet de marquer la chasse au pouls ou d’endommager l’ADN.

Parce que la coloration DAPI fonctionne presque toujours, elle sert de contrôle technique utile pour la microscopie à fluorescence (et peut fournir satisfaction aux microscopistes en formation). La coloration des anticorps peut être plus variable et constitue une bonne mesure de la reproductibilité entre les réplications. Les gonades de C. elegans peuvent être difficiles à réparer de manière cohérente, car cette étape nécessite un équilibre entre la préservation de la structure chromosomique tout en permettant une diffusion suffisante des anticorps. La fixation avec du formaldéhyde préserve au mieux la morphologie chromosomique, et la préparation de formaldéhyde frais à partir d’ampoules de paraformaldéhyde a fourni les résultats les plus reproductibles. Il est également possible d’utiliser du formaldéhyde préparé à partir de formol (37% de formaldéhyde aqueux et de méthanol). La force de fixation et le moment de la fixation peuvent devoir être déterminés empiriquement pour chaque anticorps. D’autres méthodes consistent à sauter la fixation du formaldéhyde à l’étape 2.4 et, après le lyophilisation, l’immersion dans de l’éthanol à 100 % à -20 °C ou l’immersion dans du méthanol à 100 % pendant 10 minutes suivie d’une immersion dans l’acétone à 100 % pendant 10 minutes à -20 °C. Ces conditions fixes permettent une meilleure pénétration des anticorps mais affecteront négativement la morphologie des tissus (les chromosomes auront l’air soufflés et gonflés).

Le timing est très important pour la dissection et les étapes de correction décrites à l’étape 2. Parce que le volume de la solution de dissection est si petit, l’évaporation peut avoir un impact sur la concentration finale fixée, ce qui entraînera une coloration variable des anticorps. Un manipulateur expérimenté de C. elegans peut préparer une lame en moins de 2 minutes depuis le début (étape 2.3) pour la corriger (étape 2.4). Le principal obstacle technique est la capacité de prélever des animaux dans la goutte de solution de dissection et de les disséquer rapidement. Il peut être plus facile d’apprendre à disséquer dans de plus grands volumes. Les nouveaux stagiaires commencent d’abord par prélever des animaux dans 50 à 200 μL de solution de dissection dans une boîte de coloration d’embryons en verre (figure 2D); La surface plus large offre plus de marge de manœuvre lors de l’identification d’une position d’aiguille idéale pour de bonnes extrusions de gonades, tandis que le plus grand volume de liquide rend l’évaporation moins problématique. Une fois à l’aise avec les mouvements de dissection, les stagiaires commencent à disséquer en utilisant seulement 50 μL dans le plat, puis passent à la dissection en 20 μL sur une lame. Une fois disséqués sur des lames, les stagiaires peuvent rapidement commencer à réduire la quantité de solution jusqu’à ce qu’ils soient assez rapides pour travailler dans 4 μL pour rendre l’évaporation négligeable.

Si le moment de la dissection demeure un problème, les stagiaires peuvent disséquer 8 μL de la solution de dissection à l’étape 2.3. Ensuite, à l’étape 2.4, ils peuvent ajouter 8 μL de la solution fixée, pipeter doucement pour bien mélanger (en surveillant attentivement pour s’assurer que les carcasses ne sont pas perturbées ou emportées) et retirer 8 μL de la solution mélangée. Cette autre approche donnera le même volume final de 8 μL et la même concentration finale fixée; Ce volume est important pour s’assurer que les carcasses entrent en contact avec la glissière et la surface de la glissière pendant la fissure de congélation à l’étape 2.5. Si le moment de la préparation de chaque lame reste un problème même dans des volumes de dissection plus importants, une méthode de suspension pour le protocole d’immunofluorescence germinale est décrite par Gervaise et Arur²⁶.

La principale limite de l’utilisation de l’immunofluorescence pour visualiser des protéines in situ est la disponibilité d’anticorps primaires ciblant une protéine d’intérêt particulière. Cependant, si une version marquée de la protéine a été conçue, ce protocole peut être adapté pour visualiser l’étiquette protéique. Les anticorps ciblant les marqueurs courants, tels que FLAG, HA ou GFP, sont couramment disponibles. Les marqueurs fluorescents comme la GFP peuvent souvent être éteints par des étapes de fixation, il est donc recommandé d’utiliser un anticorps primaire ciblant la GFP, plutôt que de compter sur le signal de fluorescence natif lui-même. Une autre limite de ce protocole est qu’il capture la lignée germinale dans un délai unique (bien que toutes les étapes de l’oogenèse soient représentées dans la lignée germinale). Par conséquent, cette technique peut manquer les changements dynamiques qui peuvent se produire au fur et à mesure qu’un ovocyte progresse dans l’oogenèse. Cependant, le moment de la gamétogenèse a été bien étudié chez C. elegans; Chez un jeune adulte de type sauvage, un ovocyte met environ 60 h pour progresser de l’extrémité distale de la lignée germinale (la zone mitotique) à la diakinésie³³. Par conséquent, une poursuite de pouls ou une intervention spécifique comme l’irradiation suivie d’un parcours temporel permettrait d’observer les effets à différents stades de la méiose.

En conclusion, ce protocole décrit la dissection de la gonade de C. elegans suivie d’une coloration DAPI et d’anticorps pour la microscopie à fluorescence. La dissection et la fixation (étape 2) prennent de 60 à 90 minutes, selon le nombre de lames générées. La coloration des anticorps (étape 3) est généralement sans intervention et peut aller de 7 h au moins à 1,5 jour, selon les temps d’incubation des anticorps. Le montage (étapes 4.1-4.7) prend environ 15 min. Cette approche générale de visualisation des chromosomes germinaux et de la gonade peut être utilisée pour des études cytologiques de n’importe quelle protéine s’il existe un anticorps ou un réactif de marquage fluorescent. Dans sa forme la plus simple, la coloration DAPI des noyaux de diakinésie peut être utilisée pour dépister les facteurs affectant la recombinaison méiotique. Lorsqu’elle est associée à des analyses d’organismes du nombre de descendances, de l’incidence des mâles (phénotype Him) et de la létalité embryonnaire, cette approche cytologique fournit un contrepoint unicellulaire aux analyses basées sur la population.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG Secondary Anticorps	Molecular Sobes	711-545-152
Bloc chauffant/rafraîchissant en aluminium	Millipore Sigma	Z743497
Bacto Peptone	Gibco	DF0118 17 0
Verre borosilicaté Pipettes Pasteur, jetables, 5,75 pouces	Fisherbrand	13 678 20B	Utilisé pour fabriquer des pics à vis sans fin
BSA, Albumine sérique bovine	VWR	97061 420
C. elegans type sauvage (ancestral)	Caenorhabditis Centre de génétique	N2 (ancestral)
C. elegans kle-2 (ok1151) mutants	Caenorhabditis Centre de génétique	VC768	Le génotype complet de cette souche est : kle-2(ok1151) III/hT2 [bli-4(e937) let- ?( q782) qIs48] (I ;III). Il a kle-2 équilibré avec un chromosome équilibreur marqué par une GFP pharangeale. Choisissez des animaux non verts pour identifier les mutants homozygotes kle-2.
C. elegans spo-11 (me44) mutants	Caenorhabditis Genetics Center	TY4342	Le génotype complet de cette souche est le suivant : spo-11(me44)  ; IV / nT1[qIs51] (IV :V). Il a spo-11 équilibré avec un chromosome équilibreur marqué par une GFP pharangeale. Choisissez des animaux non verts pour identifier les mutants homozygotes spo-11.
Chlorure de calcium anhydre	VWR	97062 590
Cholestérol	Sigma Aldrich	501848300
DAPI	Life Technologies	D1306
EDTA, sel disodium dihydraté	Apex Bioresearch Products	20 147
Embryon Plat, verre, cavité de 30 mm	Services de microscopie électronique	100492-980	Utilisé pour pratiquer la dissection ; le verre est préféré car les animaux disséqués peuvent coller au plastique
Escherichia coli	Caenorhabditis Centre de génétique	OP50
Récipient de stockage des aliments, plastique	divers	n/a	Récipients en plastique avec (1) fonds relativement plats, pour permettre aux lames de se reposer au niveau ; (2) les couvercles qui sont hermétiques, mais qui peuvent toujours être facilement retirés sans perturber le contenu du récipient, et (3) mesurent environ 9 pouces de long sur 6 pouces de large sont préférés
Pot en verre Coplin	DWK Life Sciences  ; Wheaton	08-813E
Barrière hydrophobe Stylo PAP	ImmEdge	NC9545623
Kimwipes	Kimtech Science	06 666A
Chlorhydrate de lévamisole	Sigma Aldrich	L0380000
Sulfate de magnésium anhydre	Fisher Chemical	M65 500
Aiguilles, à usage unique, 25 g	BD PrecisionGlide	14 821 13D	bleu, 1 pouce
NGM Agar, granulé	Apex Bioresearch Products	20 249NGM
Parafilm	Bemis	16 101
Paraformaldéhyde (16 % p/v) Solution aqueuse	Microscopie électronique Sciences	50 980 487
PBS, solution saline tamponnée au phosphate (solution 10x)	Fisher BioReagents	BP399500
boîtes de Pétri, 60 mm	Tritech Research	NC9321999	non ventilé à arêtes vives
(90 % platine, 10 % iridium)	Tritech Research	PT 9010	Utilisé pour fabriquer des pics à vers de terre
Chlorure de potassium	Fisher	BP366-500
Phosphate de potassium Dibasic	VWR BDH Chemicals	BDH9266 500G
Phosphate de potassium Monobasique	VWR BDH Chemicals	BDH9268 500G
Lunettes de protection haut de gamme 18 mm x 18 mm	Fisherbrand	12-548-AP	0.13&ndash ; Lames de rasoir de 0,17 mm d’épaisseur
, simple tranchant	VWR	55411 055
SlowFade Gold Antifade Mountant	Molecular	S36937	Alternatives : VectaShield Antifade Mounting Medium (Vector Laboratories, H-1000-10) ou ProLong Diamond Antifade (Thermo Fisher Scientific, P36970). Si vous utilisez ProLong Diamond, aucun vernis à ongles n’est nécessaire pour l’étanchéité, mais les lames doivent durcir pendant 24 heures avant l’imagerie.
Azoture de sodium	Fisher BioReagents	BP922I 500
Chlorure	de sodium Fisher Chemical	S271 500
Phosphate de sodium dibasique anhydre	Sigma Aldrich	7558 79 4
Phosphate de sodium dibasique Heptahydraté	Sigma Aldrich	S9390
Boîte en polystyrène	divers	n/a	Dimensions approximatives de l’intérieur : 12 pouces de long, 9 pouces de large, 8 pouces de profondeur
Lames de microscope Superfrost Plus	Fisherbrand	22 037 246
Triton X-100	Fisher BioReagents	BP151 500
Tryptone	Apex Bioresearch Products	20 251
Tween 20	Fisher Chemical	BP337 500
Extrait de levure	Apex Produits de biorecherche	20 254