Séparation des sous-populations de cellules immunitaires dans les échantillons de sang périphérique des enfants atteints de mononucléose infectieuse

Résumé

Nous décrivons une méthode combinant des billes immunomagnétiques et le tri cellulaire activé par fluorescence pour isoler et analyser des sous-populations de cellules immunitaires définies de cellules mononucléaires du sang périphérique (monocytes, lymphocytes T CD4+, lymphocytes T CD8⁺, lymphocytes B et cellules tueuses naturelles). En utilisant cette méthode, les cellules marquées magnétiquement et par fluorescence peuvent être purifiées et analysées.

Résumé

La mononucléose infectieuse (MI) est un syndrome aigu principalement associé à une infection primaire par le virus d’Epstein-Barr (EBV). Les principaux symptômes cliniques comprennent une fièvre irrégulière, une lymphadénopathie et une augmentation significative des lymphocytes dans le sang périphérique. Le mécanisme pathogène de la MI n’est pas encore clair; Il n’existe pas de méthode de traitement efficace, principalement des thérapies symptomatiques. La principale question en immunobiologie du VEB est de savoir pourquoi seul un petit sous-ensemble d’individus infectés présente des symptômes cliniques graves et développe même des tumeurs malignes associées au VEB, alors que la plupart des individus sont asymptomatiques à vie avec le virus.

Les lymphocytes B sont d’abord impliqués dans la MI parce que les récepteurs EBV sont présentés à leur surface. Les cellules tueuses naturelles (NK) sont des lymphocytes innés cytotoxiques qui sont importants pour tuer les cellules infectées par le VEB. La proportion de lymphocytes T CD4+ diminue tandis que celle des lymphocytes T CD8+ augmente considérablement pendant l’infection aiguë par le VEB, et la persistance des lymphocytes T CD8⁺ est importante pour le contrôle à vie de la MI. Ces cellules immunitaires jouent un rôle important dans la MI et leurs fonctions doivent être identifiées séparément. À cette fin, les monocytes sont d’abord séparés des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) des individus IM à l’aide de microbilles CD14, d’une colonne et d’un séparateur magnétique.

Les autres PBMC sont colorés avec de la péridinine-chlorophylle-protéine (PerCP)/cyanine 5.5 anti-CD3, de l’allophycocyanine (APC)/cyanine 7 anti-CD4, de la phycoérythrine (PE) anti-CD8, de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) anti-CD19, de l’APC anti-CD56 et des anticorps APC anti-CD16 pour trier les lymphocytes T CD4+, les lymphocytes T CD8⁺, les lymphocytes B et les lymphocytes NK à l’aide d’un cytomètre en flux. De plus, le séquençage du transcriptome de cinq sous-populations a été effectué pour explorer leurs fonctions et leurs mécanismes pathogènes dans la MI.

Introduction

Le virus d’Epstein-Barr (EBV), un γ-herpèsvirus également connu sous le nom de virus de l’herpès humain de type 4, est omniprésent dans la population humaine et établit une infection latente à vie chez plus de 90% de la population adulte¹. La plupart des infections primaires par le VEB surviennent pendant l’enfance et l’adolescence, avec une fraction des patients se manifestant par une mononucléose infectieuse (IM)², présentant une immunopathologie caractéristique, y compris une réponse immunitaire activée avec des lymphocytes T CD8⁺ dans le sang et une prolifération transitoire de cellules B infectées par le ....

Protocole

Des échantillons de sang ont été prélevés chez des patients atteints d’IM (n = 3), des porteurs sains du VEB (n = 3) et des enfants non infectés par le VEB (n = 3). Des volontaires ont été recrutés à l’hôpital pour enfants de Pékin, à la Capital Medical University, et toutes les études ont été approuvées sur le plan éthique. L’approbation éthique a été obtenue par le Comité d’éthique de l’Hôpital pour enfants de Beijing, Capital Medical University (Numéro d’approbation : [2021]-E-056-Y). Le consentement éclairé des patients a été levé car l’étude n’a utilisé que les échantillons restants pour les essais cliniques. Toutes les données ont été entièrement anonymisées et ....

Résultats

Référence de la stratégie d’établissement de points de contrôle
La stratégie de contrôle utilisée pour trier les quatre sous-populations de lymphocytes est illustrée à la figure 1. Brièvement, les lymphocytes sont sélectionnés (P1) sur un graphique à points montrant la granulosité (SSC-A) en fonction de la taille (FSC-A). Ensuite, les cellules simples sont sélectionnées (P2) sur un graphique à points montrant la taille (FSC-A) par rapport à la diffusion vers l’avant (FSC-.......

Discussion

Ce protocole représente un moyen efficace de trier les sous-populations de cellules immunitaires du sang périphérique. Dans cette étude, des échantillons de sang veineux provenant de patients atteints de MI, de porteurs sains du VEB et d’enfants non infectés par le VEB ont été choisis comme objectif de recherche. Ce travail utilisant le sang périphérique de patients IM se concentre principalement sur l’analyse et la détermination des proportions de différents sous-ensembles cellulaires grâce à la cytométrie en flux multi.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
APC anti-humain CD16	Biolegend	302012	Anticorps fluorescent
APC anti-humain CD56 (NCAM)	Biolegend	362504	Anticorps fluorescents  ;
APC/Cyanine7 anti-CD4 humain	Biolegend	344616	Anticorps fluorescents  ;
Compteur de cellules automatisé	BIO RAD	TC20	Comptage de cellules
BD FACSAria activé par fluorescence  ; flux  ; cellulaire  ; trieur-cytomètre (BD FACSAria II)	Becton, Dickinson and Company	644832	Tri cellulaire
CD14 Microbilles humaines	Miltenyi Biotec	130-050-201	microbilles
Lames de cellules CTNG	BIO RAD	1450016	Numération cellulaire
Tubes à centrifuger	Falcon	35209715	15 mL tube à centrifuger
EDTA (&ge ; 99 %, BioPremium)	Beyotime	ST1303	EDTA
Tubes anticoagulants à l’acide éthylènediamine tétraacétique (EDTA)	Becton, Dickinson and Company	; 367862	Tubes anticoagulants EDTA
FITC anti-humain CD19	Biolegend	302206	Anticorps fluorescents  ;
Gibco Sérum fœtal bovin	Thermo Fisher Scientific	16000-044	Sérum fœtal bovin&
nbsp ; Haute vitesse  ; centrifugeuse	Sigma	;	Centrifugation à cellules 3K15 pour tube de centrifugation de 15 mL
Haute vitesse  ; centrifugeuse	Eppendorf	5424R	Centrifugation cellulaire pour tube Eppendorf (EP) de 1,5 mL
Milieu de séparation des lymphocytes humains	Dakewe	DKW-KLSH-0100	Ficoll-Paque
LS  ; Séparation  ; colonnes	Miltenyi Biotec	130-042-401	Séparation  ; colonnes
Tubes de microcentrifugation	Axygen	MCT-150-C	Tube de microcentrifugation de 1,5 mL
Séparateur MidiMACS	Miltenyi Biotec	130-042-302	Séparateur de billes magnétiques
PE anti-humain CD8	Biolegend	344706	Anticorps fluorescent
PerCP/Cyanine5.5 anti-CD3 humain	Biolegend	344808	Anticorps fluorescents  ;
Saline tamponnée au phosphate (PBS)	BI	02-024-1ACS	Tubes
à fond rond en polystyrène	Tube	5 mL Falcon 352235 pour cytomètre en flux
FACS Réactif TRIzol Cellules	Ambion	15596024	Lyse pour l’extraction de l’ARN
Trypan Blue Staining Kit de dosage de la viabilité cellulaire	Beyotime	C0011	Trypan Blue Staining