Évaluation de la transcytose intestinale d’isolats néonatals de bactériémie à Escherichia coli

Résumé

Escherichia coli provoque une septicémie chez les nouveau-nés qui ingèrent la bactérie au moment de la naissance. Le processus impliqué dans la capacité d’E. coli à se déplacer des voies entériques à la circulation sanguine est mal compris. Ce modèle in vitro évalue la capacité des souches d’E. coli à traverser les cellules épithéliales intestinales.

Résumé

Les nouveau-nés ingèrent des souches maternelles d’E. coli qui colonisent leur tractus intestinal au moment de l’accouchement. Les souches d’E. coli capables de se déplacer dans l’intestin envahissent la circulation sanguine du nouveau-né, provoquant une bactériémie potentiellement mortelle. La méthodologie présentée ici utilise des cellules épithéliales intestinales polarisées cultivées sur des inserts semi-perméables pour évaluer la transcytose d’isolats néonatals de bactériémie à E. coli in vitro. Cette méthode utilise la lignée cellulaire intestinale T84 établie qui a la capacité de se développer jusqu’à la confluence et de former des jonctions serrées et des desmosomes. Après avoir atteint la confluence, les monocouches T84 matures développent une résistance transépithéliale (TEER), qui peut être quantifiée à l’aide d’un voltmètre. Les valeurs TEER sont inversement corrélées avec la perméabilité paracellulaire des composants extracellulaires, y compris les bactéries, à travers la monocouche intestinale. Le passage transcellulaire des bactéries (transcytose), en revanche, ne modifie pas nécessairement les mesures TEER. Dans ce modèle, le passage bactérien à travers la monocouche intestinale est quantifié jusqu’à 6 heures après l’infection, et des mesures répétées de TEER sont effectuées pour surveiller la perméabilité paracellulaire. En outre, cette méthode facilite l’utilisation de techniques telles que l’immunomarquage pour étudier les changements structurels dans les jonctions serrées et d’autres protéines d’adhésion de cellule à cellule au cours de la transcytose bactérienne à travers l’épithélium polarisé. L’utilisation de ce modèle contribue à la caractérisation des mécanismes par lesquels E. coli néonatal transcytose à travers l’épithélium intestinal pour produire une bactériémie.

Introduction

Escherichia coli est la cause la plus fréquente de septicémie précoce chez les nouveau-nés ^1,2,3. Le taux de mortalité de la bactériémie néonatale à E. coli peut atteindre 40 %, et la méningite est une complication possible associée à de graves troubles neurodéveloppementaux². L’ingestion de souches maternelles d’E. coli par le nouveau-né peut produire une bactériémie néonatale; Ce processus a été reproduit dans les modèles animaux ^2,4. Une fois ingérées, les bactérie....

Protocole

REMARQUE : Effectuer toutes les manipulations des cellules, bactéries, plaques et réactifs T84 dans une enceinte de sécurité de niveau de biosécurité 2 (BSL-2) pour éviter toute contamination. Utilisez des zones et des incubateurs séparés pour tous les travaux impliquant des cellules T84 stériles, des cellules T84 infectées et E. coli. Les isolats cliniques d’E. coli testés selon les méthodes décrites ici ont été obtenus conformément aux lignes directrices du comité d’examen institutionnel de notre établissement ^1,16.

1. Préparation des inserts de transcytose....

Résultats

Figure 1 : T84 TEER au fil du temps. Au fur et à mesure que la couche cellulaire T84 mûrit sur l’insert, la résistance électrique de la monocouche augmente. À un TEER d’au moins 1 000 Ω·^cm2, la couche cellulaire est suffisamment développée pour diminuer le transport bactérien paracellulaire et permettre la mesure du transit bactérien prin.......

Discussion

Cette méthode est dérivée des techniques utilisées en gastroentérologie et en maladies infectieuses²⁰. Des modèles in vitro de la barrière épithéliale intestinale ont été utilisés pour élucider les mécanismes par lesquels le contenu luminal interagit avec cette composante pertinente de l’immunité innée ^6,8. Les interactions hôte-pathogène de la bactérie invasive à E. coli néonatale ont également été caractérisées séparéme.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
10 000 U/mL Mélange pénicilline/streptomycine	Fisher Scientific	15-140-122
15 mL Tubes coniques stériles	MidSci	C15B
Tubes microcentrifuges de 2 mL	Avant	AVSS2000
50 mL Tubes coniques stériles en polypropylène	Falcon	352070
Aspirateur	Corning	4930
Armoires de biosécurité	Labconco	30441010028343	Trois d’entre eux sont utilisés dans la méthode : un pour le travail sur les tissus stériles, un pour le travail sur les tissus infectés et un pour le travail bactérien.
Centrifugeuse	Sorvall	Legend RT
Boucles d’inoculation jetables	Fisherbrand	22363605
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965-084
Épithélial Volt/ohm Meter	World Precision Instruments	EVOM2
Sérum fœtal bovin	Fisher	Scientific 10437028
Mélange de nutriments Ham F-12	Gibco	11765-047
Hémacytomètre	Sigma Aldrich, Bright Line	Z359629
Agitateur d’incubateur	Nouveau-Brunswick	Innova 4080
Incubateurs	Thermo Scientific	51030284	Trois d’entre eux sont utilisés dans la méthode : un pour la culture de tissus stériles, un pour la culture de tissus infectés et un pour l’incubation bactérienne.
Bouillon de lysogénie	Difco	244610
Gélose au bouillon de lysogénie	IBI Scientific	IB49101
Microscope Nikon Eclipse TS2R
Unico		1100RS
T84 Cellules intestinales	American Tissue Culture Collection	CCL248
Inserts de culture tissulaire, avec membrane en polyéthylène tréphtalate, 3 & micro ; m pores,  ;	Falcon	353096
Plaque de culture tissulaire 24 puits, Falcon		353504
Trypan bleu colorant	Fisher Scientific	T10282

Spectrophotomètre Nikon