Article de méthode

Optimisation ATAC-Seq pour la recherche en épigénétique du cancer

DOI :

10.3791/64242

⸱

30 juin 2022

 ,  ,  ,  , 
1University of North Dakota School of Medicine and Health Sciences, 2Dana-Farber Cancer Institute

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ATAC-seq est une méthode de séquençage de l’ADN qui utilise la transposase mutante hyperactive, Tn5, pour cartographier les changements dans l’accessibilité de la chromatine médiés par des facteurs de transcription. ATAC-seq permet la découverte des mécanismes moléculaires sous-jacents aux altérations phénotypiques dans les cellules cancéreuses. Ce protocole décrit les procédures d’optimisation pour ATAC-seq dans les types de cellules épithéliales, y compris les cellules cancéreuses.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le test de chromatine accessible à la transposase avec séquençage à haut débit (ATAC-seq) sonde l’accessibilité de l’acide désoxyribonucléique (ADN) à l’aide de la transposase Tn5 hyperactive. Tn5 coupe et ligature les adaptateurs pour un séquençage à haut débit dans les régions de chromatine accessibles. Dans les cellules eucaryotes, l’ADN génomique est emballé dans la chromatine, un complexe d’ADN, d’histones et d’autres protéines, qui agit comme une barrière physique à la machinerie transcriptionnelle. En réponse aux signaux extrinsèques, les facteurs de transcription recrutent des complexes de remodelage de la chromatine pour permettre l’accès à la machinerie transcriptionnelle pour l’activation des gènes. Par conséquent, l’identification des régions ouvertes de la chromatine est utile lors de la surveillance des activités des amplificateurs et des promoteurs de gènes lors d’événements biologiques tels que la progression du cancer. Étant donné que ce protocole est facile à utiliser et nécessite peu d’entrée cellulaire, ATAC-seq a été largement adopté pour définir des régions de chromatine ouvertes dans divers types de cellules, y compris les cellules cancéreuses. Pour une acquisition de données réussie, plusieurs paramètres doivent être pris en compte lors de la préparation des bibliothèques ATAC-seq. Parmi eux, le choix du tampon de lyse cellulaire, le titrage de l’enzyme Tn5 et le volume de départ des cellules sont cruciaux pour la préparation de la bibliothèque ATAC-seq dans les cellules cancéreuses. L’optimisation est essentielle pour générer des données de haute qualité. Ici, nous fournissons une description détaillée des méthodes d’optimisation ATAC-seq pour les types de cellules épithéliales.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’accessibilité de la chromatine est une exigence clé pour la régulation de l’expression génique à l’échelle du génome1. Les changements dans l’accessibilité de la chromatine sont fréquemment associés à plusieurs états pathologiques, y compris le cancer 2,3,4. Au fil des ans, de nombreuses techniques ont été développées pour permettre aux chercheurs de sonder le paysage de la chromatine en cartographiant les régions d’accessibilité de la chromatine. Certains d’entre eux incluent DNase-seq (DNase I hypersensitive sites sequencing)5, FAIRE-seq (formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements)6, MAPit (methyltransferase accessibility protocol for individual templates)7, et l’objet de cet article, ATAC-seq (assay for transposase-accessible chromatin)8. DNase-seq cartographie les régions accessibles en utilisant une caractéristique clé de DNase, à savoir la digestion préférentielle de l’ADN nu exempt d’histones et d’autres protéines telles que les facteurs de transcription5. FAIRE-seq, similaire à ChIP-seq, utilise la réticulation et la sonication du formaldéhyde, sauf qu’aucune immunoprécipitation n’est impliquée, et les régions exemptes de nucléosomes sont isolées par extraction phénol-chloroforme6. La méthode MAPit utilise une méthyltransférase GC pour sonder la structure de la chromatine à une résolutionde 7 molécule unique. ATAC-seq s’appuie sur la transposase hyperactive, Tn58. La transposase Tn5 se lie préférentiellement aux régions de chromatine ouvertes et insère des adaptateurs de séquençage dans les régions accessibles. Tn5 fonctionne par un mécanisme de « copier-coller » médié par l’ADN, par lequel la transposase préchargée avec des adaptateurs se lie aux sites de chromatine ouverts, coupe l’ADN et ligature les adaptateurs8. Les régions liées à Tn5 sont récupérées par amplification PCR à l’aide d’amorces qui recuisent ces adaptateurs. FAIRE-seq et DNase-seq nécessitent une grande quantité de matériel de départ (~100 000 cellules à 225 000 cellules) et une étape de préparation de bibliothèque séparée avant le séquençage9. D’autre part, le protocole ATAC-seq est relativement simple et nécessite un petit nombre de cellules (<50 000 cellules)10. Contrairement aux techniques FAIRE-seq et DNase-seq, la préparation de la bibliothèque de séquençage d’ATAC-seq est relativement facile, car l’échantillon d’ADN isolé est déjà étiqueté avec les adaptateurs de séquençage par Tn5. Par conséquent, seule l’étape d’amplification PCR avec les amorces appropriées est nécessaire pour terminer la préparation de la bibliothèque, et les étapes de traitement préalables telles que la réparation finale et la ligature de l’adaptateur ne doivent pas être effectuées, ce qui permet de gagner du temps11. Deuxièmement, ATAC-seq évite le besoin de conversion, de clonage et d’amplification du bisulfite avec des amorces spécifiques à la région requises pour MAPit7. En raison de ces avantages, ATAC-seq est devenu une méthode extrêmement populaire pour définir des régions de chromatine ouvertes. Bien que la méthode ATAC-seq soit simple, plusieurs étapes nécessitent une optimisation pour obtenir des données de haute qualité et reproductibles. Ce manuscrit traite des procédures d’optimisation pour la préparation de bibliothèques ATAC-seq standard, en mettant particulièrement l’accent sur trois paramètres: (1) la composition du tampon de lyse, (2) la concentration de la transposase Tn5 et (3) le nombre de cellules. En outre, cet article fournit des exemples de données sur les conditions d’optimisation utilisant des cellules épithéliales adhérentes cancéreuses et non cancéreuses.

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Protocole

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1. Préparatifs avant de commencer l’expérience

  1. Préparer le stock tampon de lyse.
    REMARQUE: Le tampon d’isolation nucléaire optimal peut être différent pour chaque type de cellule. Nous recommandons de tester à la fois le tampon hypotonique utilisé dans l’article original8 et un tampon CSK12,13 pour chaque type de cellule en utilisant une coloration au bleu trypan.
    1. Pour préparer un tampon hypotonique (tampon Greenleaf), mélanger 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 et 0,1% NP-40.
    2. Pour préparer le tampon CSK, mélanger 10 mM de PIPES pH 6,8, 100 mM de NaCl, 300 mM de saccharose, 3 mM de MgCl2 et 0,1% de Triton X-100.
  2. S’assurer que les conditions de culture cellulaire sont optimales; Examinez les cellules au microscope optique pour vous assurer qu’il n’y a pas de niveaux élevés d’apoptose.
  3. Allumez la centrifugeuse pour la laisser atteindre 4 °C.

2. Récolte de cellules

  1. Aspirer les milieux à partir d’une culture de cellules à <80% de confluence. Les cellules sont généralement cultivées dans une boîte de 35 mm ou 60 mm, en fonction du nombre de cellules nécessaires, des traitements, etc.
  2. Lavez les cellules avec 1 mL ou 3 mL de PBS.
  3. Ajouter 0,5 mL ou 1 mL de trypsine et incuber pendant 2-3 min (selon les types de cellules). Utilisez soigneusement une pipette de 1 mL pour bien mélanger.
  4. Ajouter 1 mL ou 2 mL de média dans la plaque et bien mélanger. Transvaser dans un tube conique de 15 mL. Centrifuger les cellules dans un tube de 15 mL pendant 3 min à 300 x g.
    REMARQUE: Un rotor de godet oscillant est recommandé pour minimiser la perte de cellule.
  5. Aspirer le média et remettre les cellules en suspension dans 1 mL ou 2 mL de milieu.
    REMARQUE: Il est essentiel de préparer une solution unicellulaire homogène. Pour les tissus, un homogénéisateur Dounce peut être utilisé pour homogénéiser les tissus et minimiser les amas ou agrégats de grandes cellules. Certains tissus nécessitent une filtration (p. ex. crépines cellulaires) et/ou un tri cellulaire FACS pour isoler les cellules viables et obtenir une solution unicellulaire.
  6. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules.
    REMARQUE : Dans cette étude, un compteur de cellules automatisé (Tableau des matériaux) a été utilisé.
  7. Centrifuger le volume de cellules requis (p. ex., un volume contenant 1 x 106 cellules en fonction du nombre de cellules) à 300 x g pendant 3 min à température ambiante (RT).
  8. Remettez en suspension la pastille de cellule contenant 1 x 106 cellules dans 1 mL de PBS froid.
    REMARQUE: Si le nombre de cellules est inférieur à 1 x 10 6 cellules, diminuer le volume de PBS froid pour préparer la solution cellulaire à la même concentration (1 x 106 cellules / mL).

3. Lyse cellulaire

  1. Transférer 25 μL (= 2,5 x 104 cellules) dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,7 mL. Centrifuger pendant 5 min à 500 x g à 4 °C et jeter soigneusement le surnageant
    REMARQUE: Un rotor de godet oscillant est recommandé pour minimiser la perte de cellule. Laissez environ 3 μL de surnageant pour vous assurer que les cellules ne sont pas jetées.
  2. Ajouter 25 μL de tampon de lyse et remettre les cellules en suspension en faisant un pipetage doux de haut en bas. Incuber sur glace pendant 5 min
  3. Centrifuger pendant 5 min à 500 x g à 4 °C et jeter soigneusement le surnageant.
    REMARQUE: Un rotor de godet oscillant est recommandé pour minimiser la perte de cellule. Laissez environ 3 μL de surnageant pour vous assurer que les cellules ne sont pas jetées.

4. Étiquetage Tn5

  1. Remettez immédiatement la pastille en suspension dans 25 μL de mélange réactionnel Tn5. Le mélange réactionnel Tn5 est le suivant : 12,5 μL de tampon ADN de tagmentation 2x (tampon TD), 1,25-5 μL de transposase Tn5 et 11,25-7,5 μL d’eau exempte de nucléase.
    NOTE: La concentration standard de Tn5 est de 2,5 μL pour 2,5 x 104 cellules.
  2. Incuber pendant 30 min à 37 °C.
    REMARQUE: Mélanger la solution toutes les 10 minutes.

5. Purification de l’ADN

NOTE: Une purification est nécessaire avant l’amplification. La purification de l’ADN est effectuée à l’aide du kit de purification MinElute PCR (Table of Materials).

  1. Ajouter 5 μL d’acétate de sodium 3 M (pH 5,2).
  2. Ajouter immédiatement 125 μL de Buffer PB et bien mélanger.
  3. Suivez le protocole du kit de purification PCR à partir de l’étape 2.
    1. Placer la colonne d’essorage dans un tube de prélèvement de 2 mL.
    2. Appliquer l’échantillon sur la colonne de spin et centrifuger pendant 1 min à 17 900 x g à TA.
    3. Jetez l’écoulement continu et replacez la colonne de rotation dans le même tube de collecte.
    4. Ajouter 750 μL de Buffer PE à la colonne de spin et centrifuger pendant 1 min à 17 900 x g à TA.
    5. Jetez l’écoulement continu et replacez la colonne de rotation dans le même tube de collecte.
    6. Centrifuger la colonne de spin pendant 5 min pour sécher complètement la membrane.
    7. Jeter l’écoulement continu et placer la colonne d’essorage dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,7 mL.
    8. Éluer les fragments d’ADN avec 10 μL de Buffer EB.
    9. Laissez la colonne reposer pendant 1 min à RT.
    10. Centrifuger pendant 1 min à 17 900 x g à RT pour éluer l’ADN.

6. Amplification PCR

REMARQUE: L’amplification par PCR de l’ADN transposé (marqué) est nécessaire pour le séquençage. Les adaptateurs de kit Nextera (Table of Materials) ont été utilisés dans cet exemple. Les amorces utilisées dans cette étude sont énumérées au tableau 1.

  1. Mettre en place la réaction PCR suivante dans des tubes PCR de 200 μL (50 μL pour chaque échantillon). Le mélange réactionnel PCR est le suivant : 10 μL d’ADN élué (étape 5.), 2,5 μL d’Adaptateur 25 mM 1, 2,5 μL d’Adaptateur 25 mM, 25 μL de 2x mélange maître PCR et 10 μL d’eau sans nucléase
  2. Effectuer le programme d’amplification PCR partie 1 (Tableau 2).
    REMARQUE: Pour l’amplification initiale, les mêmes conditions sont utilisées pour tous les échantillons utilisant un cycleur thermique standard.
  3. qPCR en temps réel (total de 14,5 μL par échantillon)
    1. En utilisant 5 μL du produit de la partie 1 de l’amplification PCR (étape 6.2.), configurez la réaction suivante, incluant cette fois l’or SYBR et la détection dans une machine de PCR en temps réel.
    2. Préparer le mélange réactionnel PCR comme suit : 5 μL de produit PCR de l’étape 6.2., 0,75 μL d’or SYBR (1000x dilué), 5 μL de 2x mélange maître PCR et 3,75 μL d’eau sans nucléase.
      REMARQUE : Les numéros de cycle précis pour l’amplification de la bibliothèque avant d’atteindre la saturation pour chaque échantillon sont déterminés par qPCR (tableau 3) afin de réduire le biais GC et de taille dans la PCR10. SYBR Gold a été dilué avec de l’eau sans nucléase. Pour fabriquer la solution diluée, 1 μL de SYBR Gold (concentration mère 10 000x) a été ajouté à 999 μL d’eau sans nucléase. La durée d’exécution de la RT-qPCR mentionnée dans le tableau 3 est d’environ 60 min.
  4. Déterminez le nombre requis de cycles de PCR supplémentaires à l’aide des paramètres d’exécution de l’étape 6.3.
    1. Nombre de cycles = 1/4 d’intensité de fluorescence maximale (saturée) (généralement 3 ou 4 cycles de PCR)
  5. Programme d’amplification par PCR partie 2 (volume = 45 μL; Tableau 4) : Une fois que vous avez déterminé le numéro de cycle, configurez les PCR avec des cycles supplémentaires calculés à l’étape 6.4.1. Par exemple, si le nombre de cycles calculé est 3, configurez 3 cycles dans le programme ci-dessous. Le nombre total de cycles serait de 8 (5 à l’étape 6.2., plus 3 cycles supplémentaires à l’étape 6.5).

7. Purification des perles

REMARQUE: Ici, des perles AMPure XP (Table of Materials) ont été utilisées.

  1. Aux produits PCR amplifiés à l’étape précédente, ajouter 150 μL de billes à TA.
    REMARQUE: Les perles AMPure14 faites maison peuvent être utilisées dans ce processus.
  2. Incuber pendant 15 min à TA.
  3. Placez les tubes sur un support magnétique pendant 5 min.
  4. Retirez délicatement le surnageant.
  5. Lavez les billes avec 200 μL d’éthanol à 80 %.
    NOTE: L’éthanol à 80% doit être préparé frais.
  6. Répétez l’étape 7.4.
  7. Retirez complètement l’éthanol.
  8. Sécher les échantillons à l’air libre pendant 10 min à TA.
  9. Resuspendre avec 50 μL de tampon d’élution (10 mM Tris-HCL pH 8,0).
  10. Répétez la purification des billes (étapes 7.1.-7.9.) pour minimiser davantage la contamination de l’apprêt.

8. Concentration de l’ADN et contrôle de la qualité

  1. Mesurer la concentration d’ADN à l’aide d’un kit de quantification des acides nucléiques (Tableau des matériaux).
  2. Vérifiez les fragments d’ADN amplifiés par électrophorèse sur gel à l’aide de SYBR Gold (0,5x TBE, gel d’agarose à 1,5%) ou d’un système d’électrophorèse automatisé (par exemple, TapeStation, bioanalyseur).

9. Séquençage

  1. Effectuer un séquençage à haut débit à l’aide des échantillons d’ADN amplifiés12,13.
    REMARQUE: Les échantillons d’ADN amplifiés sont prêts pour le séquençage à haut débit. Pour conserver les informations sur les fragments d’ADN nucléosomiques, le séquençage par paires est recommandé plutôt que le séquençage à une extrémité. Les deux extrémités des fragments d’ADN indiquent où la transposase se lie. Pour cartographier les régions de chromatine ouverte, 30 millions de lectures/échantillon sont généralement suffisantes.

10. Analyse des données

  1. Filtrage des données basé sur la qualité des appels de base : définissez le score de qualité de base moyen minimum sur 20 (précision de 99 %).
  2. Découpage de l’adaptateur : supprimez les séquences de l’adaptateur à l’aide d’un outil approprié.
    REMARQUE : L’outil wrapper Trim Galore (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) a été utilisé pour supprimer des séquences d’adaptateurs. Pour les bibliothèques ATAC-seq préparées par Illumina Tn5, la séquence suivante est utilisée comme séquence d’adaptateurs : CTGTCTCTTATACACATCT. La longueur de séquence minimale pour reconnaître la contamination de la carte est définie sur 5.
  3. Cartographie du génome: Mappez les lectures au génome approprié avec Bowtie en utilisant les paramètres suivants « -I 0 -X 2000 -m 1"15. Voici un exemple de cartographie de la qualité des cellules cancéreuses basales du sein MDA-MB-231 :
    Lectures avec au moins un alignement signalé : 52,79 %
    Lectures qui n’ont pas réussi à s’aligner : 13,10 %
    Lectures avec alignements supprimés en raison de -m : 34,11 %
  4. Déduplication : Marquez les doublons PCR par outils Picard16.
  5. Génération d’un fichier de couverture génomique pour la visualisation des données : convertissez les lectures appariées dédupliquées en fragments de lecture à une extrémité. Les traces de couverture du génome sont obtenues à l’aide de genomeCoverageBed à partir d’outils de lit17.

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Résultats

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Pour obtenir des données ATAC-seq réussies et de haute qualité, il est important d’optimiser les conditions expérimentales. La préparation de la bibliothèque ATAC-seq peut être séparée en cinq étapes principales (Figure 1), à savoir la lyse cellulaire, le marquage (fragmentation et insertion de l’adaptateur par Tn5), la purification de l’ADN génomique, l’amplification par PCR et l’analyse des données. En tant que processus initial, le tampon de lyse cellulaire (isolement nucléaire) doit d’ab...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ATAC-seq a été largement utilisé pour cartographier les régions de chromatine ouvertes et actives. La progression des cellules cancéreuses est souvent provoquée par des altérations génétiques et une reprogrammation épigénétique, ce qui entraîne une altération de l’accessibilité de la chromatine et de l’expression des gènes. Un exemple de cette reprogrammation est observé au cours de la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) et de son processus inverse, la transition mésenchymateuse-épithéliale (MET), qui sont connus ...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas d’intérêts financiers pertinents ou matériels liés à la recherche décrite dans cet article.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions l’installation UND Genomics Core pour son assistance technique exceptionnelle.

Ce travail a été financé par les National Institutes of Health [P20GM104360 à M.T., P20 GM104360 à A.D.] et des fonds de démarrage fournis par l’École de médecine et des sciences de la santé de l’Université du Dakota du Nord, Département des sciences biomédicales [à M.T.].

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tubes à centrifuger de 1,5 mLUSA Scientific1615-5500Natural
10 & micro ; L XL TipOne tipsUSA Scientific1120-3810Filtré et à faible rétention
100 & micro ; L XL TipOne Embouts RPTUSA Scientific1182-1830Filtré et à faible rétention
100 & micro ; L XL TipOne tipsUSA Scientific1120-1840Filtré et à faible rétention.
Tubes à centrifuger coniquesCorning352096
20 & micro ; L TipOne pointes RPTUSA Scientific1183-1810Filtré et à faible rétention
200 µ ; L TipOne Conseils RPTUSA Scientific1180-881050 mL filtrés et à faible rétention
Fisherbrand06-443-19
AgaroseThermoFisher ScientificYBP136010Genetic Analysis Grade
Toutes les lignées cellulaires utilisées dans cette étude sont obtenues à partir deATCC ATCC
Allegra X-30RBeckman Coulter364658SX2415
AMPure XP billesBeckman CoulterA63881Kit de purification de billes
CellDrop Compteur de cellulesDeNovixCellDrop FLCompteur de cellules
EDTAMilliporeSigmaEDSBioUltra, anhydre, &ge ; 99 % (titrage)
EGTAMilliporeSigmaE3889
Éthanol 100 %ThermoFisher ScientificAC615100020Anhydre ; Fisher Scientific - Produits de stérilisation Decon Labs
Sérum de veau fœtal - Testé TETR& D SystemsS10350Triple 0.1 & micro ; m filtré
Gibco DMEM 1xThermoFisher Scientific11965092[+] 4,5 g/L de D-glucose ; [+] L-Glutamine ; [-] Pyruvate de sodium
Gibco PBS 1xThermoFisher Scientific10010023pH 7,4
Gibco Trypsine-EDTA 1xThermoFisher Scientific25200056(0,25 %), rouge de phénol
GlycérolIBI Scientific56-81-5
GlycineMilliporeSigmaG8898
HClMilliporeSigmaH1758
HEPESMilliporeSigmaH3375
Invitrogen Qubit FluorimètreThermoFisher ScientificQ32857
MgCl2MilliporeSigmaM3634
MinElute Kit de purification PCRQiagen28004Kit de purification d’ADN
NaClIBI Scientific7647-14-5
NaOHMilliporeSigmaS8045BioXtra, &ge ; 98 % (acidimétrique), granulés (anhydres)
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master MixNew England BiolabsM0541
Nextera DNA Sample Preparation KitIlluminaFC-121-10302x TD et Tn5 Transposase
NP - 40 (IGEPAL CA-630)MilliporeSigmaI8896pour biologie moléculaire
Système de détection PCRBioRad1855484Système temps réel CFX384. Thermocycleur C1000 Touch
PIPESMilliporeSigmaP1851BioPerformance Certifié, adapté à la culture cellulaire
Qubit dsDNA HS Kit de dosageThermoFisher ScientificQ32854Invitrogen ; Kit de quantification des acides nucléiques
Quibit Assay TubesThermoFisher ScientificQ32856Invitrogen
SDSMilliporeSigmaL3771
Acétate de sodiumHomemade-pH5.2
SaccharoseIBI Scientific57-50-1
SYBR GoldThermoFisher ScientificS11494
SYBR Vert Supermix, 1,25 mLBioRad1708882
T100 ThermocycleurBioRad1861096
TempAssure 0,2 mL PCR 8-Tube StripsUSA Scientific1402-4700Sans flex, naturel, polypropylène
TempPlate 384-WELL PCRPLATE USA Scientific1438-4700Encoche unique. Polypropylène naturel
Tris BaseMilliporeSigma648311ULTROL Grade
Triton x-100IBI Scientific9002-93-1
TrueSeq Dual Index Sequencing Primer KitIlluminaPE-121-1003paired-end
Trypan Blue StainThermoFisher ScientificQ32851
Tween-20MilliporeSigmaP7949BioXtra, liquide visqueux
EauMilliporeSigmaW3500stérile-filtré, BioReagent, adapté à la culture cellulaire
biseautés de grade 15 mL Tubes à centrifuger la centrifugeuse

Références

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