Détermination de l’association thermodynamique et cinétique d’un aptamère d’ADN et d’une tétracycline à l’aide de la calorimétrie de titrage isotherme

Résumé

Le présent protocole décrit l’utilisation de la calorimétrie de titrage isotherme (ITC) pour analyser l’association et la cinétique de dissociation de la liaison entre un aptamère d’ADN et la tétracycline, y compris la préparation des échantillons, les étalons et les échantillons, et l’interprétation des données résultantes.

Résumé

La détermination de l’affinité et du comportement de liaison entre un aptamère et sa cible est l’étape la plus cruciale dans la sélection et l’utilisation d’un aptamère pour l’application. En raison des différences drastiques entre l’aptamère et les petites molécules, les scientifiques doivent faire beaucoup d’efforts pour caractériser leurs propriétés de liaison. La calorimétrie de titrage isotherme (ITC) est une approche puissante à cette fin. L’ITC va au-delà de la détermination des constantes de dissociation (K d) et peut fournir les changements d’enthalpie et la stœchiométrie de liaison de l’interaction entre deux molécules dans la phase_de solution. Cette approche effectue un titrage continu à l’aide de molécules sans marquage et enregistre la chaleur libérée au fil du temps sur les événements de liaison produits par chaque titrage, de sorte que le processus peut mesurer avec sensibilité la liaison entre les macromolécules et leurs petites cibles. Ici, l’article présente une procédure étape par étape de la mesure ITC d’un aptamère sélectionné avec une petite cible, la tétracycline. Cet exemple prouve la polyvalence de la technique et son potentiel pour d’autres applications.

Introduction

Les aptamères sont des fragments d’ADNss ou d’ARN sélectionnés par un processus d’évolution avec une affinité et une spécificité de liaison élevées aux cibles souhaitées^1,2, qui peuvent fonctionner comme des éléments de reconnaissance avancés ou des anticorps chimiques 3,4,5. Ainsi, l’affinité et la spécificité de liaison des aptamères à leurs cibles jouent un rôle crucial dans la sélection et l’application d’un aptamère, et la calorimétrie de titrage isotherme (ITC) a été largement utilisée à ces fins de caractérisa....

Protocole

NOTE: La figure 2 montre les principales étapes de l’expérience ITC pour déterminer l’association thermodynamique et cinétique d’un aptamère d’ADN et de la tétracycline.

1. Préparation des échantillons

REMARQUE : Les échantillons pour l’ITC doivent être préparés dans le même tampon pour l’aptamère et le ligand afin d’éviter le dégagement de chaleur causé par le mélange de différents tampons de la cellule d’échantillon et de la seringue. Ceci est généralement réalisé par dialyse de tous les matériaux dans le même tampon. Le tampon est échangé à l’aide d’un protocole ada....

Résultats

ITC fournit une constante de dissociation précise (K_d), la stœchiométrie de liaison et les paramètres thermodynamiques des interactions à deux molécules⁶. Dans cet exemple, l’aptamère choisi par Kim et coll.9,11 se lie à la tétracycline avec des affinités de liaison de K d 1 = ¹³ μM^, K_d 2 = 53 nM. Fait intéressant, cette liaison a été déterminée à l’aide de la méthode de filtratio.......

Discussion

La méthode présentée ici a été modifiée selon les instructions de TA Instruments et est suffisante pour déterminer l’affinité de liaison et la thermodynamique de nombreux aptamères et cibles sélectionnés dans notre centre. Les étapes cruciales de cette procédure comprennent l’échange du tampon pour avoir une cible correspondant au ligand, l’exécution d’échantillons avec les paramètres appropriés et la recherche du modèle d’ajustement de liaison approprié pour analyser les données. L’enregistrement continu de la libératio.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCacgg C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3'Integrated	DNA Technologies, Inc		La séquence est tirée des recherches de Gu, qui n’ont pas identifié Kd à l’aide de l’ITC (voir références 8 et 9)
Affinity ITC Auto Low Volume (190 µ ; l) Système complet&ndash ; Gold Cells	TA Instruments	61000.901	Système de titrage calorimétrique isotherme
CaCl2	Avantor (VWR)	E506-100ML	Chlorure de calcium 1 M en solution aqueuse, qualité biotechnologie, stérile
	Centrifugeuse Eppendorf	5417R	L’Eppendorf 5417R est inégalé en termes de sécurité, de fiabilité et de facilité d’utilisation. Très facile à entretenir avec un moteur brushless qui tourne jusqu’à 16 400 tr/min avec une FCR maximale jusqu’à 25 000 x g.
Station de dégazage complète (110/230V)	TA Instruments	6326	Ce dégazeur est équipé d’une plate-forme d’agitation autonome, d’une chambre à vide, d’un port de vide, d’un port de température, d’un contrôle de la température et d’une minuterie électronique pour une préparation correcte des échantillons.
EDTA	TekNova	E0375	EDTA 500 mM, pH 7,5
NanoDrop Spectrophotomètre UV-Vis à un microvolume	ThermoFisher	Spectrophotomètre UV-VIS	ND-ONE-W
Nanosep, Nanosep MF et NAB Dispositifs centrifuges	Pall Laboratory	OD030C34	Concentrateur de coupure de poids moléculaire 3 kDa
PBS pH 7,4	IBI Scientific	IB70165	Tampon contenant du phosphate de sodium, du chlorure de sodium, du phosphate de potassium et du chlorure de potassium de qualité ultra-pure Filtré stérilement à l’aide de 0,2 & micro ; Filtre M. Autoclave à 121 ° ; C pendant plus de 20 min.
Posi-Click 1,7 mL Tubes de microcentrifugation à grand capuchon	labForce (une marque Thomas Scientific)	1149K01
Tétracycline, hydrochlorure	EMD Millipore Corperation	CAS64-75-5