Ici, nous décrivons un protocole simple pour l’isolement et la coloration des cellules de moelle osseuse murine en cellules souches et progénitrices hématopoïétiques phénotypiques ainsi que les cellules souches endothéliales et mésenchymateuses de niche. Une méthode d’enrichissement des cellules situées dans les zones endostéales et centrales de la moelle osseuse est également incluse.
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Article de méthode
Analyse par cytométrie en flux de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques de moelle osseuse murine et de cellules de niche stromale
Dans cet article
Résumé
Résumé
La moelle osseuse (BM) est le tissu mou présent dans les os où se produit principalement l’hématopoïèse, le processus par lequel de nouvelles cellules sanguines sont générées. En tant que tel, il contient des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC), ainsi que des cellules stromales de soutien qui contribuent au maintien et à la régulation des HSPC. Les troubles hématologiques et autres troubles de la BM perturbent l’hématopoïèse en affectant directement les cellules hématopoïétiques et / ou par l’altération de la niche BM. Ici, nous décrivons une méthode pour étudier l’hématopoïèse dans la santé et la malignité par l’analyse phénotypique des HSPC BM murins et des populations de niche stromale par cytométrie de flux. Notre méthode détaille les étapes requises pour enrichir les cellules BM en fractions BM endostéales et centrales, ainsi que les stratégies de contrôle appropriées pour identifier les deux principaux types de cellules de niche impliquées dans la régulation HSPC, les cellules endothéliales et les cellules souches mésenchymateuses. L’analyse phénotypique proposée ici peut être combinée avec des mutants murins, des modèles de maladie et des tests fonctionnels pour caractériser le compartiment HSPC et sa niche.
Introduction
La cytométrie de flux est une méthode inestimable pour caractériser et isoler prospectivement les cellules immunitaires et hématopoïétiques. Il est également de plus en plus utilisé pour analyser les populations stromales et épithéliales de différents tissus. La cellule souche hématopoïétique (CSH) possède des propriétés uniques d’auto-renouvellement et de multipotence. Chez les mammifères adultes, les CSH résident principalement dans la moelle osseuse (BM), où elles reçoivent des signaux de quiescence et de survie du microenvironnement environnant ou de la niche1. Les CSH sont formellement définies selon les essais fonctionnels
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Protocole
Les animaux utilisés dans ce protocole ont été hébergés à l’animalerie i3S dans des conditions exemptes d’agents pathogènes spécifiques dans un cycle lumière-obscurité de 12 heures et dans un environnement à température contrôlée. L’accès gratuit à la nourriture standard pour rongeurs et à l’eau était fourni. Tous les animaux ont reçu des soins sans cruauté selon les critères définis par la Fédération des associations européennes de science des animaux de laboratoire pour le soin et la manipulation des animaux de laboratoire (directive européenne 2010/63/UE). La procédure expérimentale pratiquée sur les animaux (euthanasie) a été approuvée par le Comité d’éthique anim....
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Résultats
Des diagrammes représentatifs de l’analyse par cytométrie en flux des CSH et des MPP chez une jeune souris C57Bl/6 en bonne santé sont présentés à la figure 1. La stratégie de contrôle suit la dernière nomenclature d’harmonisation proposée par l’ISEH13. Lors de l’analyse de l’impact d’une perturbation, telle qu’une infection ou un cancer, il est important d’utiliser une souris témoin comme référence pour les portes normales. Les contrôles de fluorescence moins un (FMO.......
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Discussion
Bien que le protocole décrit soit simple et facile à exécuter, une attention particulière doit être portée à des étapes spécifiques. Par exemple, lors de l’obtention d’une BM rincée (étape 5.2), le volume ou le nombre de fois indiqué pour faire passer PBS 2% FBS à l’intérieur de la partie centrale de l’os ne doit pas être dépassé, car cela pourrait entraîner une contamination importante de l’échantillon rincé par des populations de cellules endosteales.
Des modifications peuvent être apportées.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Remerciements
LM a été soutenu par une subvention du Lady Tata Memorial Trust. JR a été soutenu par une bourse de doctorat de la Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT; Bourse FCT UI/BD/150833/2021). ML a été soutenu par une bourse de doctorat de FCT (FCT fellowship 2021.04773.BD). DD a été soutenu par des subventions de l’American Society of Hematology, de la Pablove Foundation, de la FCT (EXPL/MED-ONC/0522/2021) et de la Société portugaise d’hématologie. Nous remercions le soutien de la Dre Catarina Meireles et d’Emilia Cardoso de l’installation TRACY à i3s.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 647 anticorps anti-souris CD54/ICAM-1 | BioLegend | 116114 | |
| APC Streptavidine | BioLegend | 405207 | |
| APC/Cyanine7 anti-souris CD117 (c-kit) Anticorps | BioLegend | 105826 | |
| APC/Cyanine7 anti-souris CD45 Anticorps | BioLegend | 103116 | |
| APC/Cyanine7 anti-souris TER-119/cellules érythroïdes | BioLegend | 116223 | |
| Biotine anti-souris CD3&epsilon ; | anticorps BioLegend | 100304 | |
| Biotine anti-souris CD4 | BioLegend | 100404 | |
| Biotine anti-souris CD8a Anticorps | BioLegend | 100704 | |
| Biotine anti-souris Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) | BioLegend | 108404 | |
| Biotine anticorps anti-souris TER-119/cellules érythroïdes | BioLegend | 116204 | |
| Biotine anti-souris/anticorps CD11b humain | BioLegend | 101204 | |
| Biotine anti-souris/humain CD45R/B220 | Anticorps BioLegend | 103204 | |
| Brilliant Violet 510 anti-souris CD150 (SLAM) | Anticorps BioLegend | 115929 | |
| Calibrite 2 Color Beads | BD Biosciences | ||
| Collagénase IV | Merck Life Science | C1889 | |
| Dispase II | Merck Life Science | D4693 | |
| Sérum fœtal de bovin, qualifié, inactivé par la chaleur, approuvé par l’UE, Amérique du Sud Origine | ThermoFisher Scientific | 10500064 | |
| la solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
| Souris Leptin R Anticorps biotinylés | R& D systems | BAF497 | |
| NucBlue Fixed Cell Reagent (DAPI) | ThermoFisher Scientific | R37606 | Réactif DAPI |
| PE anticorps anti-endomucine de souris | ThermoFisher Scientific | 12-5851-82 | |
| PE anti-souris Flk2 (CD135) | ThermoFisher Scientific | 12-1351-82 | |
| PE/Cyanine7 anti-souris CD31 anticorps | BioLegend | 102524 | |
| Anticorps CD48 anti-souris PE/Cyanine7 | BioLegend | 103424 | |
| PerCP Anticorps anti-souris Ly-6A/E (Sca-1) | BioLegend | 108122 | |
| Comprimés de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) | Merck Life Science | P4417 | |
| Anticorps CD16/32 purifié | BioLegend | 101302 | |
| tampon de lyse RBC 10x | BioLegend | 420302 | |
| Zombie Violet Fixable Viability Dye | BioLegend | 423114 | colorant fluorescent |
Références
- Comazzetto, S., Shen, B., Morrison, S. J. Niches that regulate stem cells and hematopoiesis in adult bone marrow. Developmental Cell. 56 (13), 1848-1860 (2021).
- Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell.
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Réimpressions et autorisations
