Transplantation de neurones GABAergiques dérivés de cellules souches humaines dans l’hippocampe postnatal précoce de souris pour atténuer les troubles neurodéveloppementaux

L’établissement, la maturation et le raffinement des réseaux neuronaux se produisent pendant la période périnatale et postnatale précoce et représentent des fenêtres temporelles cruciales pour le développement du cerveau¹. D’une exubérance de connectivité après la naissance, le cerveau évolue vers un réglage fin des connexions qui s’étend jusqu’à l’adolescence². Par conséquent, les altérations des gènes exprimées au cours de ces périodes, ainsi que les facteurs externes ou les insultes, définissent la prédisposition d’un individu à de multiples troubles neurodéveloppementaux. Les altérations de la cognition et de la fonction motrice se manifestent au fil du temps, et les traitements pharmacologiques sont limités, la majorité ciblant les symptômes avec le risque d’effets secondaires graves.

Il a été démontré que le dysfonctionnement de l’inhibition ergique de l’acide gamma-aminobutyrique (GABA) est un contributeur majeur à la cause sous-jacente de divers troubles neurodéveloppementaux³, tels que le syndrome de l’X fragile, le syndrome d’Angelman, l’épilepsie, la schizophrénie et l’autisme. Le GABA est le principal transmetteur inhibiteur du système nerveux central et joue un rôle déterminant dans le maintien de l’équilibre excitateur / inhibiteur (E / I), la synchronisation du déclenchement neuronal et le calcul. Les interneurones GABAergiques sont une population hétérogène de neurones, avec une complexité fonctionnelle croissante dans des régions cérébrales plus complexes⁴ et avec une évolution ^5,6. Compte tenu de la capacité de régénération endogène limitée du cerveau humain et de l’implication du dysfonctionnement interneuronal dans plusieurs troubles neurologiques, la transplantation d’interneurones GABAergiques peut être une avenue thérapeutique prometteuse à explorer. Dans cette optique, les cellules interneurones GABAergiques dérivées de cellules souches humaines (hdIN) semblent être la source la plus translationnelle et la plus viable à cette fin par rapport aux précurseurs neuronaux allogéniques des rongeurs ou à d’autres sources utilisées ailleurs⁷. Des protocoles pour générer des neurones GABAergiques à partir de diverses sources cellulaires sont disponibles 8,9,10,11,12,13, mais plus de connaissances sont nécessaires sur la façon dont les hdINs mûrissent^, s’intègrent et fonctionnent au fil du temps dans un cerveau pathologique en développement. Plusieurs études ont identifié des altérations dans les gènes actifs pendant la structuration corticale, établissant la connectivité neuronale¹⁴ et réglant l’équilibre physiologique E/I¹⁵. La transplantation néonatale de hdINs dans des modèles murins avec les perturbations génétiques correspondantes nous permet de suivre l’interaction entre l’hôte et le greffon, ce qui est une connaissance nécessaire pour déterminer les stratégies thérapeutiques potentielles.

L’immunomodulation est couramment et avec succès utilisée dans les greffes de xénogreffes pour éviter de déclencher une réponse immunitaire de l’hôte et un rejet¹⁶. Cependant, l’administration de médicaments immunosuppresseurs, tels que la cyclosporine A, provoque une toxicité rénale après administration chronique, nécessite beaucoup de main-d’œuvre en raison de la nécessité d’injections intrapéritonéales quotidiennes pour atteindre des concentrations systémiques stables, provoquant un stress animal¹⁷, et a des effets hors cible qui peuvent interagir avec la pathologie¹⁸. En outre, il a été démontré que la compromission du système immunitaire modifie les phénotypes^{comportementaux 19}, avec des altérations dans les régions neuroanatomiques correspondantes²⁰. Il a été démontré que la transplantation au cours de la première semaine de vie permet une adaptation aux cellules transplantées 21,22, tandis que d’autres ont signalé une survie initiale suivie d’un rejet des greffons au cours du premier mois postnatal ^23,24.

Ce protocole décrit les procédures allant de la génération de hdIN à la transplantation cellulaire chez la souris néonatale aboutissant à la survie à long terme du greffon et permettant d’étudier la spécificité neuronale, l’intégration synaptique, la fonction et le potentiel thérapeutique des interneurones humains transplantés au cours du développement physiologique et pathologique.

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le comité d’éthique de la recherche animale de Malmö/Lund, numéro de permis éthique 12548-19, et menées en accord avec les règlements de l’Agence suédoise de protection des animaux et la directive européenne 2010/63/UE pour l’expérimentation animale. C57BL6/J et les souris knock-out (Cntnap2) knock-out (Cntnap2) associées à la protéine, mâles et femelles, ont été utilisées au jour postnatal (P) 2 pour la présente étude. Des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) ont été utilisées. Les animaux et les cellules souches ont été obtenus de sources commerciales (voir le tableau des matériaux).

1. Génération des précurseurs hdIN

REMARQUE: Toutes les étapes de cette section sont effectuées dans une hotte de culture cellulaire. Les CSEh ont été maintenues sous forme de cellules sans alimentation sur des plaques enrobées à l’aide d’un milieu de culture de cellules souches et ont été transmises sous forme de colonies.

1. Effectuer la programmation en aval des hESCs vers les précurseurs hdIN (Figure 1).
   NOTE: L’approche de programmation prospective est basée sur la procédure décrite dans Gonzalez-Ramos et ^al.8 et Yang et ^al.9.
   1. Transduire les CSEh avec des vecteurs lentiviraux contenant le système Tet-On dans un milieu de culture de cellules souches fraîches contenant 10 μM d’inhibiteur de ROCK (IR) (voir le tableau des matériaux). Conserver à 37 °C dans l’incubateur.
   2. Remplacer le milieu par un milieu de culture de cellules souches fraîches 16 h après la transduction et maintenir les cellules transduites de la même manière que les CSEh non transduits.
   3. Lorsqu’ils sont confluents, détacher les CSEh sous forme de cellules individuelles à l’aide d’une solution de détachement de cellules (voir le tableau des matériaux) et les plaquer dans des plaques revêtues de 6 puits à une densité de 3 x 10⁵ cellules/puits dans un milieu de culture de cellules souches contenant 10 μM d’IR le jour in vitro (DIV) −1.
   4. À 1 DIV, remplacer le milieu de culture par un milieu N2 contenant 2 g/L de doxycycline (DOX, voir le tableau des matériaux).
      NOTE: DOX est utilisé pour induire l’expression transgénique de Ascl1 et Dlx2⁹, de 1 DIV à 7 DIV, puis continue in vivo par son ajout à l’eau potable²⁵.
   5. À 2 DIV, une période de sélection de la résistance aux antibiotiques commence qui durera jusqu’à 5 DIV. Ajouter la puromycine (puro) et l’hygromycine (hygro) au milieu frais (voir le tableau des matériaux). Changez le support sur 2 DIV, 4 DIV et 5 DIV.
      NOTE: Optimiser les concentrations de puro et d’hygro avant le protocole de différenciation en utilisant des CSEh transduites et non transduites pour assurer la survie des seules cellules porteuses des cassettes de résistance aux antibiotiques. Dans ce protocole, 0,5 μg/mL de puro et 750 μg/mL d’hygro ont été utilisés.
   6. À 5 DIV, la période de sélection des antibiotiques se termine. Passer au milieu N2 complété par 2 g/L de DOX et 4 μM de cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C, voir le tableau des matières).

Figure 1 : Génération de précurseurs hdIN à partir de CSEh par surexpression d’Ascl1 et de Dlx2. A) Schéma du protocole de différenciation utilisé pour la génération de précurseurs hdIN. (B-E) Immunocytochimie des précurseurs hdIN à 7 DIV pour (B) le marqueur neuronal MAP2, (C) le marqueur prolifératif Ki67, (D) la coloration nucléaire générale, et (E) une fusion des marqueurs précédents. Barre d’échelle: 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Préparation de la suspension unicellulaire pour la transplantation

REMARQUE: Toutes les étapes de cette section sont effectuées dans le capot de culture cellulaire. Sur 7 DIV, les précurseurs hdIN sont dissociés et utilisés pour la transplantation.

1. Effectuez le détachement des cellules en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Retirez le milieu et rincez soigneusement les cellules avec du DPBS sans calcium ni magnésium.
   2. Ajouter 400 μL de la solution de détachement de cellule (voir le tableau des matériaux) à chaque puits de la plaque à 6 puits.
      NOTE: Assurez-vous de la couverture de toute la surface par la solution.
   3. Incuber pendant 2-3 min à 37 °C dans l’incubateur jusqu’à ce que la bordure des cellules commence à briller, indiquant une dégradation enzymatique des protéines de surface cellulaire et un détachement de la surface du puits.
      REMARQUE: Pour augmenter la survie des cellules, n’attendez pas trop longtemps lorsque toutes les cellules sont complètement détachées et flottantes.
   4. Ensuite, ajoutez 600 μL de milieu N2 frais à chaque puits de la plaque à 6 puits pour arrêter l’enzyme, et mécaniquement avec la pipette, aidez à détacher les cellules pour obtenir une suspension unicellulaire.
   5. Transférer la suspension cellulaire dans un tube en plastique (15 mL) et centrifuger à 180 x g pendant 4 min à température ambiante (RT).
2. Effectuer la remise en suspension des cellules.
   1. Jeter le surnageant à l’aide d’un système de vide (soigneusement, sans déranger le granulé) et remettre le granulé en suspension dans le milieu de transplantation contenant 10 μM d’IR, 1 μg/mL de DNase et 2 μg/μL de DOX.
   2. Compter le nombre total de cellules dans la suspension à l’aide d’une chambre de comptage et d’un compteur de cellules manuel et ajuster le volume à une concentration finale de 100 000 cellules/μL.
   3. Conserver la suspension cellulaire dans un tube fermé sur de la glace jusqu’à la transplantation pendant un maximum de 4 h.
      NOTE: La transplantation doit être effectuée le même jour que la préparation de la suspension cellulaire (7 DIV).

3. Transplantation intrahippocampique de cellules

REMARQUE : Toutes les étapes de cette section sont effectuées à l’extérieur du capot de culture cellulaire de l’animalerie. La transplantation postnatale précoce de cellules dans le cerveau a été réalisée sur P2, en considérant P0 le jour de la naissance.

1. Préparez-vous à l’expérience de transplantation en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Autoclaver tout le matériel chirurgical ou, si ce n’est pas possible, stériliser avec une autre méthode approuvée.
   2. Montez la seringue injectable dans le support sans aucun capillaire en verre. Rincez l’aiguille avec de l’eau.
      NOTE: L’aiguille doit être de 33 G.
   3. Courber à 90° l’extrémité d’une aiguille à insuline de 30 G.
   4. Créez une scène maison de type Play-Doh pour positionner le chiot avec la tête à plat (Figure 2A).
   5. Allez chercher la cage des souris avec la mère et les chiots avant de préparer quoi que ce soit pour la chirurgie afin de leur permettre de s’acclimater au nouvel environnement.
   6. Préparez un plateau avec de la glace humide et une cage vide avec du papier pour l’isoflurane.
2. Anesthésiez le chiot souris.
   1. Trempez un morceau de papier avec de l’isoflurane (voir le tableau des matériaux) et placez-le à l’intérieur de la cage vide. Prenez soigneusement un chiot et placez-le dans la cage avec le papier imbibé d’isoflurane.
      REMARQUE: Ne laissez jamais moins de trois chiots avec la maman. Ne pas dépasser 20-30 s d’anesthésie à l’isoflurane, sinon le chiot peut mourir.
   2. Vérifier l’effet de l’anesthésie par l’arrêt du mouvement.
   3. Immédiatement après l’anesthésie, placez le chiot sur un tissu humide à la surface de la glace humide. Gardez l’animal sur la glace pendant 3 minutes jusqu’à ce que les membres supérieurs deviennent blanchâtres (figure 2B, flèche bleue). Cela prend généralement 2-3 min.
   4. Utilisez ce temps pour charger la seringue avec la suspension cellulaire. Remettez soigneusement les cellules en suspension avec une pipette avant.
   5. Placez le chiot sur le cadre stéréotaxique. Utilisez les barres d’oreille dans la direction opposée (Figure 2A, flèches magenta).
      REMARQUE: L’arrière des barres d’oreille est moins pointu, et comme les chiots P2 n’ont pas d’oreilles, utilisez le côté plus plat pour éviter de blesser l’animal.
   6. De côté, vérifiez si la tête est droite. La tête doit être plate; utilisez la scène de type Play-Doh pour vous ajuster à cela.
      REMARQUE: Les chiots de cet âge n’ont pas encore ouvert les yeux, donc aucune étape supplémentaire à cet égard ne doit être faite. Les chiots n’ont pas de fourrure à cet âge, donc aucun rasage de la zone n’est nécessaire. Aucun traitement spécifique de la douleur n’est administré car il ne s’agit pas d’une incision ouverte sur la peau et aucune suture n’est impliquée.
   7. Gardez le chiot couvert de glace (sur du papier de soie) pendant toute la durée de la chirurgie.
      REMARQUE: Ne placez pas la glace en contact direct avec la peau du chiot.
3. Effectuez l’injection.
   1. Nettoyez la surface de la peau à l’aide d’un tissu mou imbibé d’éthanol.
   2. Identifiez lambda et réglez les coordonnées à zéro sur la console d’affichage numérique de l’instrument stéréotaxique (Figure 2C, ligne pointillée jaune). Les sutures sagittales et lambdoïdes sont facilement visibles à l’œil, car elles sont vascularisées, sous forme de lignes rouges.
      REMARQUE: Si vous rencontrez des difficultés pour visualiser le lambda, placez un petit morceau de glace sur la peau et attendez quelques minutes pour qu’il refroidisse. Ensuite, retirez le morceau de glace, et le blanchiment subtil de la peau vous permettra de visualiser.
   3. Déplacez l’aiguille d’injection aux coordonnées souhaitées. Dans le protocole décrit, la région ciblée était l’hippocampe, et les coordonnées étaient les suivantes : antéro-postérieur (AP) +0,85 et médio-latéral (ML) +1,35.
   4. Utilisez une aiguille à insuline pliée à 90° pour pénétrer dans le crâne et créer un petit trou.
   5. Abaissez l’aiguille d’injection jusqu’à ce qu’elle ait traversé le crâne et mettez à zéro les coordonnées dorso-ventrales (DV). Abaissez l’aiguille jusqu’à ce que les coordonnées DV souhaitées. Dans le protocole décrit, les coordonnées étaient DV −1.1.
   6. Injecter selon les intervalles de temps prédéterminés.
      REMARQUE: Dans le protocole décrit, les timings exacts étaient les suivants: (i) après être descendu jusqu’à la coordonnée DV, attendez 3 min, (ii) injectez 1 μL de volume pendant 5 min, et (iii) après que tout le volume a été injecté, attendez 3 min.
   7. Rétractez lentement l’aiguille.
4. Terminez la procédure.
   NOTE: La chirurgie ne peut pas durer plus de 15 minutes pour assurer la survie du chiot et éviter tout dommage dérivé de l’anesthésie par hypothermie.
   1. Réchauffez le chiot avec les mains jusqu’à ce qu’il commence à bouger avant de le rendre à la mère.
   2. Administrer du DOX à une concentration de 1 mg/mL dans une solution de saccharose à 0,5 % sous forme d’eau potable pendant au moins 2 jours avant et 3 semaines après la transplantation (PT) pour poursuivre la différenciation cellulaire in vivo.

Figure 2 : Transplantation stéréotaxique chez des petits de souris nouveau-nés à P2. (A) Une scène de type Play-Doh pour maintenir le corps du chiot en position et des barres d’oreille inversées (flèches magenta). (B) Patte avant blanche (flèche bleue) indiquant la réduction du flux sanguin dans cette zone, de sorte que le chiot subit une anesthésie par hypothermie. (C) Vue d’ensemble de la configuration avec le chiot déjà recouvert de glace sur le papier de soie mou. (c#) Zoom fermé de la tête du chiot, avec l’aiguille d’injection déjà insérée dans le cerveau (ligne pointillée jaune indiquant les sutures lambda et lambdoïde). Cette figure est adaptée de Gonzalez Ramos et al. ²⁷. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Suivant le protocole présenté ici et illustré à la figure 1A, les précurseurs hdIN n’étaient pas encore prolifératifs à 7 DIV tels que définis par (i) une immunoréactivité négative pour le marqueur du cycle cellulaire Ki67 et (ii) exprimant des marqueurs neuronaux tels que la protéine 2 associée aux microtubules (MAP2) (Figure 1B-E). Cette caractérisation a été réalisée sur des cellules restantes replaquées pendant 24 h après avoir subi toutes les étapes de la procédure. De plus, l’analyse de l’expression génique publiée précédemment indiquait qu’une transition rapide de l’état pluripotent à un phénotype neuronal se produit autour de 4 DIV et 7 DIV8. Globalement, ces résultats ont confirmé la présence de cellules postmitotiques et l’absence de risque de formation de tératomes.

Ensuite, la survie des précurseurs hdIN après une transplantation postnatale précoce dans l’hippocampe de souris de type sauvage (WT) a été testée par immunohistochimie contre le marqueur cytoplasmique humain STEM121. Les précurseurs hdIN ont été transplantés dans l’hippocampe dorsal droit de souris immunocompétentes naïves à P2, qui ont ensuite été sacrifiés à P14 et 2 mois PT. Les cellules greffées ont été trouvées sur l’ensemble de l’hippocampe dorsal, ainsi que dispersées à travers le corps calleux et l’hippocampe controlatéral, aux deux points temporels. De plus, aux deux points temporels, les hdINs greffés exprimaient Ascl1, l’un des facteurs de transcription d’induction (Figure supplémentaire 1), et n’étaient pas prolifératifs, comme l’indique l’absence d’expression de Ki67 (Figure supplémentaire 2).

Il est important de noter qu’aucune réaction immunitaire ou inflammation locale contre les cellules transplantées n’a été observée à P14 ou à 2 mois PT, comme l’évalue l’absence de microglie réactive identifiée à l’aide d’Iba1, de CD68 et de galectine-3 (Gal3) (Figure 3), l’étendue de l’astrogliose déterminée par la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) et les cytokines inflammatoires telles que l’interleukine-1 (IL-1), et l’absence de lymphocytes T cytotoxiques (CD8) (Figure 4).

Figure 3 : hdINs à P14 et 2 mois PT dans l’hippocampe de souris WT nouveau-nées sans déclencher de rejet immunitaire du tissu hôte. Immunofluorescence des marqueurs Iba1, CD68 et Gal3 dans le tissu cérébral de (A-D) la proximité d’une zone centrale ischémique dans un modèle murin d’AVC par électrocoagulation (témoin positif, Ctrl +), (E-H) animaux témoins négatifs (Ctrl-) à 2 mois et (M-P) P14, et (I-L) animaux ayant subi une greffe de cellules à 2 mois et (Q-T) animaux ayant subi une greffe de cellules à 2 mois et (Q-T ) P14. Les flèches blanches indiquent quelques exemples de vaisseaux sanguins visibles à tous les canaux en raison de l’autofluorescence. Abréviations : Ctx = cortex; Hanche = hippocampe; DG = gyrus denté; CA1 = cornu ammonis 1. Barre d’échelle: 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Les hdINs à 2 mois PT pénètrent dans l’hippocampe de souris WT nouveau-nées sans déclencher de rejet immunitaire du tissu hôte. Immunofluorescence des marqueurs IL1, GFAP et CD8 dans le tissu cérébral de (A-D) la proximité d’une zone centrale ischémique dans un modèle murin d’AVC par électrocoagulation (témoin positif, Ctrl +), (E-H) animaux témoins négatifs (Ctrl-) à 2 mois, et (I-L) animaux ayant subi une greffe de cellules à 2 mois. Abréviations : Ctx = cortex; Hanche = hippocampe; DG = gyrus denté. Barre d’échelle: 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

De même, les précurseurs hdIN ont également été transplantés dans l’hippocampe de souris Cntnap2 KO, un modèle pour le trouble du spectre autistique et le syndrome de dysplasie corticale et d’épilepsie focale. Chez les souris Cntnap2 KO, en effet, les hdINs ont survécu jusqu’à 9 mois de PT et ont été localisés au site d’injection, bien qu’ils aient également été dispersés à travers l’hippocampe ipsilatéral et même controlatéral comme observé chez les souris WT (Figure 5). De plus, la plupart des hdINs greffés étaient immunoréactifs pour les marqueurs interneuronaux, comme prévu par les résultats précédents in vitro 8,26 et chez des rongeurs adultes in vivo25.

Figure 5 : HdIN greffés dans l’hippocampe de souris Cntnap2 KO à 9 mois PT. (A) Immunochimie contre le marqueur humain cytoplasmique STEM121 chez des souris transplantées de cellules (à gauche) et fictives (à droite). (a1 et a2) Images agrandies de cellules STEM121 positives. (B) Immunofluorescence pour STEM121 (magenta) et les marqueurs interneuronaux parvalbumine (PV) et somatostatine (SST). Les flèches blanches indiquent des cellules doubles positives pour STEM121 et le marqueur interneuronal respectif. (C) Vue orthogonale d’un hdIN greffé immunoréactif pour STEM121 et PV. Barre d’échelle : 200 μm (A et B), 100 μm (a1 et a2), 20 μm (petit grossissement carré en a1 et a2, et C). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : HdINs greffés à 2 mois PT dans l’hippocampe de souris WT nouveau-nées exprimant Ascl1. Immunofluorescence contre Ascl1 et le marqueur humain cytoplasmique STEM121 au niveau de (A) CA3 et (B) DG chez des souris WT transplantées de cellules. (a) Image agrandie d’une cellule positive STEM121. Les flèches blanches indiquent des cellules doublement positives pour STEM121 et Ascl1. Barre d’échelle: 100 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : HdINs post-mitotiques greffés à 2 mois PT dans l’hippocampe de souris WT nouveau-nées. Immunofluorescence contre le marqueur prolifératif Ki67 et le marqueur humain cytoplasmique STEM121 chez (A) des souris WT naïves et (B) transplantées de cellules. b) Image agrandie d’une cellule positive STEM121. La flèche jaune indique une cellule positive pour Ki67 et négative pour STEM121. La flèche blanche indique les cellules positives pour STEM121 et négatives pour Ki67. L’astérisque blanc indique un ventricule latéral. Barre d’échelle: 100 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.