Ce protocole permet d’isoler les particules du virus d’Epstein-Barr de la lignée cellulaire humaine P3HR1 lors de l’induction du cycle lytique viral avec le phorbol 12-myristate 13-acétate. L’ADN est ensuite extrait de la préparation virale et soumis à une PCR en temps réel pour quantifier la concentration de particules virales.
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Article de méthode
Isolement et quantification du virus d’Epstein-Barr à partir de la lignée cellulaire P3HR1
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le virus d’Epstein-Barr (EBV), officiellement désigné comme herpèsvirus humain 4 (HHV-4), est le premier virus tumoral humain isolé. Près de 90 à 95% de la population adulte mondiale est infectée par le VEB. Avec les progrès récents de la biologie moléculaire et de l’immunologie, l’application de modèles expérimentaux in vitro et in vivo a fourni un aperçu approfondi et significatif de la pathogenèse du VEB dans de nombreuses maladies ainsi que de la tumorigenèse associée au VEB. L’objectif de cet article d’expérience visualisé est de fournir une vue d’ensemble de l’isolement des particules virales EBV à partir de cellules de la lignée cellulaire P3HR1, suivi d’une quantification de la préparation virale. Les cellules P3HR1, isolées à l’origine d’un lymphome de Burkitt humain, peuvent produire un virus P3HR1, qui est une souche de type 2 du VEB. Le cycle lytique EBV peut être induit dans ces cellules P3HR1 par traitement avec phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA), produisant des particules virales EBV.
En utilisant ce protocole pour l’isolement des particules EBV, les cellules P3HR1 sont cultivées pendant 5 jours à 37 °C et 5% de CO2 dans un milieu RPMI-1640 complet contenant 35 ng / mL de PMA. Par la suite, le milieu de culture est centrifugé à une vitesse de 120 x g pendant 8 min pour granuler les cellules. Le surnageant contenant le virus est ensuite recueilli et filé à une vitesse de 16 000 x g pendant 90 minutes pour granuler les particules EBV. La pastille virale est ensuite remise en suspension dans un milieu RPMI-1640 complet. Ceci est suivi par l’extraction de l’ADN et la PCR quantitative en temps réel pour évaluer la concentration de particules EBV dans la préparation.
Introduction
Le virus d’Epstein-Barr (EBV) est le premier virus tumoral humain à avoir été isolé1. Le VEB, officiellement appelé herpèsvirus humain 4 (HHV-4)2, fait partie de la sous-famille des virus de l’herpès gamma de la famille des virus de l’herpès et est le prototype du genre Lymphocryptovirus. Près de 90 à 95% de la population adulte mondiale est infectée par le virus3. Dans la plupart des cas, l’infection initiale survient au cours des 3 premières années de vie et est asymptomatique, cependant, si l’infection survient plus tard au cours de l’adolescence, elle peut donner lieu à une m....
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Protocole
NOTA : Le VEB devrait être considéré comme une matière potentiellement dangereuse pour la biologie et devrait donc être manipulé dans un cadre de confinement de niveau de biosécurité 2 ou supérieur. Une blouse de laboratoire ainsi que des gants doivent être portés. S’il y a un risque d’éclaboussure, une protection oculaire doit également être envisagée. La procédure suivante devrait être effectuée dans une enceinte de sécurité biologique.
1. Compter les cellules P3HR1
- Centrifugation et remise en suspension des cellules
- Transvaser la suspension cellulaire d’une plaque de culture de 100 mm (ou fiole T-25) d’u....
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Résultats
Le but de cette procédure est d’isoler les particules de VEB dans une suspension avec un titre viral connu, qui pourrait ensuite être utilisé pour modéliser l’infection par le VEB. Ainsi, il est de la plus haute importance d’utiliser des concentrations optimales des différents réactifs pour obtenir le rendement EBV le plus élevé de la procédure.
Un essai d’optimisation a été effectué pour déterminer les concentrations de PMA et de DMSO qui donneraient le plus grand nombre de particules EBV (
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Discussion
La production de particules EBV est nécessaire pour comprendre la biologie de ce virus ainsi que ses maladies associées. Ici, nous avons décrit la production de ces particules à partir de la lignée cellulaire P3HR-1. Cette lignée cellulaire n’est pas la seule lignée productrice d’EBV; en fait, des particules d’EBV ont également été isolées à partir de cellules B95-821,22 ainsi que de la lignée cellulaire Raji18,19........
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Le financement de ce travail a été soutenu par des subventions à ER du Fonds de recherche Asmar, du Conseil national libanais pour la recherche scientifique (L-CNRS) et du Medical Practice Plan (MPP) de l’Université américaine de Beyrouth.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Tubes PCR à paroi mince de 0,2 mL | Thermo Scientific | AB0620 | Doivent être autoclavés avant utilisation |
| 0,2-10 & micro ; L Embouts filtrants Microvolume | Corning | 4807 | Doit être autoclavé avant utilisation |
| 0,5-10 & micro ; L Pipette | BrandTech | 704770 | |
| 10 mL Pipette sérologique jetable | Corning | 4488 | |
| 1000 µ ; L Pointes de pipette filtrées | QSP | TF-112-1000-Q | |
| 100-1000 & micro ; L Pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| 100x20 mm Plaques | de coupe Sarstedt | 83.1802 | |
| 10-100 & micro ; L Pipette | BrandTech | 704774 | |
| 15 mL Tubes Coniques | Corning | 430791 | |
| 200 µ ; L Pointes de pipette filtrées | QSP | TF-108-200-Q | |
| 20-200 & micro ; L Pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| 50 mL Tubes coniques | Corning | 430828 | |
| CFX96 Real-Time C-1000 Thermocycleur | Bio-Rad | 184-1000 | |
| DMSO | Amresco | 0231 | |
| DNase/RNase Free Water | Zymo Research | W1001-1 | |
| EBER Amorces | Macrogen | N/A | Amorces sur mesure |
| Contrôle de l’ADN EBV (Normes) | Vircell | MBC065 | |
| Éthanol (qualité réactif de laboratoire) | Fischer Chemical | E/0600DF/17 | |
| Sérum de veau fœtal | Sigma | F9665 | |
| Fresco 21 MicroCentrifuge | Thermo Scientific | 10651805 | |
| Solution de glycogène | Qiagen | 158930 | |
| Hémocytomètre | BOECO | BOE 01 | |
| Microscope à lumière inversée | Zeiss | Axiovert 25 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | |
| Tube de microcentrifugation | Costar (Corning) | 3621 | Doit être autoclavé avant utilisation |
| P3HR-1 Cell Line | ATCC | HTB-62 | |
| Pénicilline-Streptomycine Solution | Biowest | L0022 | |
| Phénol | VWR | 20599.297 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Pipette Filler | Thermo Scientific | 9501 | |
| Lingettes de précision | Kimtech | 7552 | |
| RPMI-1640 Milieu de culture | Sigma | R7388 | |
| SL 16R Centrifugeuse | Thermo Scientific | 75004030 | |
| Acétate de sodium | Riedel-de Haë ; n (Honeywell) | 25022 | |
| Spectrophotomère | DeNovix | DS-11 | |
| Tris-HCl | Sigma | T-3253 | |
| Trypan Blue Solution | Sigma | T8154 | |
| Incubateur de CO2 à chemise d’eau | Thermo Scientific | 4121 |
Références
- Epstein, M. A., Achong, B. G., Barr, Y. M. Virus particles in cultured lymphoblasts from Burkitt's lymphoma. Lancet. 1 (7335), 702-703 (1964).
- Sample, J., et al. Epstein-Barr virus types 1 and 2 differ in their EBNA-3A, EBNA-3B, and EBNA-3C genes. <....
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Réimpressions et autorisations
