Article de méthode

Isolement et quantification du virus d’Epstein-Barr à partir de la lignée cellulaire P3HR1

DOI :

10.3791/64279

⸱

28 septembre 2022

 ,  , 
1Department of Experimental Pathology, Immunology and Microbiology, Faculty of Medicine, American University of Beirut, 2Center for Infectious Diseases Research (CIDR), Faculty of Medicine, American University of Beirut

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole permet d’isoler les particules du virus d’Epstein-Barr de la lignée cellulaire humaine P3HR1 lors de l’induction du cycle lytique viral avec le phorbol 12-myristate 13-acétate. L’ADN est ensuite extrait de la préparation virale et soumis à une PCR en temps réel pour quantifier la concentration de particules virales.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le virus d’Epstein-Barr (EBV), officiellement désigné comme herpèsvirus humain 4 (HHV-4), est le premier virus tumoral humain isolé. Près de 90 à 95% de la population adulte mondiale est infectée par le VEB. Avec les progrès récents de la biologie moléculaire et de l’immunologie, l’application de modèles expérimentaux in vitro et in vivo a fourni un aperçu approfondi et significatif de la pathogenèse du VEB dans de nombreuses maladies ainsi que de la tumorigenèse associée au VEB. L’objectif de cet article d’expérience visualisé est de fournir une vue d’ensemble de l’isolement des particules virales EBV à partir de cellules de la lignée cellulaire P3HR1, suivi d’une quantification de la préparation virale. Les cellules P3HR1, isolées à l’origine d’un lymphome de Burkitt humain, peuvent produire un virus P3HR1, qui est une souche de type 2 du VEB. Le cycle lytique EBV peut être induit dans ces cellules P3HR1 par traitement avec phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA), produisant des particules virales EBV.

En utilisant ce protocole pour l’isolement des particules EBV, les cellules P3HR1 sont cultivées pendant 5 jours à 37 °C et 5% de CO2 dans un milieu RPMI-1640 complet contenant 35 ng / mL de PMA. Par la suite, le milieu de culture est centrifugé à une vitesse de 120 x g pendant 8 min pour granuler les cellules. Le surnageant contenant le virus est ensuite recueilli et filé à une vitesse de 16 000 x g pendant 90 minutes pour granuler les particules EBV. La pastille virale est ensuite remise en suspension dans un milieu RPMI-1640 complet. Ceci est suivi par l’extraction de l’ADN et la PCR quantitative en temps réel pour évaluer la concentration de particules EBV dans la préparation.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le virus d’Epstein-Barr (EBV) est le premier virus tumoral humain à avoir été isolé1. Le VEB, officiellement appelé herpèsvirus humain 4 (HHV-4)2, fait partie de la sous-famille des virus de l’herpès gamma de la famille des virus de l’herpès et est le prototype du genre Lymphocryptovirus. Près de 90 à 95% de la population adulte mondiale est infectée par le virus3. Dans la plupart des cas, l’infection initiale survient au cours des 3 premières années de vie et est asymptomatique, cependant, si l’infection survient plus tard au cours de l’adolescence, elle peut donner lieu à une maladie appelée mononucléose infectieuse4. Le VEB est capable d’infecter les lymphocytes B au repos, les incitant à devenir des lymphoblastes B prolifératifs dans lesquels le virus établit et maintient un état d’infection latente5. Le VEB peut se réactiver à tout moment et ainsi entraîner des infections récurrentes6.

Au cours des 50 dernières années, l’association entre certains virus et le développement de tumeurs malignes humaines est devenue de plus en plus évidente, et on estime aujourd’hui que 15% à 20% de tous les cancers humains sont liés à des infections virales7. Les virus de l’herpès, y compris EBV, sont parmi les exemples les mieux étudiés de ces types de virus tumoraux8. En fait, le VEB peut causer de nombreux types de tumeurs malignes humaines, comme le lymphome de Burkitt (LB), le lymphome hodgkinien (LH), le lymphome diffus à grandes cellules B et les maladies lymphoprolifératives chez les hôtes immunodéprimés 9,10. Il a également été démontré que le VEB est associé au développement de maladies auto-immunes systémiques. Quelques exemples de ces maladies auto-immunes sont la polyarthrite rhumatoïde (PR), la polymyosite-dermatomyosite (PM-DM), le lupus érythémateux disséminé (LED), la maladie mixte du tissu conjonctif (MCTD) et le syndrome de Gougerot-Sjögren (SS)11. Le VEB est également associé au développement d’une maladie inflammatoire de l’intestin (MII)12.

Bon nombre de ces maladies peuvent être étudiées ou modélisées à l’aide de cultures cellulaires, de souris ou d’autres organismes infectés par le VEB. C’est pourquoi les particules EBV sont nécessaires pour infecter des cellules ou des organismes, que ce soit in vitro ou in vivo modèles13,14,15,16, d’où la nécessité de développer une technique permettant d’isoler les particules virales à faible coût. Le protocole décrit ici fournit des lignes directrices pour un moyen facile d’isoler de manière fiable les particules EBV d’une lignée cellulaire relativement accessible et de quantifier les particules en utilisant la PCR en temps réel, qui est rentable et facilement disponible pour la plupart des laboratoires. Ceci est en comparaison avec plusieurs autres méthodes qui ont été décrites pour isoler le VEB de différentes lignées cellulaires17,18,19,20.

P3HR-1 est une lignée cellulaire BL qui se développe en suspension et est infectée de manière latente par une souche EBV de type 2. Cette lignée cellulaire est productrice d’EBV et peut être induite à produire des particules virales. L’objectif de ce manuscrit est de présenter une méthode qui permet d’isoler les particules d’EBV de la lignée cellulaire P3HR-1, suivie d’une quantification du stock viral qui pourrait ensuite être utilisée pour des modèles expérimentaux de VEB in vitro et in vivo .

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA : Le VEB devrait être considéré comme une matière potentiellement dangereuse pour la biologie et devrait donc être manipulé dans un cadre de confinement de niveau de biosécurité 2 ou supérieur. Une blouse de laboratoire ainsi que des gants doivent être portés. S’il y a un risque d’éclaboussure, une protection oculaire doit également être envisagée. La procédure suivante devrait être effectuée dans une enceinte de sécurité biologique.

1. Compter les cellules P3HR1

  1. Centrifugation et remise en suspension des cellules
    1. Transvaser la suspension cellulaire d’une plaque de culture de 100 mm (ou fiole T-25) d’une culture cellulaire P3HR1 en cours à 80 % de confluence vers un tube conique de 15 mL. La densité d’ensemencement des cellules P3HR-1 est de 1 x 106 cellules/mL. Maintenir dans un milieu de culture RPMI complet (milieu de culture RPMI à 79 %, 20 % de sérum bovin fœtal, antibiotique Pen-streptococcique à 1 %) à 37 °C et 5 % de CO2, et passage tous les 3-4 jours.
    2. Centrifuger pendant 8 min à 120 x g. Après centrifugation, jeter le surnageant, remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de milieu de culture RPMI complet et bien mélanger (cette solution sera appelée suspension A).
  2. Préparation de la suspension cellulaire pour le comptage
    1. Préparer une suspension cellulaire B diluée en mélangeant 2 μL de suspension cellulaire A avec 8 μL de milieu de culture. Ajouter 10 μL de bleu de trypan à 0,4% à la suspension B pour obtenir la suspension C. Bien mélanger la préparation par pipetage doux.
  3. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre
    1. Placez un couvercle en verre sur l’hémocytomètre et chargez 10 μL de suspension C. Placez l’hémocytomètre au microscope optique et comptez le nombre de cellules qui ne sont pas colorées en bleu dans chacun des quatre quadrants de la chambre de l’hémocytomètre à l’aide de l’objectif de microscope 40x (Figure 1).
    2. Le bleu trypan colore les cellules mortes en bleu; Ne comptez pas ces cellules, ni les cellules qui touchent l’une des bords supérieure, inférieure, droite ou gauche de chaque quadrant hémocytométrique.
    3. Calculer la concentration de cellules par mL à l’aide de la formule suivante :
      figure-protocol-1
      REMARQUE: Le nombre de quadrants comptés est de quatre, et 10-4 mL est le volume des carrés sur l’hémocytomètre. Les quatre quadrants qui doivent être comptés sont représentés en vert sur la figure 1. Nombre total de cellules comptées dans la formule est la somme du nombre de cellules dans les quadrants 1, 2, 3 et 4. Les cellules représentées en bleu dans la figure 1 doivent être comptées, tandis que les cellules en rouge ne doivent pas être comptées car elles touchent les bordures supérieure, droite, inférieure ou gauche du quadrant.

figure-protocol-2
Figure 1 : Comptage cellulaire à l’aide d’une chambre hémocytométrique. Quatre quadrants sont comptés à l’aide d’un microscope optique; Ces quadrants sont représentés en vert. Nombre total de cellules La formule indiquée à l’étape 1.3.3 du protocole décrit ici correspond à la somme du nombre de cellules dans les quadrants 1, 2, 3 et 4. Les cellules indiquées en bleu doivent être comptées, tandis que les cellules en rouge ne doivent pas être comptées car elles touchent les bordures supérieure, droite, inférieure ou gauche du quadrant. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Préparation de l’assiette pour la culture

  1. Placer un volume de suspension cellulaire A dans un tube conique de 15 mL. Le volume requis dépend du nombre de cellules. Ajuster le volume de telle sorte que le nombre de cellules soit d’environ 2,2 x 106 cellules pour une plaque de culture de 100 mm.
  2. Ajouter 5 mL de milieu de culture complet dans le tube, puis transférer le contenu du tube sur une plaque de culture de 100 mm. Ajouter 80 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO) à la plaque de culture.
    REMARQUE: Le DMSO est sensible à la lumière, il doit donc être stocké dans un récipient résistant à la lumière ou recouvert d’un matériau opaque comme une feuille d’aluminium.
  3. Ajouter 350 μL de 1 mg/mL de phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) dans le tube. La concentration finale de PMA devrait être de 35 ng / mL et celle de DMSO devrait être de 0,08%.
    ATTENTION: Le PMA est toxique, corrosif et cancérigène, il doit donc être manipulé avec une extrême prudence. Le PMA est sensible à la lumière, il doit donc être stocké dans un récipient résistant à la lumière ou recouvert d’un matériau opaque comme une feuille d’aluminium.
  4. Ajouter 4,27 mL de milieu de culture pour que le volume total soit de 10 mL. Mélanger le contenu du tube en l’inclinant, puis transférer le contenu sur une plaque de culture de 100 mm. Laisser la plaque dans un incubateur de culture cellulaire pendant 5 jours à 37 °C, 5% CO2.

3. Induction et isolement des particules du virus d’Epstein-Barr

  1. Après 5 jours dans l’incubateur, centrifuger le contenu de la plaque à 120 x g pendant 8 min pour granuler les cellules. Récupérez le surnageant sans cellules contenant des virus et jetez la pastille cellulaire.
  2. Centrifuger le surnageant à 16 000 x g pendant 90 min à 4 °C pour enrober les particules virales. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille virale dans 5 mL de milieu de culture.
    REMARQUE : Une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) peut être utilisée pour remettre en suspension la pastille virale au lieu du milieu de culture.
  3. Aliquote : suspension virale obtenue en 20 tubes contenant chacun 250 μL de suspension virale. Conserver la suspension à -80 °C.

4. Extraction d’ADN à partir de particules virales

ATTENTION: Des précautions extrêmes doivent être prises lors de la manipulation du phénol, car il est toxique et corrosif et a la capacité de causer des brûlures graves. Le phénol est sensible à la lumière et s’oxyde au contact de la lumière ou de l’air. Conservez-le dans un récipient résistant à la lumière ou couvrez le tube de phénol avec un matériau opaque comme du papier d’aluminium.

  1. Séparation des protéines de l’ADN
    1. Ajouter 500 μL de phénol saturé en TrisCl à l’un des tubes de 250 μL. Ajouter 100 μL d’eau (pour augmenter le volume de la phase aqueuse) et bien vorter pour obtenir une émulsion rose. Centrifuger pendant 15 min à 9650 x g.
  2. Précipitation de l’ADN
    1. Prélever le surnageant (phase transparente, aqueuse) et le transférer dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 mL.
    2. Ajouter l’équivalent de 1/10 du volume d’acétate de sodium froid du surnageant (3 M, pH 5,2) et mélanger en pipetant de haut en bas. Ajouter 1 μL de glycogène à 20 mg/mL et mélanger par pipetage.
      REMARQUE: Cette étape est facultative, mais l’ajout de glycogène améliore la précipitation de l’ADN et facilite la visualisation de la pastille d’ADN.
    3. Ajouter trois fois le volume d’éthanol froid 100% du surnageant. Conserver à -80 °C pendant la nuit.
      REMARQUE: La procédure peut être arrêtée ici pour être reprise ultérieurement. L’échantillon peut être conservé à -80 °C pendant 1 h, ou bien pendant une nuit. Le stockage de nuit améliore la précipitation de l’ADN et est donc recommandé.
  3. Isoler l’ADN viral
    1. Le lendemain, centrifuger à 9650 x g pendant 15 min à 4 °C et jeter le surnageant pour obtenir une pastille d’ADN.
    2. Laver la pastille trois fois avec 1 mL d’éthanol froid à 70 %, centrifuger à 9650 x g pendant 15 minutes et jeter le surnageant.
    3. Sécher le granulé à l’air libre pendant environ 10 min. Remettez la pastille en suspension dans 10-50 μL d’eau distillée sans nucléase (selon la taille de la pastille d’ADN).
    4. Conserver les échantillons à -20 °C pour un traitement ultérieur ou à 4 °C pendant une nuit pour assurer une dissolution maximale de l’ADN suivie d’un stockage à -20 °C. Vous pouvez également passer directement à l’étape 5.

5. Vérification de la concentration et de la pureté de l’ADN

  1. Après avoir nettoyé le piédestal d’un microspectrophotomètre avec un essuie-glace délicat, chargez 1 μL de la préparation d’ADN.
  2. Notez la concentration de l’ADN dans l’échantillon. Vérifiez les rapports d’absorbance à la fois figure-protocol-3 et figure-protocol-4. L’ADN absorbera à 260 nm, les protéines à 280 nm et les substances organiques telles que le phénol absorberont à 230 nm. Un ratio de 1,8-2 est considéré comme suffisant pour la PCR en temps réel.

6. Quantification par réaction en chaîne de la polymérase en temps réel

  1. Préparation des mélanges réactionnels PCR
    1. Placer 5 μL d’un mélange de PCR en temps réel vert SYBR dans des tubes PCR de 0,2 mL. Ajouter à chaque tube 1 μL d’amorce avant de 7,5 pmol/μL et 1 μL d’amorce inverse de 7,5 pmol/μL. Séquence d’amorce avant : 5'-CCCTAGTGGTTTCGGACACA-3'; séquence d’amorce inverse : 5'-ACTTGCAAATGCTCTAGGCG-3'. Le gène amplifié pour déterminer le nombre de copies du génome EBV est le gène du petit ARN 2 du virus d’Epstein-Barr (EBER-2).
    2. Dans l’un des tubes, ajoutez 2 μL d’eau sans nucléase et 1 μL d’ADN viral de l’étape 4. Le volume total du mélange réactionnel est de 10 μL.
      NOTE: Selon la concentration d’ADN dans l’échantillon, une étape de dilution peut être nécessaire. Le facteur de dilution F doit être noté et sera intégré dans la formule de l’étape 6.3.
    3. Préparer d’autres tubes qui seront utilisés comme étalons avec des nombres de copies du génome EBV connus (1000, 2000, 5000, 10 000 et 54 000 copies).
  2. Exécuter les mélanges PCR en commençant par une étape initiale d’activation à 95 °C pendant 5 min, puis 40 cycles à 95 °C et 58 °C (recuit) pendant 15 s et 30 s, respectivement.
  3. Générer une courbe standard qPCR en traçant les valeurs Ct des étalons par rapport au logarithme du nombre de copies du génome EBV par tube standard. En utilisant l’équation standard du tracé de courbe, dérivez le nombre de copies du génome EBV dans le tube de PCR contenant l’ADN viral induit. Ensuite, utilisez la formule suivante pour calculer la concentration de la préparation virale induite:
    figure-protocol-5
    Où X est le nombre de copies du génome EBV dérivées de la courbe standard et F est le facteur de dilution utilisé pour mettre en place l’ADN utilisé par réaction PCR.

7. Contrôle de l’activité biologique/infectiosité des particules virales

  1. Transférer les cellules BC-3 d’une plaque de culture de 100 mm à 80 % de confluence vers un tube conique de 15 mL. La densité d’ensemencement des cellules P3HR-1 est de 1 x 106 cellules/mL. Maintenir dans un milieu de culture RPMI complet (milieu de culture RPMI à 79 %, 20 % de sérum bovin fœtal, antibiotique Pen-streptococcique à 1 %) à 37 °C et 5 % de CO2, et passage tous les 3-4 jours.
  2. Comptez les cellules BC-3 de la même manière que les cellules P3HR-1 ont été comptées en suivant l’étape 1. À une plaque de 96 puits, ajoutez 105 cellules BC-3 à chaque puits. Utilisez trois, six, neuf ou 12 puits pour vous assurer de l’importance des résultats et minimiser les erreurs.
  3. Ajouter un volume de stock viral à chaque puits, en fonction de la concentration de la préparation virale déterminée à l’étape 6.3. L’MOI peut varier, et l’optimisation de ce protocole révélera le meilleur MOI pour l’infection (une plage d’MOI de 2 à 50 est recommandée). Assurez-vous que le volume total du mélange présent dans chaque puits est de 250 μL.
    1. Pour déterminer le volume requis, il faut connaître la concentration du stock viral et choisir une MMO. Par exemple, si le MOI est de 2, le nombre de particules virales ajoutées doit être deux fois supérieur au nombre de cellules. Calculer le volume V du stock viral requis à l’aide de la formule suivante : figure-protocol-6, n étant le nombre de particules virales nécessaires et C la concentration connue du stock viral
  4. Incuber le contenu de la plaque de 96 puits pendant 5 jours. Après 5 jours, transférer le contenu de chaque puits dans un tube de 1,5 mL.
  5. Centrifuger les tubes à 120 x g pendant 8 min pour séparer les cellules du milieu de culture contenant le virus. Soumettre les pastilles cellulaires ainsi que les surnageants à une extraction d’ADN suivie d’une quantification par PCR en temps réel pour vérifier la présence de génomes viraux dans chaque fraction, évaluant ainsi l’infectiosité des particules virales.

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Résultats

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Le but de cette procédure est d’isoler les particules de VEB dans une suspension avec un titre viral connu, qui pourrait ensuite être utilisé pour modéliser l’infection par le VEB. Ainsi, il est de la plus haute importance d’utiliser des concentrations optimales des différents réactifs pour obtenir le rendement EBV le plus élevé de la procédure.

Un essai d’optimisation a été effectué pour déterminer les concentrations de PMA et de DMSO qui donneraient le plus grand nombre de particules EBV (

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La production de particules EBV est nécessaire pour comprendre la biologie de ce virus ainsi que ses maladies associées. Ici, nous avons décrit la production de ces particules à partir de la lignée cellulaire P3HR-1. Cette lignée cellulaire n’est pas la seule lignée productrice d’EBV; en fait, des particules d’EBV ont également été isolées à partir de cellules B95-821,22 ainsi que de la lignée cellulaire Raji18,19....

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le financement de ce travail a été soutenu par des subventions à ER du Fonds de recherche Asmar, du Conseil national libanais pour la recherche scientifique (L-CNRS) et du Medical Practice Plan (MPP) de l’Université américaine de Beyrouth.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tubes PCR à paroi mince de 0,2 mLThermo ScientificAB0620Doivent être autoclavés avant utilisation
0,2-10 & micro ; L Embouts filtrants MicrovolumeCorning4807Doit être autoclavé avant utilisation
0,5-10 & micro ; L PipetteBrandTech704770
10 mL Pipette sérologique jetableCorning4488
1000 µ ; L Pointes de pipette filtréesQSPTF-112-1000-Q
100-1000 & micro ; L PipetteEppendorf3123000063
100x20 mm Plaquesde coupe Sarstedt83.1802
10-100 & micro ; L PipetteBrandTech704774
15 mL Tubes ConiquesCorning430791
200 µ ; L Pointes de pipette filtréesQSPTF-108-200-Q
20-200 & micro ; L PipetteEppendorf3123000055
50 mL Tubes coniquesCorning430828
CFX96 Real-Time C-1000 ThermocycleurBio-Rad184-1000
DMSOAmresco0231
DNase/RNase Free WaterZymo ResearchW1001-1
EBER AmorcesMacrogenN/AAmorces sur mesure
Contrôle de l’ADN EBV (Normes)VircellMBC065
Éthanol (qualité réactif de laboratoire)Fischer ChemicalE/0600DF/17
Sérum de veau fœtalSigmaF9665
Fresco 21 MicroCentrifugeThermo Scientific10651805
Solution de glycogèneQiagen158930
HémocytomètreBOECOBOE 01
Microscope à lumière inverséeZeissAxiovert 25
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad172-5121
Tube de microcentrifugationCostar (Corning)3621Doit être autoclavé avant utilisation
P3HR-1 Cell LineATCCHTB-62
Pénicilline-Streptomycine SolutionBiowestL0022
PhénolVWR20599.297
Phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA)Sigma-AldrichP8139
Pipette FillerThermo Scientific9501
Lingettes de précisionKimtech7552
RPMI-1640 Milieu de cultureSigmaR7388
SL 16R CentrifugeuseThermo Scientific75004030
Acétate de sodiumRiedel-de Haë ; n (Honeywell)25022
SpectrophotomèreDeNovixDS-11
Tris-HClSigmaT-3253
Trypan Blue SolutionSigmaT8154
Incubateur de CO2 à chemise d’eauThermo Scientific4121

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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