Évaluation de l’activation des caspases pour évaluer la mort des cellules immunitaires innées

Joo-Hui Han; Rebecca E. Tweedell; Thirumala-Devi Kanneganti

doi:10.3791/64308

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Article de méthode

Évaluation de l’activation des caspases pour évaluer la mort des cellules immunitaires innées

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DOI :

10.3791/64308

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20 janvier 2023

Joo-Hui Han¹ , Rebecca E. Tweedell¹ , Thirumala-Devi Kanneganti¹

¹Department of Immunology, St. Jude Children's Research Hospital

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une méthode complète d’évaluation de l’activation des caspases (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9 et caspase-11) en réponse à des modèles in vitro et in vivo (chez la souris) d’infection, d’agressions stériles et de cancer pour déterminer l’initiation des voies de mort cellulaire, telles que la pyroptose, l’apoptose, la nécroptose et la panoptose.

Résumé

L’immunité innée fournit la première ligne de défense critique en réponse aux agents pathogènes et aux insultes stériles. Un élément mécaniste clé de cette réponse est l’initiation de la mort cellulaire programmée immunitaire innée (DCP) pour éliminer les cellules infectées ou endommagées et propager les réponses immunitaires. Cependant, l’excès de DCP est associé à une inflammation et à une pathologie. Par conséquent, la compréhension de l’activation et de la régulation de la DCP est un aspect central de la caractérisation des réponses immunitaires innées et de l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques à travers le spectre de la maladie.

Ce protocole fournit des méthodes pour caractériser l’activation immunitaire innée de la DCP en surveillant les caspases, une famille de protéases dépendantes de la cystéine qui sont souvent associées à diverses voies de PCD, y compris l’apoptose, la pyroptose, la nécroptose et la panoptique. Les rapports initiaux ont caractérisé la caspase-2, la caspase-8, la caspase-9 et la caspase-10 comme caspases initiatrices et la caspase-3, la caspase-6 et la caspase-7 comme caspases effectrices dans l’apoptose, tandis que des études ultérieures ont trouvé les caspases inflammatoires, caspase-1, caspase-4, caspase-5 et caspase-11, entraîner la pyroptose. On sait maintenant qu’il existe une diaphonie étendue entre les caspases et d’autres molécules immunitaires et de mort cellulaire innées à travers les voies de DCP précédemment définies, identifiant une lacune clé dans la compréhension mécaniste de l’immunité innée et de la DCP et conduisant à la caractérisation de PANoptosis. PANoptosis est une voie inflammatoire innée unique de PCD inflammatoire innée régulée par les complexes PANoptosomes, qui intègrent des composants, y compris des caspases, provenant d’autres voies de mort cellulaire.

Ici, des méthodes pour évaluer l’activation des caspases en réponse à divers stimuli sont fournies. Ces méthodes permettent de caractériser les voies de DCP in vitro et in vivo, car les caspases activées subissent un clivage protéolytique qui peut être visualisé par Western blot à l’aide d’anticorps et de conditions de buvard optimaux. Un protocole et un flux de travail de transfert Western ont été établis pour permettre l’évaluation de l’activation de plusieurs caspases de la même population cellulaire, fournissant une caractérisation complète des processus de DCP. Cette méthode peut être appliquée dans tous les domaines de recherche du développement, de l’homéostasie, de l’infection, de l’inflammation et du cancer pour évaluer les voies de la DCP tout au long des processus cellulaires de la santé et de la maladie.

Introduction

Le système immunitaire inné agit comme première ligne de défense pendant l’infection et en réponse à des stimuli stériles, tels que des lésions tissulaires et des altérations de l’homéostasie. Les capteurs immunitaires innés à la surface des cellules et dans le cytoplasme répondent aux schémas moléculaires associés aux agents pathogènes ou aux dommages (PAMP ou DAMP, respectivement) pour déclencher des voies de signalisation inflammatoires et des réponses cellulaires. L’un des processus clés de la réponse immunitaire innée est l’induction de la mort cellulaire pour éliminer les cellules infectées ou endommagées et stimuler d’autres réponses immunitaires innées et adap....