Article de méthode

Macro-imageur à vie de fluorescence pour applications biomédicales

DOI :

10.3791/64321

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7 avril 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biochemistry and Cell Biology, University College Cork, 2Cancer Research@UCC, University College Cork, 3Centre for Microscopy, Characterisation and Analysis (CMCA), The University of Western Australia, 4Physics Department, Brookhaven National Laboratory

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cet article décrit l’utilisation d’un nouvel imageur optique rapide pour l’imagerie macroscopique à vie par photoluminescence d’échantillons émettant de longues désintégrations. Les procédures d’intégration, d’acquisition d’images et d’analyse sont décrites, ainsi que la préparation et la caractérisation des matériaux du capteur pour l’imagerie et l’application de l’imageur dans l’étude d’échantillons biologiques.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cet article présente un nouvel imageur à durée de vie par photoluminescence conçu pour cartographier la concentration d’oxygène moléculaire (O2) dans différents échantillons phosphorescents allant des revêtements sensibles à l’état solide à l’O 2 aux échantillons de tissus animaux vivants colorés avec des sondes solubles sensibles à l’O2. En particulier, la sonde proche infrarouge à base de nanoparticules NanO2-IR, qui est excitable avec une diode électroluminescente (LED) de 625 nm et émet à 760 nm, a été utilisée. Le système d’imagerie est basé sur la caméra Timepix3 (Tpx3Cam) et l’adaptateur opto-mécanique, qui abrite également un intensificateur d’image. La microscopie d’imagerie à vie par phosphorescence O2 (PLIM) est couramment requise pour diverses études, mais les plates-formes actuelles ont des limites dans leur précision, leur flexibilité générale et leur facilité d’utilisation.

Le système présenté ici est un imageur rapide et très sensible, construit sur un capteur optique intégré et un module de puce de lecture, Tpx3Cam. Il est démontré qu’il produit des signaux de phosphorescence de haute intensité et des valeurs de vie stables à partir d’échantillons de tissus intestinaux colorés en surface ou de fragments du gros intestin colorés par voie intraluminale et permet la cartographie détaillée des niveaux de tissu O2 en environ 20 s ou moins. Des expériences initiales sur l’imagerie de l’hypoxie dans les tumeurs greffées chez des animaux inconscients sont également présentées. Nous décrivons également comment l’imageur peut être reconfiguré pour une utilisation avec des matériaux sensibles à l’O2 à base de colorants Pt-porphyrine à l’aide d’une LED de 390 nm pour l’excitation et d’un filtre passe-bande de 650 nm pour l’émission. Dans l’ensemble, on a constaté que l’imageur PLIM produisait des mesures quantitatives précises des valeurs de durée de vie des sondes utilisées et des cartes bidimensionnelles respectives de la concentration d’O2. Il est également utile pour l’imagerie métabolique de modèles tissulaires ex vivo et d’animaux vivants.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O2 est l’un des paramètres environnementaux clés pour les systèmes vivants, et la connaissance de la distribution deO2 et de sa dynamique est importante pour de nombreuses études biologiques 1,2,3. L’évaluation de l’oxygénation des tissus au moyen des sondes phosphorescentes 4,5,6,7,8 et PLIM 9,10,11,12,13 gagne en popularité dans la recherche biologique et médicale 3,9,14,15,16, 17,18,19. En effet, le PLIM, contrairement aux mesures de fluorescence ou d’intensité de phosphorescence, n’est pas affecté par des facteurs externes tels que la concentration de la sonde, le photoblanchiment, l’intensité de l’excitation, l’alignement optique, la diffusion et l’autofluorescence.

Cependant, les plates-formes PLIM O2 actuelles sont limitées par leur sensibilité, leur vitesse d’acquisition d’images, leur précision et leur facilité d’utilisation générale. Le comptage monophotonique corrélé dans le temps (TCSPC), combiné à une procédure de balayage raster, est fréquemment utilisé dans les dispositifs PLIM et FLIM (fluorescence lifetime imaging microscopy)20,21,22. Cependant, comme PLIM nécessite un long temps de séjour des pixels (de l’ordre de la milliseconde), le temps d’acquisition de l’image est beaucoup plus long que ce qui est requis pour les applications FLIM20,22,23. D’autres techniques, telles que les caméras CCD/CMOS fermées, manquent de sensibilité à un seul photon et ont de faibles fréquences d’images20,24,25,26. De plus, les systèmes PLIM existants sont principalement utilisés au format microscopique, tandis que les systèmes macroscopiques sont moins courants27.

L’imageur de macro PLIM28 basé sur TCSPC a été configuré pour surmonter bon nombre de ces limitations. La conception de l’imageur a été grandement facilitée par l’utilisation d’un nouvel adaptateur opto-mécanique, Cricket, qui a les éléments suivants: i) deux adaptateurs à monture C, qui permettent un couplage facile du module de caméra à l’arrière et de l’objectif de l’objectif à l’avant; ii) un boîtier interne pour un intensificateur d’image et une prise de courant pour ce dernier sur la face extérieure du grillon; iii) un espace interne derrière l’adaptateur à monture C de la face avant où un filtre d’émission standard de 25 mm peut être logé devant l’intensificateur; et iv) une optique de collimature lumineuse intégrée avec des régulateurs annulaires, qui permettent l’alignement optique / mise au point entre l’objectif et la caméra pour produire des images nettes sur la puce de l’appareil photo.

Dans l’imageur assemblé, le module de caméra est couplé à l’arrière de l’adaptateur Cricket, qui abrite également un intensificateur d’image composé d’une photocathode suivie d’une plaque à microcanaux (MCP), d’un amplificateur et d’un scintillateur rapide, le phosphore P47. Un filtre d’émission de 760 nm ± 50 nm est installé à l’intérieur du Cricket, et un objectif d’objectif, NMV-50M11'', est fixé à l’adaptateur de monture C de la face avant. Enfin, l’objectif et la caméra sont alignés optiquement avec des régulateurs annulaires.

Le rôle de l’intensificateur est de détecter les photons entrants et de les convertir en rafales de lumière rapides sur la puce de la caméra, qui sont enregistrées et utilisées pour générer des désintégrations d’émission et des images à vie. Le module de caméra comprend un réseau avancé de capteurs optiques basés sur TCSPC (256 pixels x 256 pixels) et une puce de lecture de nouvelle génération 29,30,31,32,33, qui permettent l’enregistrement simultané de l’heure d’arrivée (TOA) et du temps au-delà du seuil (TOT) des sursauts de photons à chaque pixel de la puce d’imagerie avec une résolution temporelle de 1,6 ns et un taux de lecture de 80 Mpixel / s.

Dans cette configuration, la caméra avec l’intensificateur a une sensibilité à photon unique. Il est axé sur les données et basé sur le système de lecture rapide du détecteur de pixels (SPIDR)34. La résolution spatiale de l’imageur était auparavant caractérisée par des capteurs O2 phosphorescents planaires et un masque de plaque de résolution. La fonction de réponse de l’instrument (IRF) a été mesurée par l’imagerie d’un capteur fluorescent planaire sous les mêmes réglages que ceux utilisés pour toutes les autres mesures. La durée de vie du colorant d’environ 2,6 ns était suffisamment courte pour qu’il puisse être utilisé pour la mesure IRF en mode PLIM. L’imageur peut imager des objets d’une taille maximale de 18 mm x 18 mm avec des résolutions spatiales et temporelles de 39,4 μm et 30,6 ns (pleine largeur à la moitié maximum), respectivement28.

Les protocoles suivants décrivent l’assemblage du macroimageur et son utilisation ultérieure pour cartographier la concentration d’O2 dans des échantillons biologiques colorés avec la sonde O2 proche infrarouge précédemment caractérisée,NanO2-IR 35. La sonde est une sonde de détection O2 brillante, photostable, perméable aux cellules, à base de colorant benzoporphyrine (PtBP) en platine (II). Il est excitable à 625 nm, émet à 760 nm et fournit une réponse optique robuste àO2 dans la gamme physiologique (0%-21% ou 0-210 μM de O2). Il est également démontré que l’imageur caractérise différents matériaux de capteur à base de colorants à porphyrine Pt(II). Dans l’ensemble, l’imageur est compact et flexible, similaire à un appareil photo commun. Dans la configuration actuelle, l’imageur est adapté à différentes applications PLIM grand champ. Le remplacement de la LED par une source laser rapide améliorera encore les performances de l’imageur et pourrait potentiellement permettre des applications FLIM nanosecondes.

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Protocole

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Toutes les procédures sur les animaux ont été effectuées en vertu d’autorisations délivrées par l’Autorité de réglementation des produits de santé (HPRA, Irlande) conformément à la directive du Conseil des Communautés européennes (2010/63/UE) et ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’expérimentation animale de l’University College Cork.

1. Préparation de l’échantillon

  1. Coloration avec la sonde d’échantillons de tissus vivants ex vivo
    1. Pour les applications ex vivo , utiliser des échantillons de tissus fraîchement isolés provenant de souris Balb/c femelles âgées de 4 semaines.
    2. Le jour de l’expérience, euthanasier une souris par décapitation et disséquer rapidement des fragments du côlon (gros intestin), d’environ 10 mm. Les laver immédiatement avec un tampon PBS, les placer dans un milieu DMEM complété par un tampon Hepes 10 mM (pH 7,2) et incuber à 37 °C36.
    3. Pour la coloration superficielle de la face sérosale de l’intestin, transférer les échantillons de tissus vivants dans une boîte en mini-boîte, appliquer 2 mL de DMEM complet contenant 1 mg/mL de sonde NanO2-IR pour couvrir les échantillons de tissus et incuber pendant 30 min à 37 °C.
      NOTE: Les cellules dans les tissus post-mortem restent vivantes pendant de nombreuses heures en culture. NaNO2-IR montre une cytotoxicité mineure, de sorte que toutes les expériences ont été complétées dans les 4 heures suivant l’isolement tissulaire.
    4. Pour la coloration intraluminale ex vivo des tissus profonds, transférer les morceaux de l’intestin dans une boîte de Petri sèche et éliminer tout excès de DMEM avec du papier filtre.
    5. Injecter 1 μL de DMEM contenant 1 mg/mL de NanO2-IR 35 dans la lumière à l’aide d’une seringue Hamilton et incuber les échantillons pendant15 minutes ou jusqu’à 4 h.
      REMARQUE : Le NaNO2-IR présente des effets cytotoxiques mineurs à long terme; Par conséquent, toutes les expériences doivent être terminées dans les 4 heures suivant l’isolement tissulaire.
  2. Préparation de tissus tumoraux colorés chez des animaux vivants
    1. Pour les applications in vivo , précolorer les cellules CT26 pendant 18 h dans un milieu sans sérum contenant une sonde NaNO2-IR à 0,05 mg/mL.
    2. Prendre une souris, raser la zone d’injection dans le flanc droit, et injecter avec une seringue 200 μL d’un mélange de 1 × 10 5 cellules non colorées et 1 × 105 cellules pré-colorées avec NanO2-IR.
    3. Permettre aux tumeurs de se développer chez les souris, en surveillant périodiquement la taille de la tumeur avec un pied à coulisse et le poids de l’animal37. Les animaux atteints de tumeurs greffées sont prêts pour l’imagerie le septième jour de la croissance tumorale.
      NOTE: Le volume tumoral a été calculé à l’aide de l’équation (1):
      V = (L × W 2)/2 (1)
      où L est le diamètre de la tumeur, et W is le diamètre perpendiculaire au diamètre L.
    4. Sacrifiez les animaux par luxation cervicale juste avant l’imagerie.

2. Configuration de l’imagerie PLIM

  1. Prenez l’adaptateur Cricket et retirez son adaptateur arrière à monture C pour accéder au boîtier de l’intensificateur à l’intérieur. Insérez l’intensificateur d’image MCP-125 dans ce compartiment et remettez l’adaptateur à monture C en place.
  2. Retirez l’adaptateur de monture C de la face avant du Cricket, insérez le filtre d’émission 760 nm ± 50 nm et réparez-le en remettant la monture C.
  3. Connectez le module de caméra Tpx3Cam à l’arrière du module Cricket via son adaptateur de monture C
  4. Connectez l’objectif à la face avant du module Cricket via son adaptateur à monture C.
  5. Montez l’ensemble de la caméra au-dessus de la boîte noire optique, face à la scène sur laquelle les échantillons seront imagés (Figure 1).
  6. Montez la LED super lumineuse de 624 nm sur un poteau connecté à une breadboard à l’intérieur de la boîte noire.
  7. Connectez la LED à une alimentation et à un générateur d’impulsions. Allumez la LED et concentrez-la pour assurer une excitation efficace et uniforme des échantillons imagés.
  8. Connectez la caméra à un autre générateur d’impulsions et synchronisez les impulsions envoyées à la caméra et au LED38.
  9. À l’aide du câble spécial et de la prise de l’unité Cricket, connectez l’intensifificateur à une alimentation standard et réglez le gain sur 2,7 V.
  10. À l’aide des capacités de mise au point de l’objectif et de l’adaptateur Cricket, concentrez l’optique de la caméra sur la scène d’échantillonnage pour générer des images claires des échantillons avec un bon contraste et une bonne luminosité.
  11. Pour une utilisation par imageur avec des colorants Pt-porphyrine, remplacez la LED 625 nm par une LED 390 nm pour l’excitation, et remplacez le filtre 760 nm ± 50 nm par un filtre 650 nm ± 50 nm dans le module Cricket.

3. Acquisition d’images

  1. Placez l’échantillon devant l’objectif de la caméra.
    REMARQUE: Utilisez une platine réglable x-y-z comme porte-échantillon afin d’ajuster la position de l’échantillon pour une bonne mise au point.
  2. Éteignez toutes les lumières de la pièce.
  3. Activez le logiciel Sophy pour régler les paramètres opérationnels, tels que la mise au point et l’alignement des échantillons.
    REMARQUE: Le logiciel Sophy est fourni avec la caméra pour configurer les paramètres d’imagerie et enregistrer les données. Assurez-vous que le logiciel est connecté à l’appareil photo en vérifiant le code de l’appareil photo. Cependant, nous avons utilisé un programme différent pour l’acquisition de données.
  4. Dans Modules, sélectionnez des images infinies et définissez le mode de fonctionnement des pixels sur le dépassement du seuil.
  5. Dans Modules, accédez à Aperçu, puis sélectionnez Module actif. La fenêtre Medpix/Timpix Frames s’ouvre .
  6. Dans cette fenêtre, modifiez l’échelle de couleurs et faites pivoter l’image dans l’orientation souhaitée.
  7. Allumez l’intensificateur et démarrez l’enregistrement.
    REMARQUE: Utilisez l’écran d’enregistrement du logiciel Sophy pour confirmer visuellement l’alignement et la mise au point de l’échantillon et pour optimiser les paramètres d’excitation LED pour l’enregistrement.
  8. Arrêtez l’enregistrement et fermez le logiciel Sophy.
  9. Accédez au terminal et utilisez le logiciel conçu sur mesure pour acquérir les données brutes au format binaire et les post-traiter (https://github.com/svihra/TimePix3).
    1. Dans le terminal, exécutez les commandes suivantes pour enregistrer les données :
      Document CD/SPIDR/trunk/Release/
       Ls
      ./Tpx3daq - i 1 - b 50 - m - s {Nom du fichier} - t {temps d’acquisition}
      Remarque : En tapant « ls », vérifiez la liste des fichiers dans le répertoire actif ; confirmez que Tpx3daq est visible.
    2. Attendez que toutes les images soient enregistrées.
    3. Pour traiter les données, exécutez les commandes suivantes dans le terminal :
      cd Documents/DataProcessing/Timepix3/Timepix3/
      racine
      . L dataprocess.cpp++
      .x DRGUI. C
    4. Attendez qu’une fenêtre RRGui s’ouvre. Sélectionnez toutes les variables à gauche et Toutes les données, Fichier unique et Centroïde à droite.
    5. Sélectionnez le fichier à traiter et exécutez le réducteur de données.
      Remarque : Tous les fichiers traités apparaîtront dans le même dossier que le fichier brut.

4. Analyse des données

  1. Analysez les données post-traitées avec un programme dédié écrit en langage C qui écrira les données dans un fichier image .ics (https://github.com/lmhirvonen/timepix3cam).
  2. Ouvrez les fichiers image .ics à l’aide du logiciel d’imagerie à résolution temporelle disponible gratuitement (voir le tableau des matériaux). Utilisez deux fonctions exponentielles pour s’adapter aux désintégrations de phosphorescence.
  3. Ouvrez les fichiers d’images .ics ajustés avec le logiciel d’analyse d’image disponible (voir Table des matériaux).
  4. À l’aide des tables de correspondance, générez des images de durée de vie de phosphorescence et codez-les dans une échelle de pseudo-couleur (par exemple, couleur bleue pour les courtes durées de vie et rouge pour les longues durées de vie). Utilisez la fonction Mesure pour calculer les valeurs moyennes de durée de vie de l’image entière ou des régions d’intérêt (ROI) spécifiques.
  5. Convertir les valeurs de durée de vie en concentration d’oxygène en utilisant l’équation obtenue à partir du réglage de l’étalonnage O2 de la sonde36.
    NOTE: L’équation (2) a été utilisée pour ce travail:
    O 2 [μM] = −86,16 + 770,35 × e−0,049 × LT (2)

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Résultats

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Pour les applications d’imagerie ex vivo , des fragments de tissus intestinaux ont été colorés par l’application topique de la sonde NanO2-IR sur la face sérossale du tissu. Pour une coloration plus profonde, 1 μL de la sonde a été injecté dans la lumière. Dans ce dernier cas, la paroi intestinale de 0,2 à 0,25 mm d’épaisseur protégeait la sonde de la caméra. Les deux procédés de coloration sont illustrés à la figure 2A.

L’intensité résultante et les imag...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les protocoles ci-dessus donnent une description détaillée de l’assemblage du nouvel imageur et de son fonctionnement en mode FLIM/PLIM à la microseconde. La caméra Tpx3Cam de nouvelle génération basée sur TCSPC, couplée au moyen de l’adaptateur opto-mécanique Cricket avec l’intensificateur d’image, le filtre d’émission et la macro-lentille, produit un module optique stable, compact et flexible facile à utiliser. L’imageur s’est avéré performant avec une gamme d’échantillons et de tâches analytiques différents, qui compr...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le soutien financier pour ce travail de la Science Foundation Ireland, des subventions SFI/12/RC/2276_P2, SFI/17/RC-PhD/3484 et 18/SP/3522, et de Breakthrough Cancer Research (Precision Oncology Ireland) est vivement apprécié.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
627 nmLED Parts ExpressPeut être remplacé par différentes LED en fonction de la longueur d’onde d’excitation du capteur. LED 390 nm utilisée pour les colorants Pt-porphyrine.
Filtre d’émission 760 ± ; 50 nmEdmund Optics84-788Peut être remplacé par un filtre différent en fonction de la longueur d’onde d’émission du capteur. Usagé 650 ± ; Filtre passe-bande 50 nm pour colorants Pt-porphyrine.
Souris Balb/cEnvigo, Royaume-UniBalb/c
Boîte noireThorlabsXE25C9/M
Cricket AdaptateurPhotonisCricket-2
CT26 cellules  ;ATCCCT26. WThttps://www.atcc.org/products/crl-2638
DMEMSigma-AldrichD0697 D’autressupports peuvent également être utilisés
Logiciel ImageJLogiciel d’analyse d’images gratuit. Téléchargeable à partir de : https://imagej.nih.gov/ij/index.html
intensificateur d’image MCP-125 avec écran phosphore P47PhotonisPP0360EF
Mini parabolesSarstedt83.3900.30035 mm de diamètre  ;
Film plastique Mylar, 75 micron² ;RS Ireland785-0795D’autres substrats en plastique peuvent également être utilisés
NanO2-IRfait maisonn/aLa sonde peut être synthétisée selon la méthode publiée 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. Imagerie in vivo de l’activité métabolique cérébrale à l’aide d’une sonde phosphorescente sensible à l’oxygène. J Méthodes Neurosci. 15 juin 2013 ; 216(2):146-51. DOI : 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 25 avril 2013. PMID : 23624034 ; PMCID : PMC3719178.' ou fourni par notre laboratoire.
NMV-50MObjectif 11" 50 mmNavitarD’autres objectifs compatibles avec les adateurs à monture C peuvent être utilisés
Plaque d’expérimentation optiqueThorlabsMB1836
Boîtes de PétriSarstedt82.1472.001Diamètre 92 mm
AlimentationTenma72-10495
Générateur d’impulsionsTenmaTGP110
SophyAmsterdam Scientific Instrumentsn/zFourni par ASI avec le Tpx3Cam
Tpx3CamAmsterdam Scientific InstrumentsTPXCAM
Tri2 SoftwareUniversity of Oxfordn/aFree Time Resolved Imaging software, peut être téléchargé à partir de : https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml
XYZ Translation StageThorlabsLT3

Références

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