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Hypersensibilité de contact comme modèle murin de dermatite de contact allergique

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DOI :

10.3791/64329

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26 septembre 2022

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1Department of Clinical Immunology, Wroclaw Medical University, 2Department of Medical Physiology, Chair of Biomedical Sciences, Institute of Physiotherapy, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, 3Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College

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Résumé

L’hypersensibilité de contact (SHC) est un modèle expérimental murin de dermatite de contact allergique (DCA). Le SHC est basé sur la sensibilisation à l’haptène réactif en peignant la peau rasée de la poitrine et de l’abdomen, avec un défi cutané ultérieur de l’oreille avec un haptène dilué, provoquant une réaction de gonflement qui est évaluée de diverses manières.

Résumé

L’hypersensibilité de contact (CHS) est un modèle expérimental de dermatite de contact allergique (DCA) qui peut être étudié chez la souris. Cette étude vise à présenter une méthode de laboratoire objective qui peut aider à étudier la réaction CHS chez la souris, qui peut être mesurée et quantifiée par divers tests. Pour induire le SHC, le jour « 0 », les souris ont été sensibilisées sur une tache précédemment rasée par peinture de la peau abdominale avec le 2,4,6-trinitrochlorobenzène (TNCB) haptène dans un mélange acétone-éthanol, tandis que les souris témoins négatives ont été sensibilisées avec un mélange véhicule seul-acétone-éthanol. Le jour « 4 », l’épaisseur de base de l’oreille a été mesurée avec un micromètre avant l’élicitation du SHC (défi) en peignant les deux oreilles avec de la TNCB diluée à la fois dans les groupes d’essai et témoin. Après 24 h, le gonflement de l’oreille a été mesuré avec un micromètre. Le SHC est un exemple de réponse immunitaire médiée par les lymphocytes T qui provoque un gonflement des tissus enflammés, culminant 24 heures après le défi cutané avec le même haptène. Une augmentation de l’œdème de l’oreille était corrélée à une augmentation du poids de l’oreille, à l’activité de la myéloperoxydase (MPO), à la concentration de cytokines pro-inflammatoires dans les extraits de l’oreille, à l’augmentation de l’épaississement du derme œdémateux lors de l’examen histologique et à la perméabilité vasculaire de l’oreille. Il y avait également une augmentation de la concentration d’anticorps IgG1 spécifiques du TNP dans le sérum du groupe test par rapport aux souris témoins. De plus, le SHC peut être transféré avec succès avec les cellules effectrices du SHC obtenues auprès de donneurs préalablement sensibilisés à la BNTN. Les cellules effectrices du SHC ont été administrées par voie intraveineuse à des souris receveuses naïves, qui ont ensuite été confrontées au même haptène dilué. L’enflure de l’oreille a été mesurée avec un micromètre 24 heures plus tard.

Introduction

La dermatite de contact allergique (DCA) est une maladie inflammatoire cutanée courante dans les pays industrialisés causée par une réaction d’hypersensibilité de type IV résultant de l’exposition à des produits chimiques de faible poids moléculaire appelés haptènes. Les substances qui provoquent la sensibilisation au contact chez l’homme comprennent les ions de métaux lourds (chrome, nickel, fer, cobalt), la térébenthine, les parfums, les colorants et les agents de conservation présents dans les cosmétiques (p. ex., p-phénylènediamine), certains médicaments (p. ex., néomycine, benzocaïne), les antibiotiques β-lactamine (p. ex., pénicilline), les produits chimiques produits par les plantes (pentadécacatéchol, une substance présente dans l’herbe à puce), ainsi que l’hydroquinone utilisée dans l’industrie photographique 1,2 . Les agents étiologiques ACD sont très élevés car plus de 100 000 produits chimiques sont utilisés dans l’industrie seulement, et 2 000 nouveaux sont synthétisés chaque année. À ce jour, plus de 3 700 molécules pouvant être des haptènes/allergènes de contact ont été identifiées3. La réaction d’hypersensibilité de contact (CHS) est un modèle expérimental de DCA qui peut être étudié chez la souris, les cobayes et les rats et peut être induit par l’application cutanée topique d’haptènes chimiques réactifs dissous dans des solvants organiques 4,5,6. Cette étude vise à décrire une méthode de laboratoire objective qui peut aider à étudier la réaction CHS chez la souris, qui peut être mesurée et quantifiée par divers tests.

Le SHC comprend des phases de sensibilisation (induction) et d’effecteur (défi). Dans les modèles animaux, les haptènes se lient d’abord de manière covalente aux protéines du corps pour créer des néoantigènes. Pendant la phase de sensibilisation, les kératinocytes activés favorisent la migration et la maturation des cellules dendritiques cutanées (SDC) en produisant des cytokines pro-inflammatoires-facteur de nécrose tumorale α (TNF-α) et de l’interleukine 1β (IL-1β)7. Les cellules de Langerhans épidermiques (LC) présentent des antigènes lors des phases d’induction et d’effecteurdu SHC 8. Les LC exposées à l’haptène pendant la sensibilisation favorisent l’induction des cellules régulatrices et effectrices9. De plus en plus de preuves provenant de plusieurs études suggèrent que les réponses au SHC peuvent être médiées par des cellules Th1 restreintes au CMH CD4+ de classe II, libérant localement de l’interféron γ (IFN-γ) pour utiliser un infiltrat inflammatoire caractéristique, des lymphocytes Tc1 restreints au CMH CD8+ de classe I qui peuvent également libérer des γ d’IFN, mais surtout médier les dommages cytotoxiques aux kératinocytes, et maintenant aussi des cellules Th17 productrices d’interleukine17 (IL-17) 10, 11.

Plusieurs modèles de SHC différents utilisant diverses espèces1 2,13,14 et haptènes ont été développés (une comparaison détaillée des différents haptènes, solvants et moments d’application est résumée dans le tableau 1). La souris, une espèce de laboratoire fréquemment utilisée, offre quelques avantages dans l’étude du SHC. Il y a plus de souches, de knockouts (KO) et d’animaux transgéniques chez les souris par rapport aux autres espèces, ce qui en fait un animal très attrayant15. De plus, le modèle CHS nécessite de nombreux animaux, et les souris sont plus économiques ici. Les modèles animaux n’imitent pas l’ACD dans tous les aspects; en particulier, ils présentent des croûtes et desquamations, ce qui n’est pas courant chez l’homme16,17. Les caractéristiques de la maladie chronique sont difficiles à reproduire, principalement parce que le modèle décrit ne suppose pas l’application de l’haptène pendant une longue période de temps. Cependant, il a été confirmé ici que de nombreux aspects importants de l’ACD sont reproduits. Il a également été démontré que, comme chez l’homme, ces caractéristiques sont associées à des réactions allergiques locales. Le choix de l’haptène, son solvant et son application décrits dans ce protocole ont été dictés par le fait que les résultats ont été confirmés par de nombreux tests in vitro et qu’il a été testé et modifié en laboratoire pendant de nombreuses années jusqu’à ce que la version actuelle soit établie. Les modèles murins permettent l’analyse des sous-ensembles cellulaires ou des cytokines qui sont impliqués dans le développement de la DCA et sont essentiels pour les évaluations précliniques de nouveaux traitements.

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Protocole

Toutes les expériences présentées dans cet article ont été menées selon les directives du 1er Comité local d’éthique sur l’expérimentation animale à Cracovie. Toutes les procédures décrites ont été effectuées conformément aux recommandations locales, en particulier en ce qui concerne l’utilisation de la kétamine / xylazine comme anesthésique, l’utilisation des deux côtés des oreilles pour appliquer la substance / haptène, couper l’oreille et prélever le sang par l’ablation du globe oculaire. BalB/c (haplotype H-2d), CBA/J (H-2k) et C57BL/6 (H-2b) souris mâles et femelles, âgées de 6 à 12 semaines, ont été utilisés pour la présente étude (voir tableau des matériaux). Pour la signification statistique, il est préférable que chaque groupe de souris se compose de 10 à 12 animaux.

1. Préparation des animaux

  1. Nettoyez la table d’opération avec une solution d’éthanol à 70% avant et après toutes les procédures. Si vous utilisez des souris qui nécessitent des conditions stériles, effectuez toutes les opérations dans une armoire de biosécurité.

2. Marquage des souris pour identification

  1. Étiquetez les souris en rasant la peau avec une lame de rasoir: #0 - non marqué, #2 - sur la patte avant droite, #3 - sur le côté droit, #4 - sur la patte arrière droite, #5 - à la base de la queue, #6 - sur la patte arrière gauche, #7 - sur le côté gauche, #8 - sur la patte avant gauche.
    REMARQUE: En raison de la réaction induite, les souris ne peuvent pas être marquées classiquement par un coup de poing ou un marquage à l’oreille. Les souris n’ont pas été anesthésiées lors de l’étiquetage.

3. Induction de la SHC

REMARQUE : Cette procédure est illustrée à la figure 1.

  1. Effectuez la sensibilisation (induction) en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Le jour « 0 », rasez les souris sur la poitrine et l’abdomen (carré 2 cm x 2 cm) en appliquant du savon gris avec de l’eau et en les rasant avec une lame de rasoir.
      REMARQUE: Avant d’appliquer hapten, attendez 6 h pour que la peau ne soit pas irritée.
    2. Préparer 5% haptène: 2,4,6-trinitrochlorobenzène (TNCB, voir Tableau des matériaux) dans un mélange acétone-éthanol (rapport 1:3) ou véhicule seul (acétone-éthanol). Préparez les solutions juste avant utilisation dans un flacon en verre et protégez-le de la lumière en recouvrant le flacon de papier d’aluminium.
    3. Le même jour, sensibilisez les souris en appliquant 150 μL d’haptène à 5% sur la tache préalablement rasée. Dans le groupe de souris témoins, appliquez le véhicule seul pour évaluer la réaction inflammatoire non spécifique. Avant de remettre l’animal dans la cage, attendez 30 s en laissant sécher l’haptène.
      ATTENTION : Utilisez des gants; La TNCB provoque une réaction allergique grave chez la plupart des gens.
  2. Effectuer une mesure de l’élicitation (défi) et de l’enflure de l’oreille.
    1. Le jour « 4 », préparer 0,4 % haptène : TNCB dans un mélange acétone-éthanol (rapport 1:1). Préparez la solution juste avant utilisation dans un flacon en verre et protégez-la de la lumière en recouvrant le flacon de papier d’aluminium.
    2. Anesthésier les souris avec une injection intrapéritonéale (i.p.) d’un mélange de kétamine (90-120 mg/kg) et de xylazine (5-10 mg/kg) (voir tableau des matériaux) pour une anesthésie profonde. Assurez-vous que la souris est entièrement anesthésiée pendant au moins 5 minutes par pincement des orteils.
    3. Mesurer l’épaisseur de l’oreille (mesure de 0 h, ligne de base) avec un micromètre (voir Tableau des matériaux) par un observateur ignorant les groupes expérimentaux.
    4. Appliquer 10 μL de 0,4 % d’haptène des deux côtés des oreilles dans les deux groupes (essai et contrôle). Avant de remettre l’animal dans la cage, attendez 30 s et laissez sécher l’haptène.
    5. Le jour « 5 », 24 h après l’application haptène, répétez les étapes 3.2.2-3.2.3 pour la mesure de 24 heures.
    6. Évaluer la réponse au SHC en calculant la différence d’épaisseur de l’oreille avant et après le défi avec l’haptène: 24 h d’épaisseur d’oreille (μm) - 0 h d’épaisseur d’oreille (μm). Comptez chaque oreille comme une mesure distincte. Ensuite, exprimez le gonflement de l’oreille en micromètres (μm) ± erreur-type de la moyenne (MEB) (tableau 2, figure 3).

4. Biopsies de l’oreille

  1. Directement après la mesure de 24 h de l’épaisseur de l’oreille (lorsque la souris est encore sous anesthésie profonde), coupez les oreilles le plus près possible du crâne avec des ciseaux. Prélever les biopsies du côté distal des oreilles en faisant un poinçon de 6 mm de diamètre à l’aide d’un poinçon de biopsie (voir tableau des matériaux).
    1. Mesurer le poids de l’oreille (étape 4.2) et effectuer en outre l’un des tests suivants sur la même biopsie de l’oreille : test de myéloperoxydase (MPO) (étape 4.3) ou mesure in vitro de la concentration de cytokines dans les extraits de l’oreille (p. ex. IFN-γ, IL-17A, TNF-α [étape 4.4]).
      REMARQUE: Coupez les oreilles avant la collecte de sang. Après cette procédure, les souris doivent être euthanasiées (par exemple, par luxation cervicale).
  2. Mesurer le poids de chaque biopsie de l’oreille sur la balance analytique et l’exprimer en milligrammes (mg) (Figure 4).
  3. Effectuez un test MPO en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Préparer un tampon d’homogénéisation en dissolvant 0,5% de bromure d’hexadécyltriméthylammonium dans un tampon de phosphorate de 50 mmol KH2PO4/Na2HPO4 et en ajustant le pH à 6,0 (utilisation à température ambiante, RT).
    2. Homogénéiser les biopsies dans des tubes de microcentrifugation de 2 mL avec 500 μL de tampon préparé pendant 10 min à l’aide d’un homogénéisateur avec des billes d’acier inoxydable de 5 mm de diamètre (ajouter deux perles/flacon) (voir Tableau des matériaux). Ensuite, refroidissez l’échantillon pendant 15 min à 4 °C et homogénéisez-le pendant 10 min supplémentaires.
      REMARQUE: Les tubes de microcentrifugation ont un fond rond afin que les perles puissent facilement se déplacer.
    3. Congeler les homogénats à −20 °C pendant 30 min. Dégel et vortex (s’assurer que les échantillons sont décongelés). Répétez cette procédure 3x.
    4. Centrifuger les homogénats à 3 000 x g pendant 30 min à 4 °C. Récoltez les surnageants avec une pipette. Exprimer l’activité du MPO en unités (U) par 1 mg de protéines.
      REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. Les échantillons sont stables à −20 °C pendant 3 mois.
    5. Pour mesurer l’activité du MPO, effectuer une réaction enzymatique en mélangeant 20 μL de surnageant et 200 μL de substrat MPO (0,167 mg/mL de dichlorhydrate d’orthodianisine dans 50 mmol de tampon KH2PO4/Na2HPO4 avec 5 x 10−4 % H202) et ajouter dans des plaques à fond plat de 96 puits. Incuber les plaques pendant 20 min à RT.
    6. Préparer la courbe standard en utilisant 20 μL de l’étalon MPO à des concentrations allant de 0,008 U à 0,5 U dans 200 μL du substrat MPO. Préparez l’échantillon vierge avec le substrat MPO seul.
      ATTENTION : Utilisez un masque lorsque vous travaillez avec du dichlorhydrate d’orthodianisine.
      REMARQUE: Les plaques doivent être en polypropylène, qui a une capacité de liaison inférieure afin que les protéines ou l’ADN ne se lient pas.
    7. Mesurer la densité optique (OD) à une longueur d’onde de λ = 460 nm. La réaction enzymatique est stable pendant 10 min. Lisez l’activité MPO dans les échantillons testés à partir de la courbe standard.
    8. Pour mesurer la concentration en protéines, utilisez 20 μL du surnageant, effectuez un test avec un kit d’acide bicinchoninique pour la détermination des protéines (voir tableau des matériaux) et mesurez la DO à λ = 562 nm (figure 5).
  4. Effectuer une mesure in vitro des cytokines dans l’extrait d’oreille.
    1. Homogénéiser les biopsies de l’oreille à RT dans des tubes de microcentrifugation de 2 mL avec 500 μL de réactif d’extraction des protéines tissulaires (T-PER) pendant 10 min à l’aide d’un homogénéisateur avec des billes en acier inoxydable de 5 mm de diamètre (ajouter deux perles/flacon). Ensuite, refroidissez l’échantillon pendant 15 min à 4 °C et homogénéisez-le pendant 10 min supplémentaires.
      REMARQUE: Les tubes de microcentrifugation ont un fond rond afin que les perles puissent facilement se déplacer.
    2. Centrifuger les homogénats à 3 000 x g pendant 30 min à 4 °C.
      REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. Les échantillons sont stables à −80 °C pendant 6 mois.
    3. Évaluer les niveaux de cytokines à l’aide d’un ensemble ELISA disponible dans le commerce (p. ex., IFN-γ) (voir la table des matériaux) en suivant les instructions du fabricant (figure 6).

5. Histologie du tissu auriculaire

  1. Directement après la mesure de 24 h de l’épaisseur de l’oreille, lorsque la souris est encore profondément anesthésiée, coupez les oreilles le plus près possible du crâne avec les ciseaux (étape 4.1).
    REMARQUE: Après cette procédure, les souris doivent être euthanasiées (par exemple, par luxation cervicale).
  2. Effectuez l’incorporation de paraffine des blocs de tissu en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Directement après le retrait, placez l’oreille dans ~ 10 mL de formol à 10% pendant 24 h.
    2. Placez les oreilles dans une cassette de traitement des tissus. Mettez les cassettes dans un processeur automatisé (voir Tableau des matériaux) pour les cycles de déshydratation (alcool 70%, 90%, 100%, 30 min chacun à RT), les cycles de nettoyage (xylène 3x, 30 min chacun à RT) et les cycles d’infiltration de cire (paraffine 3x, 30 min chacun à 56 °C).
    3. Retirez les cassettes du processeur automatisé et maintenez la plaque chauffante jusqu’à ce que cela soit nécessaire. Remplissez le moule à cire avec de la cire chaude (du distributeur).
    4. Retirez les sections de la cassette avec des pinces chauffées et placez-les dans le moule; Ensuite, placez la base de la cassette sur le dessus du moule, puis remplissez-la avec plus de cire. Placez-le dans de l’eau glacée sur une plaque froide pendant 30 min afin que la paraffine se solidifie pour former un bloc contenant l’échantillon.
    5. Utilisez un microtome rotatif (voir Tableau des matériaux) pour couper des sections d’environ 5 μm d’épaisseur. Faites flotter les sections dans un bain chaud pour les aplatir. Ramassez les sections sur une lame de microscope en verre. Laissez-les sécher à RT pour vous assurer que les sections adhèrent à la glissière.
      REMARQUE: Utilisez des lames qui éliminent le besoin d’appliquer des matériaux adhésifs ou des revêtements protéiques pour éviter la perte de sections de tissus pendant la coloration.
  3. Effectuer une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H & E).
    1. Préparez 17 plats de coloration avec les éléments suivants: xylène (quatre plats), 100% éthanol (alcool absolu) (quatre plats), 90% d’éthanol, 80% d’éthanol, 70% d’éthanol, 50% d’éthanol, PBS (trois plats), solution d’hématoxyline, solution d’éosine. Transférez les diapositives d’un plat à l’autre selon les étapes ci-dessous et effectuez le tout à RT.
      REMARQUE: La procédure dans chaque plat peut être répétée environ 10x (par exemple, si un plat de 20 lames est utilisé, 200 taches peuvent être faites sans changer les fluides).
    2. Déparaffiniser les sections par incubation à 65 °C pendant 30 min dans l’incubateur. Immergez les lames dans du xylène pendant 30 min. Répétez 1x dans du xylène neuf pendant 30 min.
    3. Immergez les lames dans de l’éthanol à 100% pendant 5 min. Répétez 1x dans de l’éthanol neuf à 100% pendant 5 min. Immerger les lames dans la rangée d’éthanol, à 90%, 80%, 70% et 50%, pendant 2 min dans chaque dilution.
    4. Immergez les lames dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant 5 min. Essuyez l’excès de liquide autour du tissu et de l’arrière des lames.
    5. Tacher les sections dans une solution d’hématoxyline (voir tableau des matériaux) pendant 7-8 min. Laver à l’eau courante pendant 30 s par l’arrière afin de ne pas endommager les sections. Répétez l’étape 5.3.4.
    6. Tacher les sections avec une solution d’éosine (voir tableau des matériaux) pendant 30 s. Lavez comme mentionné à l’étape 5.3.5, puis répétez l’étape 5.3.4.
    7. Immerger les lames dans de l’éthanol à 100 % (alcool absolu) pendant 2 min. Répétez 1x dans de l’éthanol neuf à 100% pendant 2 min.
    8. Immergez les lames dans du xylène pendant 5 min. Répétez 1x dans du xylène neuf pendant 5 min.
    9. Laissez sécher les sections à l’air libre pendant 15 min à RT. Ajoutez une goutte de support de montage (voir Tableau des matériaux) sur un couvercle, puis placez-le en haut de la section.
  4. Examinez la section au microscope optique sous un grossissement de 20x ou 40x et capturez des images (Figure 7).

6. Test de perméabilité vasculaire

REMARQUE: Alternativement à la mesure de l’épaisseur de l’oreille, un test de perméabilité vasculaire peut être effectué.

  1. Sensibilisez les souris le jour « 0 » (étapes 3.1.1 à 3.1.3), puis, le jour « 4 », anesthésiez les souris (étape 3.2.2) et appliquez directement l’haptène sur les oreilles (étape 3.2.4), en omettant la mesure de l’oreille de 0 h.
  2. À 23 h après le défi, anesthésiez les souris (étape 3.2.2).
  3. Injecter par voie intraveineuse (i.v.) 8,3 μL/g de poids corporel de colorant bleu Evans à 1 % (voir tableau des matériaux) dans la solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco.
  4. Anesthésier à nouveau les souris sous anesthésie profonde (étape 3.2.2)-1 h après l’injection de bleu d’Evans.
  5. Prélever des biopsies de l’oreille (étape 4.1).
    REMARQUE: Après cette procédure, les souris doivent être euthanasiées (par exemple, par luxation cervicale).
  6. Extraire le colorant du tissu, placer des poinçons d’oreille dans les tubes contenant 1 mL de formamide et incuber à 37 °C dans une atmosphère de 5 % de CO2 pendant 18 h.
  7. Centrifuger les biopsies à 3 000 x g pendant 3 min à RT. Prélever les surnageants avec une pipette.
  8. Mesurer la DO à une longueur d’onde de λ = 565 nm dans des plaques à fond plat de 96 puits contre un blanc contenant du formamide. La couleur est stable pendant 24 h. Lire la concentration des échantillons d’essai à partir de la courbe standard (utilisez les concentrations de bleu d’Evans allant de 0,2 à 30 μg de colorant/mL formamide) (Figure 8).
    REMARQUE: Les plaques doivent être en polypropylène, qui a une capacité de liaison inférieure afin que les protéines ou l’ADN ne se lient pas.

7. Collecte de sérum et mesure des anticorps anti-TNP immunoglobulines (IgG1)

  1. Après avoir prélevé des biopsies de l’oreille (étape 4.1), lorsque la souris est encore sous anesthésie profonde, retirez le globe oculaire avec une pince à épiler, exercez une légère pression sur la souris et collectez le sang du sinus rétro-orbitaire dans le tube (flacon avec gel pour obtenir du sérum, voir Tableau des matériaux). Une autre méthode de collecte de sang pourrait être de percer le cœur avec une seringue et de recueillir le sang.
    REMARQUE: Le sang doit être recueilli après avoir retiré les oreilles. La même méthode de saignement doit être utilisée dans toute une étude en raison de différences potentielles dans les paramètres sanguins18. Après cette procédure, les souris doivent être euthanasiées (par exemple, par luxation cervicale).
  2. Inverser un minimum de 6x, attendre 30 min pour que le sang coagule, puis centrifuger à 1 300-2 000 x g pendant 10 min à TA.
    REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. L’échantillon est stable à −20 °C pendant 6 mois.
  3. Enduire une plaque à fond plat de 96 puits avec 50 μL d’albumine sérique bovine conjuguée avec du 2,4,6-trinitrophényle (TNP-BSA) dissous dans du DPBS à une concertation de 10 μg/mL. Ensuite, enduire la deuxième plaque d’albumine sérique bovine (BSA) seule dissoute dans du DPBS (fond) à une concentration de 10 μg/mL. Incuber toute la nuit à 4 °C.
    REMARQUE: Le sérum de souris contient des anticorps (Abs) contre BSA, de sorte que les échantillons doivent être testés sur les deux plaques, et ensuite, un calcul doit être effectué (OD TNP-BSA - OD BSA).
  4. Laver les plaques avec 300 μL de DPBS contenant 0,05% Tween 20. Répétez 3x.
  5. Préparer le diluant d dosage (AD) : DPBS contenant 1 % de BSA. Bloquer les puits avec AD pendant 1 h à RT. Laver à nouveau (étape 7.4).
  6. Préparer un étalon interne (iSTD) : sensibiliser les souris à la TNCB (étapes 3.1.1-3.1.3) et, 10 jours après la sensibilisation, prélever et interroger le sérum de tous les donneurs (étapes 7.1 et 7.2).
  7. Ajouter à la plaque 50 μL de concentrations graduées d’iSTD diluées avec AD pour obtenir la courbe standard (décrite dans le tableau 3). Ajouter à la plaque 50 μL d’échantillons de sérum. Tester chaque échantillon et courbe standard sur les deux plaques (revêtues de TNP-BSA et de BSA). Incuber pendant 2 h à RT. Laver les plaques (étape 7.4).
  8. Ajouter 50 μL d’anticorps monoclonal IgG1 anti-souris biotinylé (mAb, voir Tableau des matériaux) dilué à 1:250 avec AD et incuber pendant 1 h à RT. Laver à nouveau (étape 7.4).
  9. Ajouter 50 μL de peroxydase streptavidine de raifort (streptavidine HRD, voir Tableau des matières) diluée 1:2000 avec AD, et incuber pendant 30 min à RT dans l’obscurité. Lavez la plaque (étape 7.4).
  10. Ajouter 50 μL de substrat TMB (voir Tableau des matériaux) et incuber pendant 30 min à RT dans l’obscurité.
  11. Arrêter la réaction enzymatique en ajoutant 25 μL de 1 MH2SO4; la réaction est stable pendant 30 min.
  12. Mesurer la DO à une longueur d’onde de λ = 450 nm et un fond de 570 nm (l’arrière-plan doit être soustrait de chaque mesure de 450 nm). Lors de la présentation des résultats, soustrayez les mesures BSA du TNP-BSA pour les échantillons et la courbe standard. Ensuite, calculez l’unité (U) des anticorps selon la courbe standard (Figure 9).

8. Transfert adoptif des cellules effectrices du CHS

REMARQUE : Cette procédure est illustrée à la figure 2.

  1. Donneurs (au ratio d’un donneur:1 receveur) : sensibiliser les souris à la TNCB le jour « 0 » (étapes 3.1.1 à 3.1.3).
  2. Le jour « 4 », anesthésiez l’anesthésie profonde des souris (étape 3.2.2).
  3. Isoler avec une pince les ganglions lymphatiques axillaires et inguinaux (ALN) et la rate (SPL). Regrouper les ALN dans un flacon et les SPL dans un autre.
    REMARQUE: Il y a un ganglion lymphatique axillaire derrière le muscle pectoral dans chaque aisselle. Un ganglion lymphatique inguinal dans la région de la hanche est situé à côté de trois vaisseaux sanguins. La rate est située sur le côté gauche du corps derrière l’intestin et l’estomac19. Travaillez avec des outils stériles dans une armoire de biosécurité pour maintenir des conditions stériles. Après cette procédure, les souris doivent être euthanasiées (par exemple, par luxation cervicale).
  4. Écraser du tissu entre les extrémités givrées de deux lames de microscope. Passer la suspension cellulaire à travers une passoire cellulaire d’une taille de pores de 70 μm (voir Tableau des matériaux).
  5. Lavez les cellules avec du DPBS complété par 1% de sérum fœtal bovin (FBS). Centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 °C. Décantez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire restante dans 1 à 5,0 mL de DPBS.
  6. Comptez les cellules vivantes à l’aide d’un hémocytomètre20 avec du bleu de Trypan et mélangez 10 μL de la suspension cellulaire avec 90-990 μL (selon le nombre de cellules) de bleu de Trypan. Tenez compte de la dilution lors du calcul du nombre de cellules (10x-100x).
  7. Préparer un mélange d’ALN et de SPL (rapport 1:1) : 8,0 x 106 jusqu’à 7,0 x 107/souris dans 200 μL de DPBS.
  8. Receveurs (souris syngéniques naïves) : anesthésier des souris receveuses naïves (étape 3.2.2) et injecter par voie intraveineuse un mélange préparé de cellules effectrices du CHS (étape 8.7). Dans le groupe témoin de souris, n’injectez aucune cellule.
  9. Mesurer l’épaisseur de l’oreille avant (0 h) et après (24 h) le défi (étapes 3.2.1 à 3.2.6) (figure 10).
  10. De plus, effectuer des tests sur des cellules effectrices CHS isolées (par exemple, phénotypage cellulaire ou mesure des cytokines produites par les cellules effectrices CHS par cytométrie en flux). Des cultures cellulaires peuvent également être établies, et la capacité des cellules effectrices du SHC à proliférer en présence de l’antigène ou de la quantité de cytokines sécrétées dans les surnageants de culture peut être évaluée21,22 (données non présentées).
    REMARQUE: L’exécution de tests supplémentaires nécessite en conséquence plus de donneurs de cellules.

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Résultats

Pour l’induction du SHC, les animaux ont été sensibilisés par peinture cutanée (abdominale) avec 150 μL de TNCB à 5 % ou simulés sensibilisés avec le véhicule seul. Le jour « 4 », les réponses de gonflement de l’oreille des deux oreilles ont été induites par peinture de contact (défi) avec 10 μL de 0,4 % de TNCB chez les souris précédemment sensibilisées au TNCB (groupe test) et les souris du groupe témoin (simulacre sensibilisées). Les données présentées montrent que les souris sensibilisées à la TNCB et défiée...

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Discussion

Le SHC est induit par des haptènes, qui se lient aux antigènes auto-protéiques de la peau, créant des néoantigènes. Le SHC est médié par le recrutement extravasculaire local de lymphocytes T effecteurs CHS spécifiques de l’antigène circulant, ce qui entraîne un gonflement du tissu déficient, culminant 24 heures après l’exposition de la peau secondaire au même haptène6. Le gonflement du tissu est principalement causé par l’infiltration de leucocytes et le dépôt de fibrine dépendant des leu...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette étude a été soutenue par la subvention SUBZ. A020.22.060 de l’Université de médecine de Wroclaw, en Pologne, et par des subventions du ministère des Sciences et de l’Enseignement supérieur N N401 545940 à MS et IP2012 0443 72 à MMS.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
70 % d’éthanolMerck KGaA, Darmstadt, Allemagne65350-Mpour la désinfection des surfaces
Plaques à fond plat à 96 puits, polypropylèneGreiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Autriche655101pour la mesure du MPO et du bleu d’Evans - les plaques doivent être en polypropylène, qui a une capacité de liaison plus faible afin que les protéines ou l’ADN ne se lient pas à l’acétone
(réactif ACS, &ge ; 99,5 %)Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne179124
Feuille d’aluminiumMerck KGaA, Darmstadt, AllemagneZ185140
Balance analytiqueSartorius Weighing Technology GmbH, Göttingen, AllemagnePRACTUM224-1s, 29105177
Processeur de tissu automatiséMediMeas Instruments, Sarsehri, Haryana, IndeMTP-E-212préparer automatiquement des échantillons de tissus en les fixant, déshydratant, effaçant et les infiltrant avec de la paraffine
BD Vacutainer SST II Advance (tube avec gel pour obtenir du sérum)Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, USABD
Kit d’acide bicchoninique pour la détermination des protéinesMerck KGaA, Darmstadt, AllemagneBCA1-1KT
Biotine Rat Anti-souris IgG1Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, États-Unis553441
BSA (albumine sérique bovine)Merck KGaA, Darmstadt, AllemagneA9418, 2 mg/mL
Passoire cellulaire, taille des pores 70 &mu ; mBIOLOGIX, Chine15-1070convient aux tubes de 50 mL
CoverslipVWR, Radnor, Pennsylvanie, États-Unis631-158324 mm, mais il est possible d’utiliser des pipettes de différentes tailles
Capacité : 5 mL, 10 mL, 25 mLMerck KGaA, Darmstadt, AllemagneZ740301, Z740302, Z740303
DPBS (Dulbecco&prime ; s phosphate tamponné salin)ThermoFisher Scientific,  ; Waltham, Massachusetts, États-Unis14190144sans calcium, sans magnésium, culture cellulaire
de mammifère DPX Mountant pour l’histologieMerck KGaA, Darmstadt, Allemagne6522milieux de montage pour H-E, peut être utilisé d’autres par exemple, baume du Canada
Dumont 5 pince à épiler - droiteAnimalab, Poznan, Pologne11251-10FSTinstruments chirurgicaux pour les procédures sur souris (doit être stérilisé)
Pince à épiler Dumont 7 - courbéeAnimalab, Poznan, Pologne11272-50FSTInstruments chirurgicaux pour les interventions sur les souris (doivent être stérilisés)
Solution d’éosine Y, alcooliqueMerck KGaA, Darmstadt, AllemagneHT110116
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1,5 mLEppenforf, Allemagne3,01,20,086polypropylène
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2,0 mLEppenforf, Allemagne3,01,20,094polypropylène, fond rond (les billes d’homogénéisation peuvent facilement bouger)
Éthanol 100 % (alcool absolu)Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne1.07017
Éthanol 96 %Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne1.59010
Evans blueMerck KGaA, Darmstadt, AllemagneE2129
FBS (sérum de bovin fœtal)ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, États-Unis
Solution de formol, tamponnée neutre, 10 %Merck KGaA, Darmstadt, AllemagneHT501128
Formamide 99,5 % (GC)Merck KGaA, Darmstadt, AllemagneF7503
Congélateur -20 ° ; CBosch, AllemagneGSN54AW30
Réfrigérateur +4 ° ; C / congélateur -20 ° ; CBosch, AllemagneKGV36V10culture cellulaire de mammifères, qualifié, Brésil, 10 x 50 mL
Lames microscopiques en verre, SuperFrost PlusVWR, Radnor, Pennsylvanie, États-Unis631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449Lames qui éliminent le besoin d’appliquer des matériaux adhésifs ou des revêtements protéiques, pour éviter toute perte de sections de tissu pendant la coloration.
Bloc-notes graphique PrismGraphPad Software Inc.v. 9.4.0
Savon grisPollena Ostrzeszó ; w, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o. , Sp. K., PolognePain de savon Bialy jelengris Pain de savon Naturel Hypoallergénique. Produit généralement disponible
H2SO4 (acide sulfurique) 1 mol/l (1 M)Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne1.60313
Harris hematoxylin solutionMerck KGaA, Darmstadt, AllemagneHHS16
HémocytomètreVWR, Avantor, U.S.A612-5719la chambre de comptage manuel est recommandée, qui est plus précise
Hexadécyltriméthylammonium bromureMerck KGaA, Darmstadt, AllemagneH5882
QIAGEN Hilden, AllemagneTissue Lyser LT, SN 23.1001/05234Homogénéisateur avec billes en acier inoxydable (diamètre 5 mm) pour tubes à centrifuger de 2 mL Raifort
peroxydase streptavidine (HRP streptavidin)Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USASA-5004-1
Solution de peroxyde d’hydrogène (H202)Merck KGaA, Darmstadt, AllemagneH1009
Incubateur Heracell 150iThermo Electron LED Gmbh, Allemagne4107106837 oC dans l’atmosphère de 5 % CO2, et 65 0C pour la déparaffinisation les coupes pour histologie
Kétamine 100 mg/mL, solution injectableBiowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Polognecat.# non disponible
KH2PO4 (dihydrogénophosphate de potassium) 99,995 % base anhydreMerck KGaA, Darmstadt, Allemagne1.05108
Centrifugeuse de laboratoireHeraeus Megafuge 1.0R, Thermo Scientific, AllemagneB00013899vitesse à 300 x g, avec refroidissement à 4 0C
Centrifugeuse de laboratoireHeraeus Fresco 21, Thermo Scientific, Allemagne75002425vitesse à 3 000 x g, avec refroidissement à 4 0C
Mask (FFP2)VWR, Radnor, Pennsylvanie, États-Unis111-0917pour le travail avec le dichlorhydrate d’ortho-dianisine
Unitéd’élevage de souris de la Chaire des sciences biomédicales, Faculté des sciences de la santé, Collège médical de l’Université Jagellonne, Cracovie, PologneCBA/J, C57BL/6
MicromètreMitutoyo, Tokyo, JaponMicromètre extérieur à 193-111chiffres, butée à cliquet, plage de 0 à 25 mm, graduation de 0,001 mm, précision de +/- 0,002 mm, https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml   ;
microplaque, 96 puits, microlon, liaison élevée (pour le test ELISA)Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Autriche655061avec surfaces de liaison maxi-sorp pour des résultats fiables et reproductibles dans les tests colorométriques
Microscope avec objectifsLeica Microsystems CMS GmbH, AllemagneDM1000, 294011-082007l’histologie présentée dans l’article a été réalisée sous le système d’imagerie ThermoFisher Scientific EVOS M5000, avec les objectifs : FL 20X LWDPH, 0.40NA/3.1WD et FL 40X LWDPH 0.65NA/1.79WD
Myéloperoxydase à partir de leucocytes humains (norme MPO)Merck KGaA, Darmstadt, AllemagneM6908
Na2HPO4 x 7 H2O (phosphate de sodium dibasique heptahydraté)Merck KGaA, Darmstadt, AllemagneS9390
Huile d’oliveMerck KGaA, Darmstadt, Allemagne75343pure, naturelle
OptEIA Souris IFN-&gamma ; Kit ELISABecton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, États-Unis555138
Chlorhydrate d’ortho-dianisineMerck KGaA, Darmstadt, AllemagneD3252
Cire de paraffineMerck KGaA, Darmstadt, Allemagne76242billes, solide cireux
PBS (solution saline tamponnée au phosphate)ThermoFisher Scientific,  ; Waltham, Massachusetts, États-Unis20012027pH 7,2, pH-mètre pour culture de cellules de mammifères
Elmetron, PologneCP-401
Pipettes, volume variable avec emboutsMerck KGaA, Darmstadt, AllemagneEP3123000900-1EAPaquet de 3, Option 1, 0,5-10 uL/10-100 uL/100-1000 uL, comprend epT.I.P.S.
Lame de rasoirVWR, Radnor, Pennsylvanie, États-UnisPERS94-0462Lames de grattoir et de coupe, simple tranchant, dos en aluminium, 100 lames par boîte, emballées individuellement
Microtome rotatifMRC Laboratory-Instruments, Essex, CM20 2HU UKHIS-202A
Ciseaux - droits, tranchants / tranchantsAnimalab, Poznan, Pologne14060-10FSTInstruments chirurgicaux pour les interventions sur souris (doivent être stérilisés)
Bouchon à vis (à toit ouvert)Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne27056capuchon à trous en polypropylène noir, à utiliser avec 22  ; Flacon mL avec filetage 20-400
SpectrophotomètreBioTek Instruments, U.S.A201446spectrophotomètre universel à microplaques : &lambda ; plage : 200 - 999 nm, plage de mesure de l’absorbance : 0.000 - 4.000 Abs
Plat de coloration 20 lames avec supportMerck KGaA, Darmstadt, AllemagneS6141par exemple 20 boîtes de coloration de lames complètes avec couvercles, support de lames et poignée
Poinçon de biopsie stérile jetable 6mmIntegra LifeSciences, Princeton, NJ,États-Unis 33-36
Ciseaux chirurgicauxAnimalab, Poznan, Pologne52138-46Instruments chirurgicaux pour interventions sur souris (doivent être stérilisés)
Cassettes de traitement des tissusMerck KGaA, Darmstadt, AllemagneZ672122Cassettes de traitement/enrobage de tissus avec couvercle
Ensemble de réactifs de substrat TMBBecton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, États-Unis555214
TNCB (2,4,6-trinitrochlorobenzène)Tokyo Chemical Industry CO., LTD, JaponC0307
TNP-BSA (albumine sérique bovine conjuguée à la 2,4,6-trinitrophényle)Biosearch Technologies LGC, Petaluma, CA,États-Unis T-5050
T-PER (réactif d’extraction de protéines tissulaires)ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, États-Unis78510
Tubes stériles 15 mLMerck KGaA, Darmstadt, AllemagneCLS430055 (Corning)polypropylène, fond conique
Tubes 50 mL,stériles Merck KGaA, Darmstadt, AllemagneCLS430290 (Corning)polypropylène, fond conique
Tween 20Merck KGaA, Darmstadt, AllemagneP1379
Flacons, à vis vis, verre transparent (flacon uniquement) 22 mLMerck KGaA, Darmstadt, Allemagne27173pour la préparation de l’haptène, vissé de manière à ce qu’il ne s’évapore pas
Bain-marieAJL Electronic, PologneLW102
Distributeur de cire (paraffine)VWR, Radnor, Pennsylvanie, États-Unis114-8737
Xylazine (xylapan 20 mg/mL) solution injectableVetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Polognecat.# non disponible
Xylène (grade histologique)Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne534056
366882 Dosages et analyses des protéines A3160802 Homogénéisateur

Références

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Erratum


Formal Correction: Erratum: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis
Posted by JoVE Editors on 1/19/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis. The Protocol and Representative Results sections were updated.

Step 3.2.1 of the Protocol has been updated from:

On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone-ethanol mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.

to:

On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone: olive oil mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.

Figure 1 of the Representative Results has been updated from:

Mouse ear thickness measurement experiment diagram; TNCB-induced dermatitis comparison.
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Mice sensitization process; diagram of control/test groups, TNCB application, ear thickness measurement.
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 2 of the Representative Results has been updated from:

CHS induction in mice using TNCB, diagram showing sensitization, i.v. cell transfer, ear measurement.
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Mouse sensitization and TNCB application diagram; CHS study setup with control and test groups.
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

Mots-clés

R ponse des lymphocytes Tgonflement de l oreillesensibilisation au hapt nedosage de la my loperoxydaseperm abilit vasculairetransfert de cellules effectricesisolement des ganglions lymphatiques

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