Article de méthode

Détection de cible basée sur des aptamères facilitée par une réaction d’amplification exponentielle isotherme G-quadruplex en 3 étapes

DOI :

10.3791/64342

⸱

6 octobre 2022

 ,  , 
1Aptagen LLC

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le présent protocole démontre l’utilisation d’un test d’amplification exponentielle rapide en 3 étapes, basé sur des aptamères, pour détecter des cibles. La préparation des échantillons, l’amplification du signal et le développement de la couleur sont couverts pour mettre en œuvre ce système afin de reconnaître la présence de théophylline par rapport à celle de la caféine.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les aptamères sont des molécules de reconnaissance de cibles qui se lient avec une affinité et une spécificité élevées. Ces caractéristiques peuvent être exploitées pour contrôler d’autres molécules ayant une capacité de génération de signal. Pour le système décrit ici, la reconnaissance de cible par un domaine aptamérique, Stem II d’un ribozyme à tête de marteau modifié, active le ribozyme auto-clivant en stabilisant la construction initialement non structurée. L’ARN clivant le cis agit à la jonction de la tige III et de la tige I, créant deux produits de clivage. Le produit de clivage plus long amorce une réaction d’amplification exponentielle isotherme (EXPAR) des deux G-quadruplexes catalytiquement actifs similaires. Ces produits d’amplification qui en résultent catalysent la réduction de la peroxydase, qui est couplée à la réduction d’un substrat colorimétrique avec une sortie que l’œil nu peut détecter. Le système en 3 parties décrit dans la présente étude améliore les modalités de détection telles que les tests immuno-enzymatiques (ELISA) en produisant un signal visuellement détectable pour indiquer la présence de théophylline aussi faible que 0,5 μM en aussi peu que 15 minutes.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les aptamères sont généralement de l’ADN ou de l’ARN simple brin sélectionnés par un processus évolutif avec une affinité et une spécificité de liaison élevées pour les cibles souhaitées1. En plus de la capacité de liaison, les aptamères peuvent être reliés et contrôler des motifs avec des fonctions signal-sortie2,3, amplifiant ledit signal et améliorant la sensibilité du système. Le système de réaction d’amplification exponentielle isotherme G-quadruplex (GQ-EXPAR) est un système en trois parties (Figure 1) qui développe un signal visuel lorsque des composants successifs sont ajoutés à une seule cuve de réaction pour produire une sortie visuelle4. Ce système permet la détection d’une cible spécifique, la théophylline, dans un échantillon donné en 15 minutes en utilisant un flux de travail rationalisé pour permettre une détection rapide et spécifique d’une cible d’intérêt. Cette méthode doit être envisagée pour les échantillons pour lesquels la quantification spécifique de la concentration cible est moins préoccupante que la spécificité élevée de la réponse dans un court laps de temps.

Un riboswitch allostérique, une molécule d’ARN à changement de structure (ribozyme) qui subit un auto-clivage, produit le signal initial. Cette construction est basée sur le ribozyme requin-marteau, avec un domaine aptamique introduit dans Stem II comme régulateur de l’activité de clivage. Sa fonction d’auto-clivage est activée lorsque son domaine aptamique est stabilisé lors de la liaison à sa cible5. Sinon, le commutateur est inactif dans son état natif.

La réaction d’amplification exponentielle suivante (EXPAR) utilise la libération du brin d’ARN auto-clivé du premier étage pour amorcer une réaction d’amplification isotherme6. Le produit d’amplification d’EXPAR a une activité peroxydase7, servant de base à la dernière étape du système. Lorsque certains substrats sont oxydés en conjonction avec la dégradation du peroxyde, ils produisent une sortie fluorescente qui peut être mesurée sur divers instruments. D’autres substrats courants peuvent être substitués pour produire un produit coloré pour la détection visuelle. EXPAR et l’activité peroxydase de ses produits d’amplification agissent comme un amplificateur de signal à 2 étages, augmentant la sensibilité à des niveaux plus élevés par rapport aux stratégies conventionnelles 7,8.

La détection de la théophylline par rapport à la caféine est utilisée comme exemple de la spécificité de cette plateforme de détection, car ils ne diffèrent que par un seul groupe méthyle (Figure 2). Cette démonstration du système produit une sortie colorimétrique pour la détection visuelle d’au moins 500 nM de théophylline.

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Protocole

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Voir le tableau supplémentaire 1 (tableau de configuration de la réaction) pour la préparation des tubes, y compris les volumes et concentrations spécifiques des composants de la réaction. Le protocole illustré ici utilise un kit de plate-forme de détection préassemblé tel que décrit dans le tableau des matériaux. Tous les composants doivent être conservés sur la glace, sauf indication contraire.

1. Préparation du ribozyme

REMARQUE : La principale composante de détection est un ribozyme allostérique (régulé par aptamère) reconnaissant la théophylline (voir le tableau supplémentaire 2).

  1. Recueillir 5 U de polynucléotide kinase T4 (0,5 μL, voir le tableau des matériaux) dans un tube de PCR, qui sera utilisé pour activer les produits de clivage du ribozyme.
    REMARQUE: Ce composant est ajouté en premier afin que l’utilisateur puisse voir la distribution correcte de l’enzyme.
  2. Ajouter 1 μL de tampon de ribozyme 5x prépréparé (voir le tableau des matériaux) à chaque tube à échantillon (tube PCR).
  3. Afin de démontrer visuellement la spécificité, ajouter 1,5 μL de théophylline 2 mM (cible) ou 2 mM de caféine (témoin) (voir le tableau des matériaux) à chaque tube à échantillon comme échantillons d’essai.
    NOTA: Pour établir une courbe standard, il est recommandé de commencer à 3,125 mM d’analyte et d’effectuer des essais de dilutions quintuples jusqu’à 0,001 mM.
  4. Bien mélanger chaque tube d’échantillon en pipetant 5 à 10 fois.
  5. Ajouter 2 μL d’ARN de 600 nM contenant un domaine aptamique spécifique à la cible (voir le tableau des matériaux) à chaque tube d’échantillon pour obtenir une concentration finale de 240 nM dans 5 μL de solution d’essai, puis mélanger rapidement par pipetage et placer sur un bloc froid pour minimiser le signal de fond.
    NOTE: il est important de préparer initialement toutes les réactions sans ribozyme, car la réaction d’auto-clivage commencera immédiatement lorsque le ribozyme est combiné avec le tampon ribozyme et peut produire un fond significatif.
  6. Une fois tous les tubes de réaction préparés, incuber chaque échantillon (5 μL) à température ambiante (23 °C) pendant exactement 3 minutes à l’aide d’une minuterie. Remettre immédiatement les tubes à échantillon dans la glace (4 °C) après l’incubation.

2. GQ-EXPAR

  1. Ajouter 3,5 μL de mélange enzymatique nickase-polymérase (voir le tableau des matières) à chaque tube à échantillon et bien mélanger.
    NOTE: Les concentrations enzymatiques requises dépendent des séquences de reconnaissance, des types d’enzymes et des températures de réaction, dont la combinaison a été déterminée empiriquement.
  2. Ajouter 31,5 μL de mélange réactionnel EXPAR contenant un gabarit, des nucléotides et un tampon de réaction (voir le tableau des matériaux) à chaque tube d’échantillon et pipette à mélanger.
    NOTE: Les concentrations des composants sont optimisées en fonction des enzymes et des séquences des produits polymérases.
  3. Une fois tous les échantillons préparés, incuber chaque échantillon préparé (40 μL) à 55 °C pendant exactement 5 minutes à l’aide d’une minuterie. Si possible, incuber sur un thermocycleur, bien qu’un couvercle chauffant ne soit pas nécessaire.
  4. Remettre immédiatement les tubes à échantillon dans la glace (4 °C) après l’étape d’incubation.

3. Développement des couleurs

  1. Ajouter 2 μL de solution d’Hemin (25 uM, voir le tableau des matériaux) à chaque tube à échantillon et bien mélanger.
  2. Ajouter 58 μL de la solution de TMB disponible dans le commerce (voir le tableau des matières) à chaque tube d’échantillon et bien mélanger.
  3. Incuber la réaction de développement de la couleur (100 μL) à température ambiante pendant au moins 3 min et jusqu’à 30 min.
    REMARQUE: (Facultatif) Le développement de la couleur peut être arrêté en ajoutant 20 μL d’acide sulfurique 2 M.
  4. Lire les échantillons qualitativement à l’œil nu, ou quantifier les résultats à l’aide d’un lecteur de plaque d’absorbance à 450 nm si les réactions de développement de la couleur sont arrêtées à l’aide d’acide sulfurique.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La plate-forme de détection représentée à la figure 1 convertit la reconnaissance de cibles aptamériques en différences visuellement distinctes entre les préparations d’échantillons (cibles et non cibles, figure 2) dans un court laps de temps. Un ribozyme allostérique identifié par Soukup et al.5 a servi de point de départ pour créer une séquence moins bruyante avec une réponse à la cible sur les échantillons témoins et négatifs. La const...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La méthode présentée ici tire parti de la transition entre une structure secondaire initialement désordonnée dans un ribozyme allostérique et la stabilité supplémentaire conférée par la liaison de la cible au domaine aptamique pour activer le ribozyme à tête marteau clivant cis. La stabilité du ribozyme a été ajustée pour minimiser l’activité catalytique en l’absence de la cible tout en permettant à la liaison de la cible de restaurer la structure active. De plus, il faut veiller à équilibrer les tampons des multiples en...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aptagen, LLC fabrique et commercialise un kit de démonstration GQ-EXPAR pour ceux qui veulent une expérience directe avec un système de détection basé sur aptamère.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette recherche a été soutenue par le financement de la recherche et du développement d’Aptagen LLC.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Solution de dichlorhydrate de tétraméthylbenzidine (TMB) de 3,3',5,5'-avec H2O2, « MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution"PerkinElmerFOOD-1806-1000Réactif de développement de couleur. Minimisez l’exposition à la lumière et à l’atmosphère. Précédemment BIOO Scientific, numéro de catalogue 1806.
Livré dans le kit de démonstration de balise Apta sous forme de tube 3-2.
5'- TCC CTC CCT CCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC CTC CCA GA-Biotine-3'Integrated DNA Technologies (IDT)Modèle d’ADN QtQ47 optimisé personnalisé pour EXPAR afin de produire G-quadruplex, amorcé par G-quadruplex. Ceci est utilisé pour la partie « exponentielle » d’EXPAR, afin d’augmenter rapidement la quantité de DNAzyme utilisée pour le développement des couleurs de l’étape 3. Le modèle comprend une biotine 3' pour empêcher l’extension involontaire par l’ADN polymérase Bst 2.0 pendant EXPAR.
Partie du kit de démonstration Apta-beacon Tube 2-2.
5'-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UUIntegrated DNA Technologies (IDT)Séquence deribozyme allostérique personnalisée reconnaissant la théophylline (ribozyme auto-clivant régulé par le domaine de l’aptamère d’ARN pour la théophylline) modifiée d’après Soukup et al.
Soukup, G. A., Emilsson, G. A., et Breaker, R. R. (2000) Modification de la reconnaissance moléculaire des aptamères d’ARN par sélection allostérique, Journal of molecular biology 298, 623-632.
Fourni dans le kit de démonstration Apta-beacon sous forme de tube 1-3.
5'-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-Biotine-3'Technologies d’ADN intégrées (IDT)Modèle d’ADN P3tQ49 optimisé personnalisé pour EXPAR afin de produire G-quadruplex, amorcé par le produit de clivage P3. Ceci est utilisé à l’étape 2 pour traduire le produit de clivage en DNAzyme utilisé pour le développement de la couleur à l’étape 3. Le modèle comprend une biotine 3' pour empêcher l’extension involontaire par l’ADN polymérase Bst 2.0 pendant EXPAR.
Partie du kit de démonstration Apta-beacon Tube 2-2.
5x Tampon RibozymeAptagen, LLCN/A5x composition : 600 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM MgCl2, 25 mM DTT. Utilisé à l’étape 1.
Fourni dans le kit de démonstration de balise Apta en tant que tube 1-4.
Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) Kit de démonstrationAptagen, LLCGQ-EXPAR-TMBLe kit de démonstration met en évidence la spécificité du test colorimétrique en détectant des cibles de petites molécules difficiles, la théophylline par rapport à la caféine, qui ne diffèrent que par un seul groupe méthyle.
ADN polymérase Bst 2.0New England BiolabsM0537SPolymérase d’amplification isotherme avec activité de déplacement de brin. Fait partie du mélange Nickase-Polymérase, préparé à 9.375 U/uL.
Fait partie du kit de démonstration Apta-beacon Tube 2-1.
Tampon 3.1New England BiolabsB6003SVIALCombiné avec 2 μL de tampon d’amplification isotherme 10X et 27,5 μL d’eau sans nucléase pour produire un tampon EXPAR 1,11X dans EXPAR Mix. Ce produit remplace le B7203SVIAL précédemment utilisé qui faisait partie du développement initial du système (même composition sauf BSA non recombinant).
Fait partie du kit de démonstration Apta-beacon Tube 2-2.
CaféineSigma-AldrichC0750-100GContre-cible aptamère (témoin), préparée avec de l’eau sans nucléases.
Livré dans le kit de démonstration Apta-beacon sous forme de tube 1-1.
dNTPsNew England BiolabsN0447SFait partie du mélange réactionnel EXPAR.
Fait partie du kit de démonstration Apta-beacon Tube 2-2.
Mélange réactionnel EXPARAptagen, LLCN/A0,44 mM dNTPs, 0,38 &mu ; M P3tQ49, 0,38 &mu ; M QtQ47, 44,44 mM Tris-HCl (pH 8,4), 63,5 mM NaCl, 31,5 mM KCl, 6,35 mM MgCl2, 1,27 mM MgSO4, 6,35 mM (NH4)2SO4, 63,5 &mu ; g/ml BSA, 0,0635 % Tween 20,
Partie du kit de démonstration Apta-beacon Tube 2-2.
HeminSigma-AldrichH9039remis en suspension dans du DMF à une concentration finale de 25 uM.
Fourni dans le kit de démonstration de balise Apta sous forme de tube 3-1.
Tampon d’amplification isothermeNew England BiolabsB0537SVIALcombiné avec 2 μL de 10x Buffer 3.1 et 27.5 µ ; L d’eau sans nucléases pour produire un tampon EXPAR 1,11x dans EXPAR Mix.
Partie du kit de démonstration Apta-beacon Tube 2-2.
MgCl2Amresco (VWR)E525-500MLCofacteur ribozyme Hammerhead, nécessaire pour l’auto-clivage.
Partie du kit de démonstration Apta-beacon Tube 1-3.
Thermocycleur MJ PTC-100MJ Research, Inc.Thermocycleur PTC-100pour contrôler les températures d’incubation. N’importe quel thermocycleur ou bloc chaud peut être utilisé.
N, N-diméthylformamide (DMF)Sigma-Aldrich227056-100MLUtilisé pour remettre l’hémine en suspension et maximiser la durée de conservation dans le congélateur.
Fait partie du kit de démonstration Apta-beacon Tube 3-1.
Mélange nickase-polyméraseAptagen, LLCN/ANt.BstNBI (9.375 unités/&mu ; L) et l’ADN polymérase Bst 2.0 (0,5 unités/&mu ; L).
Livré dans le kit de démonstration de balise Apta en tant que tube 2-1.
Nt.BstNBINew England BiolabsR0607SEnzyme d’entaille pour permettre une amplification isotherme continue. Fait partie du mélange nickase-polymérase, préparé à 0,5 U/uL.
Fait partie du tube 2-1 du kit de démonstration Apta-beacon.
Tampon kinase T4New England BiolabsB0201SVIALTampon pour enzyme nécessaire à l’élimination du phosphate cyclique.
Partie du kit de démonstration Apta-beacon Tube 1-4.
Polynucléotide kinase T4New England BiolabsM0201SÉlimine le phosphate cyclique post-clivage pour permettre au produit de clivage d’amorcer la réaction d’amplification isotherme.
Fourni dans le kit de démonstration Apta-beacon sous forme de tubes PCR.
Tecan GENios FLTecanGenios-FL TWTLecteur de plaques pour mesurer le signal d’absorbance à partir des résultats de l’étape 3.
Cible d’aptamère TheophyllineSigma-AldrichT1633-50G, préparée avec de l’eau sans nucléases.
Fourni dans le kit de démonstration de balise Apta sous forme de tube 1-2.
Tris-HClAmerican BioanalyticalAB14043-01000Tampon de liaison Aptamer.
Partie du kit de démonstration Apta-beacon Tube 1-4.

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
  2. Tang, J., Breaker, R. R. Rational design of allosteric ribozymes. Chemical Biology. 4 (6), 453-459 (1997).
  3. Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX--A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).
  4. Liao, A. M., et al. A simple colorimetric system for detecting target antigens by a three-stage signal transformation-amplification strategy. Biochemistry. 57 (34), 5117-5126 (2018).
  5. Soukup, G. A., Emilsson, G. A., Breaker, R. R. Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection. Journal of Molecular Biology. 298 (4), 623-632 (2000).
  6. Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).
  7. Cheng, X., Liu, X., Bing, T., Cao, Z., Shangguan, D. General peroxidase activity of G-quadruplex-hemin complexes and its application in ligand screening. Biochemistry. 48 (33), 7817-7823 (2009).
  8. Nie, J., et al. Reporter-triggered isothermal exponential amplification strategy in ultrasensitive homogeneous label-free electrochemical nucleic acid biosensing. Chemical Communications. 50 (47), 6211-6213 (2014).
  9. Tabuchi, T., Yokobayashi, Y. Cell-free riboswitches. RSC Chemical Biology. 2 (5), 1430-1440 (2021).
  10. Ao, Y., et al. Integration of an expression platform in the SELEX cycle to select DNA aptamer binding to a disease biomarker. ACS Omega. 7 (12), 10804-10811 (2022).

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Mots-clés

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