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Modèle de brûlure de rat pour étudier les brûlures thermiques cutanées de pleine épaisseur et l’infection

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DOI :

10.3791/64345

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23 août 2022

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1UNC Eshelman School of Pharmacy, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Biochemistry & Pharmacology, School of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences, The University of Melbourne, 3Department of Microbiology & Immunology, University of North Carolina School of Medicine, 4Department of Surgery, University of North Carolina at Chapel Hill, 5Curriculum in Toxicology and Environmental Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill, 6Department of Microbiology, Monash Biomedicine Discovery Institute, Monash University

Dans cet article

Résumé

Un modèle imitant le scénario clinique des brûlures et des infections est nécessaire pour faire avancer la recherche sur les brûlures. Le présent protocole démontre un modèle simple et reproductible d’infection par brûlure chez le rat, comparable à celui de l’homme. Cela facilite l’étude des brûlures et des infections après brûlure pour le développement de nouveaux traitements antibiotiques topiques.

Résumé

Les méthodologies d’induction des brûlures ne sont pas décrites de manière cohérente dans les modèles de rats. Un modèle uniforme de brûlure, qui représente le scénario clinique, est nécessaire pour effectuer des recherches reproductibles sur les brûlures. Le présent protocole décrit une méthode simple et reproductible pour créer des brûlures de toute épaisseur de ~20% de la surface corporelle totale (TBSA) chez les rats. Ici, une tige de cuivre de 22,89 cm2 (5,4 cm de diamètre) chauffée à 97 °C dans un bain-marie a été appliquée sur la surface de la peau du rat pour provoquer la brûlure. Une tige de cuivre avec une conductivité thermique élevée a pu dissiper la chaleur plus profondément dans le tissu cutané pour créer une brûlure de pleine épaisseur. L’analyse histologique montre un épiderme atténué avec des dommages coagulatifs à toute l’épaisseur du derme et du tissu sous-cutané. De plus, ce modèle est représentatif des situations cliniques observées chez les patients hospitalisés souffrant de brûlures à la suite de brûlures telles qu’une dysrégulation immunitaire et des infections bactériennes. Le modèle peut récapituler l’infection bactérienne systémique par les bactéries à Gram positif et à Gram négatif. En conclusion, cet article présente un modèle de brûlure de rat robuste et facile à apprendre qui imite les situations cliniques, y compris la dysrégulation immunitaire et les infections bactériennes, ce qui est d’une utilité considérable pour le développement de nouveaux antibiotiques topiques pour les brûlures et les infections.

Introduction

Les brûlures sont parmi les formes de traumatisme les plus dévastatrices, avec des taux de mortalité atteignant 12%, même dans les centres spécialisésdans les grands brûlés 1,2,3. Selon des rapports récemment publiés, ~ 486 000 patients brûlés nécessitent des soins médicaux chaque année aux États-Unis, avec près de 3 500 décès 1,2,3,4,5,6. Les brûlures constituent un défi majeur pour le système immunitaire des patients et créent une plaie ouverte importante, qui est lente à guérir, les laissant vulnérables à la colonisation cutanée, pulmonaire et systémique par des bactéries nosocomiales et opportunistes. La dérégulation immunitaire combinée à l’infection bactérienne est associée à une augmentation de la morbidité et de la mortalité chez les patients brûlés7.

Un modèle de brûlure et d’infection animale est essentiel pour étudier la pathogenèse des infections bactériennes à la suite de lésions cutanées et d’une suppression immunitaire associée à un traumatisme par brûlure. De tels modèles permettent la conception et l’évaluation de nouvelles méthodes de traitement des infections bactériennes chez les patients brûlés. Les rats et les humains partagent des caractéristiques physiologiques et pathologiques cutanées similaires qui ont été précédemment documentées8. De plus, les rats sont de plus petite taille, ce qui les rend plus faciles à manipuler, plus abordables et plus faciles à se procurer et à entretenir que les modèles animaux plus grands.

Ces caractéristiques font des rats un animal modèle idéal pour étudier les brûlures et les infections9. Malheureusement, la technique d’induction des brûlures est incohérente et souvent décrite de manière minimale10,11,12,13,14. Le présent protocole est conçu pour mettre au point une procédure simple, rentable et reproductible pour créer une brûlure constante sur toute l’épaisseur dans un modèle de rat qui simule le scénario clinique et peut être utilisé pour évaluer l’immunosuppression et l’infection bactérienne.

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Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Caroline du Nord et ont été menées conformément à ses lignes directrices établies. Des rats Sprague Dawley mâles et femelles (250-300 g) âgés de 7 à 9 semaines ont été utilisés pour les expériences. Tous les animaux ont été logés dans un cycle lumière-obscurité de 12 h:12 h avec un accès gratuit à la nourriture et à l’eau ad libitum. Travaillez toujours avec votre vétérinaire institutionnel au sujet d’un plan analgésique avant le début de l’étude.

1. Préparer les rats à la brûlure

  1. Préparez les animaux aux brûlures 24 heures avant la brûlure.
  2. Anesthésier le rat avec 5% d’isoflurane dans 100% d’oxygène dans une chambre d’induction pendant 5 min (débit: 2 L / min) jusqu’à ce que la respiration ait ralenti.
  3. Une fois que le rat est profondément anesthésié (ne répond pas au pincement des orteils sur tous les membres), déplacez le rat vers un coussin chauffant en position couchée et réduisez l’isoflurane à 1,5% en oxygène pour le maintien par un cône nasal.
  4. Pour éviter le séchage de la cornée après l’anesthésie et pendant la procédure, appliquez un lubrifiant pour les yeux sur les cornées des deux yeux à l’aide d’un applicateur à embout de coton.
  5. Rasez la région dorsale du rat à l’aide d’une tondeuse électrique (voir le tableau des matériaux) et enlevez autant de poils que possible dans un grand rectangle des omoplates jusqu’à la base de la queue (figure 2A).
  6. Nettoyez la zone rasée avec un mouchoir imbibé de solution saline pour essuyer les poils lâches. Appliquez la lotion dépilatoire sur la zone rasée à l’aide d’un applicateur à embout de coton et laissez-la agir pendant ~3 min.
    REMARQUE: L’application de la lotion d’épilation référencée pendant plus de 3 minutes induira des éruptions cutanées rouges sur la peau.
  7. Essuyez la zone avec une éponge de gaze humide deux fois pour enlever la lotion et prévenir l’irritation de la peau.
  8. Éteignez l’isoflurane, retirez le cône nasal et placez le rat dans la cage de récupération.
    REMARQUE: Placez un coussin chauffant dans la cage de récupération.
  9. Transférez l’animal récupéré dans une cage de logement propre pour la procédure de brûlure du lendemain (cela peut prendre ~ 10-15 minutes pour que le rat se remette de l’anesthésie).

2. Provoquer la brûlure chez le rat

  1. Le jour de la combustion, régler la température du bain-marie à 97 °C et placer les quatre tiges de cuivre (420 g chacune; Graphique 1) Au bain-marie 1 h avant l’expérience de brûlure pour laisser les tiges se réchauffer uniformément.
    NOTE: Les tiges doivent être immergées dans l’eau. Vérifiez la précision de l’affichage numérique de la température à l’aide d’un thermomètre avant l’expérience.
  2. Anesthésiez le rat comme mentionné à la section 1.
  3. Une fois que le rat ne répond pas au pincement des orteils sur tous les membres, placez-le sur un coussin chauffant en position couchée avec 1,5 % d’isoflurane dans de l’oxygène pour l’entretien (figure 2A).
  4. Injecter de la morphine (20 mg/kg de poids corporel) par voie intrapéritonéale (i.p.) pour la gestion de la douleur6.
  5. Vérifiez la température de l’eau dans le bain-marie. Réglez la minuterie et mettez les gants résistants à la chaleur.
  6. Retirez une tige de cuivre chauffée du bain-marie et touchez-la sur la région dorsale du rat pendant 7 s pour provoquer la brûlure.
    REMARQUE : Gardez une distance minimale (10-15 cm) entre le bain-marie et l’animal pour minimiser les pertes de chaleur et ne mettez pas de pression sur les tiges tout en provoquant la brûlure (c.-à-d. que le contact doit être maintenu par gravité).
  7. Appliquer quatre brûlures, en utilisant une tige par site de brûlure, l’une immédiatement après l’autre pour produire une brûlure TBSA de contact complet d’environ 20 % (figure 2B).
  8. Après la brûlure, réanimer l’animal par injection intraveineuse de solution de Ringer lactée (0,1 mL/g de poids corporel).
    REMARQUE : Utilisez une solution de sonnerie lactée ajustée à la température corporelle pour réanimer les rats.
  9. Éteignez l’isoflurane, retirez le cône nasal et placez le rat sur le tapis chauffant pour le récupérer.

3. Préparation de l’inoculum bactérien et de l’infection

  1. Étaler l’échantillon congelé de Pseudomonas aeruginosa PAO1 et Staphylococcus aureus ATCC25923 sur des plaques de gélose Muller Hinton (MHA), 2 jours avant l’expérience de brûlure.
  2. Le lendemain, choisissez une seule colonie de bactéries cultivées dans l’assiette et, à l’aide d’une boucle d’inoculation, grattez-la légèrement de l’assiette. Ensuite, placez-le dans le tube de culture pour inoculer 10 ml de bouillon Muller Hinton (MHB) et cultivez-le pendant la nuit à 37 °C dans un agitateur d’incubateur.
  3. Le jour de la brûlure et de l’infection, centrifuger la culture à 4 000 × g pendant 5 min. Laver la pastille avec une solution saline normale (solution de NaCl à 0,9%).
  4. Resuspendre la pastille bactérienne dans une solution saline et diluer jusqu’à 0,1 OD 600nm (densité optique à600 nm ). Diluer l’inoculum bactérien en prenant 200 μL de cette suspension bactérienne et en le mélangeant avec 800 μL de solution saline pour obtenir l’inoculum bactérien désiré de 2 × 107 UFC/mL.
  5. Injecter 50 μL d’inoculum de P. aeruginosa ou de S. aureupréparé à l’étape précédente (dose d’infection 1 × 106 UFC) dans le rat anesthésié 15 min après la brûlure, à l’aide d’une aiguille de 29 G par voie sous-cutanée aussi près que possible de la plaie brûlée.
  6. Après avoir infecté la brûlure, placez le rat sur le coussin chauffant pour la récupération. Une fois que l’animal a récupéré (~15-20 min), logez-le dans une cage propre.
    REMARQUE: Après la brûlure, logez un rat par cage. Utilisez des granulés de nourriture humide à l’eau pour faciliter la mastication et placez-les sur le sol de la cage pour une portée facile.
  7. Remplissez les bouteilles d’eau dans la cage avec de l’eau enrichie de morphine (0,4 mg/mL) pour la gestion de la douleur.
    REMARQUE: La morphine orale reflète la situation clinique chez les patients brûlés humains. Cette étude a utilisé de la morphine orale pour garder ces expériences comparables aux patients brûlés humains après avoir consulté le personnel vétérinaire à de nombreuses reprises. Les journaux de consommation d’alcool et de poids ont été maintenus tout au long de l’expérience. Utilisez le même système de consommation pendant toutes les procédures. D’autres analgésiques, comme la buprénorphine, peuvent être administrés par voie sous-cutanée ou intrapéritonéale, conformément aux lignes directrices institutionnelles en matière de soins aux animaux.
  8. Remplissez la liste de contrôle de surveillance et surveillez étroitement les animaux pour détecter toute détresse ou maladie pendant toute la durée de l’expérience.

4. Évaluation de la brûlure

  1. Évaluez morphologiquement la brûlure cutanée en termes de couleur et de marge immédiatement après la brûlure.
  2. Colorer la peau brûlée avec de l’hématoxyline et de l’éosine (H & E) pour visualiser la structure de la plaie de brûlure et l’espace épithélial15 (voir l’étape 5.6 pour le traitement des échantillons).

5. Post-traitement des échantillons de rats et dénombrement des bactéries

  1. Euthanasier le rat à 24, 48 et 72 h après la brûlure avec une surdose d’anesthésie.
  2. Prélever des échantillons de sang sur les rats par ponction cardiaque et les recueillir dans un mini tube de prélèvement.
    1. Analyser la numération globulaire complète des échantillons de sang pour déterminer l’effet de l’induction de brûlures sur le système immunitaire de l’hôte.
  3. Prélever la peau, le tissu sous-cutané, les muscles, les poumons et la rate au moment de l’euthanasie.
    REMARQUE: Conservez une partie (~ 1 cm × 1 cm; pesant ~ 200-300 mg) de la peau pour la coloration H & E et une autre partie pour le dénombrement bactérien.
  4. Prélever les tissus dans un tube de prélèvement de 10 ml et les placer dans une solution saline normale sur de la glace pour le dénombrement bactérien.
  5. Normaliser le poids des tissus avec une solution saline normale et homogénéiser les échantillons à l’aide d’un homogénéisateur tissulaire (voir le tableau des matériaux).
    1. Diluer en série les homogénats tissulaires dans une solution saline normale.
    2. Plaque 100 μL d’homogénat non dilué et toutes les dilutions de chaque échantillon de tissu sur des plaques de gélose au cétrimide pour les échantillons prélevés sur des rats infectés par P. aeruginosa.
      REMARQUE : Utiliser des plaques de gélose au mannitol pour plaquer des échantillons prélevés sur des rats infectés par S. aureus.
    3. Incuber les plaques à 37 °C dans un incubateur pendant 16-18 h.
    4. Le lendemain, comptez les colonies bactériennes sur les plaques, multipliez par le taux de dilution pour obtenir le nombre d’UFC/mL et normalisez avec le poids du tissu pour calculer le tissu UFC/g.
    5. Utiliser un logiciel d’analyse de données pour tracer le nombre de bactéries dans différents organes aux différents points de temps d’échantillonnage.
  6. Effectuer une coloration H & E de la peau brûlée pour visualiser la structure de la plaie et l’espace épithélial.
    1. À l’aide de ciseaux et de pinces dentées, couper un patch cutané de 1 cm x 1 cm de la zone brûlée et l’immerger dans un fixateur (formol tamponné neutre à 10 %, FBN) pendant 48 h à température ambiante.
      REMARQUE: Remuez le récipient pour vous assurer que tous les tissus sont complètement immergés dans le fixateur, le volume du fixateur étant 30 fois supérieur au volume tissulaire.
    2. Déshydrater le tissu cutané avec de l’éthanol à 70 % (v/v) pendant 72 h à température ambiante.
    3. Traiter les échantillons déshydratés dans des blocs de paraffine pour couper les sections et colorer avec H&E15.
    4. Imagez numériquement les diapositives colorées dans un scanner de diapositives (voir le tableau des matériaux) à l’aide d’un objectif 40x.
    5. Analysez l’image numérisée à l’aide d’un logiciel (voir le fichier supplémentaire 1 pour le traitement de l’image à analyser; voir le tableau des matériaux).
    6. Examinez tous les champs de la section de la peau tachée pour évaluer l’état de l’épiderme, du derme, du tissu sous-cutané et du muscle squelettique.

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Résultats

Le protocole présenté ici est hautement reproductible et a entraîné une brûlure au troisième degré de pleine épaisseur chez les rats. La plaie de brûlure apparaît blanc cireux après induction de la brûlure (Figure 2B). La couleur de la brûlure est passée du blanc au brun au cours des 72 heures suivant la brûlure (figure 2B-E).

L’analyse histologique a confirmé une combustion sur toute l’épaisseur (pro...

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Discussion

Plusieurs modèles de brûlures ont été présentés pour étudier la physiopathologie des brûlures 8,12,16,17. Dans la présente étude, nous avons utilisé un modèle de rat pour développer un protocole simple et reproductible pour induire une brûlure de pleine épaisseur suivie d’une infection bactérienne pour simuler un traumatisme de brûlure infecté chez les patients. Le choix du rat comme modèle ani...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient la Division de médecine comparée de l’Université de Caroline du Nord pour la fourniture et les soins des animaux. Nous remercions Lauren Ralph et Mia Evangelista du noyau des services de pathologie pour leur assistance technique spécialisée en histopathologie / pathologie numérique, y compris la coupe tissulaire et l’imagerie. Cette recherche a été financée par une subvention de recherche du ministère de la Défense (numéro d’attribution W81XWH-20-1-0500, GR et TV).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Seringue de 1 mLBD, USA309597Utilisée pour injecter l’analgésique
Microtube de 1,7 mL Olympus, USA24-282Utilisée pour transporter de la morphine
10 % NBFVWR, USA16004-115Utilisée pour fixer le morceau de peau pour la coloration
Seringue de 30 mLBD, USA302832 Utiliséepour injecter la solution de ringer de lactate
70 % alcool éthyliqueFischer Scientifique, États-UnisBP28184
Aperio AT2 Digital Pathology  ; Scanner de diapositives avec le logiciel ImageScopeAperio, Technologies Inc., Vista, CA, États-Unisn/aNumérisation de H & E lames et analyse Plaques
de gélose cétrimideBD, USA285420Plaques de milieux sélectifs pour la croissance Pseudomonas aeruginosa
Tiges de cuivren/an/aUtilisées pour induire les brûlures
Applicateurs à embout en cotonOMEGA Surgical supply, USA4225-IMCUtilisé pour appliquer une pommade oculaire
Rasoir électriqueOster, USAGolden A5Utilisé pour enlever les poils latéraux dorsaux
Lubrifiant pour les yeuxDechra, UKn/aL’agent mouillant pour les yeux pour offrir un confort durable et éviter la sécheresse oculaire
Sous-vêtements remplis de peluchesMedline, USAMSC281225Utilisé dans la procédure de brûlure
ForcepF.S.T.11027-12Utilisé pour maintenir le morceau de peau
Éponges de gazeOasis, USAPK412Utilisé pour nettoyer la crème nair appliquée du côté dorsal  ;
Gants résistants à la chaleurn/an/aUtilisé pour maintenir les tiges de cuivre chauffées
Analyseur d’hématologieLaboratoires IDEXX, États-UnisProCyte Dx
Chambre d’inductionKent Scientific, États-UnisvetFlo-0730Utilisé pour anesthésier les animaux
Seringue à insulineBD, États-Unis329461
IsofluranePivetal, États-UnisNDC46066-755-04Utilisé pour anesthésier les rats afin d’induire une perte de conscience
Vaporisateur d’isofluranen/an/a
Solution de sonnerie lactéeicumedical, USANDC0990-7953-09Utilisé pour réanimer les rats
Épandeur en forme de LFischer Scientific, USA14-665-230
Mannitol AgarBD, USA211407Plaques de milieu sélectif pour Staphylococcus aureus growth
Tubes Minicollect (K2EDTA)greiner bio-one, USA450480Utilisé pour prélever le sang
MorphineMallinckrodt, UKNDC0406-8003-30Cet analgésique a été utilisé pour induire l’incapacité à ressentir la douleur des brûlures
Muller Hinton BrothBD, USA275730
Muller Hinton II AgarBD, USA211438
Nair lotion dépilatoireNair, USAn/aUtilisé pour enlever les poils résiduels sur la face dorsale
Aiguille 23 GBD, USAUtilisé pour injecter la solution de lactate ringer
Solution saline normalen/an/a
Spectrophotomètre ThermoScientific, USAGenesys 30
Rats Sprague-Dawley, mâles et femellesCharles River Labsn/aâgés de 7 à 9 semaines pour l’induction des brûlures
Ciseaux chirurgicauxF.S.T.14501-14Utilisé pour couper le morceau de peau souhaité
Tubes de prélèvement de tissusGlobe Scientific220101236
Homogénéisateur de tissusKinematica, Inc, États-UnisPOLYTRON PT2100Utilisé pour homogénéiser les échantillons de tissus Bain d’eau
Fischer Scientific, États-Unisn/aUtilisé pour induire la brûlure
Coussin chauffant lestéComfytemp, États-Unisn/aUtilisé pendant la procédure pour garder le corps du rat au chaud
305193

Références

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