Ciblage génique hautement efficace médié par CRISPR/Cas9 dans des cellules souches embryonnaires pour le développement de modèles murins manipulés par des gènes

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour le développement de modèles murins génétiquement modifiés utilisant des cellules souches embryonnaires, en particulier pour les grands knock-in d’ADN (KI). Ce protocole est mis au point à l’aide de l’édition du génome CRISPR / Cas9, ce qui permet d’améliorer considérablement l’efficacité du KI par rapport à la méthode conventionnelle de ciblage de l’ADN linéarisé par recombinaison homologue.

Résumé

Le système CRISPR/Cas9 a permis de développer des souris génétiquement modifiées par édition directe du génome à l’aide de zygotes fécondés. Cependant, bien que l’efficacité dans le développement de souris knock-out géniques en induisant une petite mutation indel serait suffisante, l’efficacité de l’édition du génome embryonnaire pour fabriquer un knock-in d’ADN de grande taille (KI) est encore faible. Par conséquent, contrairement à la méthode KI directe chez les embryons, le ciblage génique à l’aide de cellules souches embryonnaires (CSE) suivi d’une injection d’embryons pour développer des souris chimères présente encore plusieurs avantages (par exemple, le ciblage à haut débit in vitro, la manipulation multi-allèle et la manipulation des gènes Cre et flox peuvent être effectuées en peu de temps). En outre, les souches dont les embryons sont difficiles à manipuler in vitro, telles que BALB/c, peuvent également être utilisées pour le ciblage de l’ESC. Ce protocole décrit la méthode optimisée pour le KI d’ADN de grande taille (plusieurs kb) dans les CES en appliquant l’édition du génome médiée par CRISPR / Cas9 suivie de la production de souris chimères pour développer des modèles de souris manipulés par des gènes.

Introduction

La production de souris génétiquement modifiées et l’analyse de leur phénotype nous permettent de comprendre en détail des fonctions génétiques spécifiques, in vivo. De nombreuses découvertes importantes ont été découvertes à l’aide de modèles animaux génétiquement modifiés dans le domaine des sciences de la vie. De plus, depuis le rapport sur la technologie d’édition du génome utilisant CRISPR/Cas9¹, la recherche utilisant des souris génétiquement modifiées s’est rapidement étendue à de nombreux laboratoires ^2,3. L’édition du génome des zygotes de souris par CRISPR / Cas9 a atteint une efficacité acceptable pour développer une courte modification de l’ADN, telle que le knockout du gène orienté mutation indel⁴, le remplacement d’un seul nucléotide ou l’insertion courte de marqueurs peptidiques utilisant des oligonucléotides simple brin (ssODN) comme donneurs knock-in (KI)⁵. D’autre part, le KI de gros fragments d’ADN en zygotes par édition du génome reste à une faible efficacité par rapport à la modification de l’ADN de courte taille ^6,7. En outre, il est difficile d’utiliser des souches de souris telles que BALB / c, qui est une souche importante pour des domaines de recherche spécifiques comme l’immunologie, pour l’édition du génome à base de zygotes parce que leurs embryons préimplantatoires sont sensibles à la manipulation in vitro.

Une autre façon de développer des modèles de souris génétiquement modifiés consiste à utiliser la technique de ciblage des cellules souches embryonnaires (CSE) suivie d’une injection d’ESC dans l’embryon préimplantatoire pour produire des chimères 8,9,10^, qui est encore couramment utilisée comme méthode conventionnelle. Bien que le taux d’acquisition pour obtenir des clones KI-ESC précis ne soit pas très élevé dans les méthodes conventionnelles de ciblage ESC, le ciblage ESC offre certains avantages par rapport à l’édition du génome zygote, en particulier pour le KI ADN long. Par exemple, l’efficacité KI de longs fragments d’ADN (> plusieurs kb) dans le génome du zygote est moins évidente^6,7, et de nombreux zygotes sont nécessaires pour développer ne serait-ce qu’une seule lignée de souris KI^, ce qui n’est pas souhaitable dans la perspective actuelle des expériences animales. Contrairement à l’édition du génome du zygote, le ciblage long de l’ADN sur les CSE suivi de la production de chimères nécessite beaucoup moins d’embryons que l’édition du génome du zygote. En outre, même si les embryons préimplantatoires de BALB/c sont susceptibles d’être manipulés in vitro, leurs CSE peuvent être conservés et manipulés in vitro 11 comme d’autres ESC de fond compétents ^{129 ou F1}, donc applicables aux productions de chimères. Cependant, même si un vecteur de ciblage contient des bras homologues de 5' et 3' et des cassettes de gènes de résistance aux médicaments pour une sélection positive ou négative, l’efficacité conventionnelle du KI des CES est généralement insuffisante, en raison de la fréquence élevée de l’intégration génomique aléatoire ^8,10, D’où la nécessité d’une méthode améliorée avec une efficacité précise de ciblage de l’ESC. Récemment, nous avons rapporté une méthode ESC KI mise au point utilisant l’édition du génome basée sur CRISPR / Cas9 pour obtenir une efficacité KI supérieure aux méthodes de ciblage conventionnelles¹¹. La méthode que nous décrivons ici est basée sur cette procédure qui permet un KI long de l’ADN (> plusieurs à 10 kb) vers les CSE avec une efficacité acceptable pour les travaux de routine sans sélection de médicaments; Ainsi, la procédure de construction du vecteur serait beaucoup plus facile et nécessiterait une période plus courte, ou la période de culture cellulaire deviendrait également beaucoup plus courte.

Protocole

Toutes les expériences sur les souris ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Tokyo (numéro d’approbation PA17-63) et de l’Université d’Osaka (numéro d’approbation Biken-AP-H30-01) et réalisées conformément à leurs directives ainsi qu’aux directives ARRIVE (https://arriveguidelines.org).

1. Ciblage de la construction vectorielle

1. Amplifiez une cassette KI (CreERT ici, l’ADN modèle pour la PCR provient à l’origine d’une société commerciale de synthèse de gènes) et un fragment d’environ 1 ko de bras d’homologie 5' ou 3' par PCR. Pour le clonage de l’ADN (étape 1.3), ajoutez des séquences de chevauchement de 15 mères à l’extrémité 5' de chaque amorce de PCR. Purifier les fragments d’ADN PCR par électrophorèse sur gel d’agarose, suivie de l’extraction du fragment d’ADN à l’aide d’un kit de purification de l’ADN.
2. Linéariser le plasmide du squelette (p. ex. pUC19 ou pBS) à l’aide d’une ou de plusieurs enzymes de restriction appropriées qui digèrent de façon unique quelque part dans le site de clonage multiple pour le clonage. Ensuite, purifiez le plasmide digéré à l’aide d’un kit de purification de l’ADN.
3. Cloner chaque fragment de PCR (p. ex., bras d’homologie 5', bras d’homologie 3') et séquence de KI simultanément dans le plasmide digéré à l’aide d’une trousse de clonage d’ADN conformément aux instructions du fabricant.
4. Transformer les cellules compétentes à l’aide du plasmide construit (étape 1.3) en les chauffant à 42 °C pendant 1 min au bain-marie, puis les ensemencer sur une plaque LB contenant la concentration appropriée d’antibiotiques tels que l’ampicilline ou la kanamycine. Cultivez-les pendant la nuit pour des sélections de clones résistants.
5. Prélever plusieurs colonies individuelles (quatre à huit) à l’aide d’embouts de pipette de 200 μL et transférer les embouts dans 3 mL de LB liquide contenant les antibiotiques appropriés (100 μg/mL d’ampicilline ou 20 μL/mL de kanamycine) et les cultiver pendant la nuit à 37 °C en agitant les gouttes de l’alcool.
6. Purifier le plasmide le lendemain à l’aide d’une trousse de purification plasmidique commerciale de qualité sans endotoxines conformément aux instructions du fabricant. Confirmer la séquence clonée dans le plasmide par séquençage de Sanger. Ajuster la concentration plasmidique à 1 μg d’ADN/μL en utilisant de l’eau sans nucléase. Utilisez le plasmide comme vecteur de ciblage du gène.

2. Préparation du fibroblaste embryonnaire de souris (MEF) en tant que cellules nourricières pour l’ESC

1. Sacrifier des souris femelles ICR gravides âgées de 8 à 10 semaines (14,5 jours après le coït) par luxation cervicale. Essuyez bien l’abdomen en utilisant de l’éthanol à 70% (v / v) pour la stérilisation, coupez l’abdomen à l’aide de ciseaux orbitaux et de forceps, et récupérez l’utérus contenant le fœtus.
2. Placer l’utérus dans une boîte de 100 mm contenant 10 mL de sérum bovin phosphaté (PBS) contenant 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine. Retirer les placentas et les tissus extraembryonnaires des fœtus à l’aide de ciseaux orbitaires et de forceps. Hacher les fœtus à l’aide de ciseaux orbitaires et transférer la solution PBS contenant les cellules fœtales hachées dans un tube conique de 50 mL.
3. Centrifuger à 280 x g pendant 5 min à 4 °C et éliminer le surnageant par aspiration. Ajouter 10 mL de solution trypsine-EDTA à 0,25 % (p/v), bien mélanger par pipetage, puis incuber pendant 10 min à 37 °C au bain-marie pour la digestion de la trypsine.
4. Ajouter 20 mL de milieu MEF (DMEM contenant 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine) pour arrêter la réaction enzymatique, bien mélanger par inversion douce et centrifuger à 280 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant par aspiration, ajouter 10 mL de milieu MEF et bien mélanger par pipetage.
5. Ensemencer la suspension cellulaire dans plusieurs nouvelles boîtes de 100 mm (préparer le même nombre de plats que le nombre de fœtus avec 10 ml de milieu MEF pour une boîte de 100 mm). Changez le milieu 4 à 5 heures après l’ensemencement pour enlever les cellules non attachées et laissez le MEF attaché se développer. Passage des cellules lorsqu’elles atteignent ~80% de confluence en utilisant la trypsine.
6. Placer les boîtes de culture contenant le MEF proliférant dans un milieu MEF, environ 12-15 jours après l’ensemencement, dans un dispositif d’irradiation par rayons X. Exposer le MEF avec une radiographie de 50 Gy (total) pour arrêter le cycle cellulaire conformément aux instructions du fabricant.
7. Trypsiniser le MEF irradié en ajoutant 2 mL de trypsine-EDTA à 0,25% pour une boîte de 100 mm pendant 5 min à 37 °C, puis ajouter 4 mL de milieu MEF pour arrêter la digestion de la trypsine et recueillir la suspension cellulaire dans un nouveau tube de 50 mL.
8. Laver le MEF avec un milieu MEF frais par centrifugation à 280 x g pendant 5 min à 4 °C, compter le nombre de cellules à l’aide d’un compteur de cellules avec coloration au bleu de trypan et les congeler à 1,6 x 10⁶ cellules/tube dans un milieu de congélation cellulaire. Conserver jusqu’à utilisation; Les cellules peuvent être stockées de manière stable dans de l’azote liquide pendant plusieurs années.

3. Préparation du mélange Cas9-RNP-ADN

1. Dissoudre l’ARNtrac et l’ARNcr dans un tampon de dilution (chaque concentration d’ARN à 200 μM) par pipetage. Mélanger la solution d’ARNtrac, la solution de crisprRNA et le tampon de dilution (rapport volumique à 2:2:5) en tapotant doucement et en recuisant chaque ARN à l’aide d’un thermocycleur à 95 °C pendant 10 minutes, suivi de cycles de réduction progressive de 1 °C/min jusqu’à ce que la température atteigne 4 °C.
   REMARQUE: La séquence d’ARNg a été conçue à l’aide de CRISPOR, http://crispor.tefor.net.
2. Incuber les ARN recuits, 10 μg/μL de nucléase Cas9 et le tampon d’électroporation mélangés dans un rapport volumique de 5:3:2 à 37 °C pendant 20 min pour former le complexe Cas9-RNP. Dans le travail de routine, mélanger et incuber 1,25 μL d’ARN recuit, 0,75 μL de nucléase Cas9 et 0,5 μL de tampon d’électroporation pour une édition du génome du locus.
3. Mélanger les matériaux suivants dans un tube de 1,5 mL : 10 μL de tampon d’électroporation, 1 μL de complexe Cas9-RNP (étape 3.2) et 1 μL de vecteur de ciblage circulaire (1 μg/μL, étape 1.6). La quantité totale de mélange Cas9-RNP-ADN est de 12 μL. Gardez le mélange Cas9-RNP-ADN sur la glace jusqu’à l’électroporation.
   REMARQUE: Pour éviter le reclivage de l’ARNg après KI, concevez l’ARNg dans une position où la séquence de reconnaissance de l’ARNg est divisée par l’intégration du donneur de KI. Si l’ARNg ne peut pas être conçu dans un tel endroit, plusieurs mutations silencieuses nucléotidiques, par lesquelles la séquence d’acides aminés ne change pas, sont incluses dans le plasmide du donneur de KI.

4. Ciblage génique des CES

1. Pour préparer les boîtes de culture cellulaire enrobées de gélatine, ajouter une solution de gélatine à 0,1 % (p/v) à 2 mL pour une boîte de 60 mm, 500 μL pour une assiette de 24 puits, 100 μL pour une assiette de 96 puits, et incuber pendant 2 h dans un incubateur humide. Retirer la solution de gélatine, laver deux fois avec la même quantité de PBS et conserver à température ambiante jusqu’à utilisation.
2. Décongeler le MEF congelé inactivé mitotiquement (étape 2.2) à l’aide d’un bain-marie à 37 °C pendant 1 min, et placer le MEF sur une capsule de 60 mm recouverte de gélatine (un tube de MEF congelé contenant 1,6 x 10⁶ cellules pour deux boîtes de 60 mm, étape 2.2) 1 jour avant l’ensemencement de l’ESC.
3. Décongeler un tube de stockage d’ESC congelé (stocké à 2 x 10 5 ESC/tube; le comptage des cellules a été effectué à l’aide d’un compteur de cellules) à l’aide d’un bain-marie à 37 °C pendant 1 min, et placer 1 x 10⁵ CES sur une capsule de 60 mm contenant du MEF pré-ensemencé (étape 4.1).
4. Culture dans un milieu de culture ESC de 4 mL (ESCM, milieu modifié à base de DMEM avec 15 % (v/v) de sérum fœtal bovin, substrat de L-glutamine 2 mM, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 0,1 mM de 2-mercaptoéthanol, facteur inhibiteur de la leucémie, et t2i (0,2 μM PD0325901 et 3 μM CHIR99021) qui maintient la pluripotence de l’ESC¹¹) à 37 °C avec 5 % de CO₂ jusqu’à ce que l’ESC atteigne 50 % à 70 % de confluence.
   REMARQUE: Nous utilisons trois lignes différentes d’ESC: JM8. A3 de B6N, V6.5 de B6-129 F1, et BALB/c ESC développé en interne. Les mêmes protocoles KI dans ce manuscrit sont utilisés pour toutes les lignes ESC.
5. Laver l’ESC de culture avec 4 mL de PBS, puis traiter avec 800 μL de solution trypsine-EDTA à 0,25% pendant 5 min à 37 °C pour la digestion. Ajouter 1 mL d’ESCM pour inactiver la trypsine et dissocier les CSE en cellules individuelles par pipetage.
6. Centrifuger la solution contenant l’ESC pendant 5 min à 280 x g, jeter le surnageant, remettre en suspension les CSE dans 1 mL frais d’ESCM et compter le nombre de cellules à l’aide d’un compteur de cellules avec coloration au bleu trypan. Transférer 1 x 10 5 ESC dans un nouveau tube de^1,5 mL et les laver trois fois avec du PBS par centrifugation à 500 x g, 4 °C.
7. Resuspendre la pastille d’ESC dans 12 μL de mélange Cas9-RNP-ADN (étape 3.3) et bien mélanger par pipetage doux pour éviter les bulles. Servir l’ESC remis en suspension pour l’électroporation. Le système d’électroporation utilise une seule impulsion à 1 400 V et 30 ms pour la transduction Cas9-RNP-ADN (Figure 1).
8. Culture des CSE électroporées dans une boîte de 60 mm contenant 4 mL d’ESCM avec MEF mitotiquement inactivé (section 4.2). Changez le support tous les jours.
9. Laver les CSE avec 4 mL de PBS 3 à 5 jours après l’électroporation, puis traiter avec 800 μL de trypsine-EDTA à 0,25% et cultiver à 37 °C pendant 5 min dans un incubateur humide pour la digestion. Ajouter 2 mL d’ESCM pour arrêter la digestion de la trypsine et centrifuger le mélange cellulaire à 280 x g pendant 5 min.
10. Jeter le surnageant, remettre en suspension les CSE dans 1 mL d’ESCM frais et compter la concentration cellulaire à l’aide d’un compteur de cellules avec coloration bleu trypan. Passage des ESC à 1 x 10³ ESC par boîte de 60 mm contenant la MEC et le MEF d’alimentation. Changez le milieu tous les jours jusqu’à ce que la colonie reprenne.
    REMARQUE: La raison pour laquelle l’ESC est passé une fois avant le prélèvement est que l’édition du génome peut continuer à se produire après la division de l’ESC, de sorte que la première colonie n’est pas toujours le clone dans de nombreux cas. Par conséquent, le premier passage de l’ESC avant le ramassage de la colonie est une étape essentielle pour ramasser des clones uniques.

5. Génotypage par PCR des CES ciblés

1. Aspirer l’ESCM de la boîte de culture ESC 5 à 7 jours après le premier passage (étape 4.9) et ajouter 4 mL de PBS. Prélever des colonies d’ESC simples contenant 5 μL de PBS à l’aide d’une pipette de 20 μL au stéréomicroscope (grossissement de 30x à 40x). Placer les colonies individuelles dans un puits d’une plaque à fond rond de 96 puits contenant 15 μL de solution trypsine-EDTA à 0,25 %.
2. Gardez la plaque de 96 puits sur la glace jusqu’à ce que 48 colonies individuelles soient ramassées. Incuber la plaque de 96 puits pendant 5 minutes dans un incubateur humide à 5 % de CO₂ à 37 °C, puis ajouter 80 μL d’ESCM pour arrêter la digestion de la trypsine et dissocier les colonies d’ESC en cellules individuelles par pipetage.
   REMARQUE: Étant donné que l’efficacité KI de cette méthode est généralement de 10% à 50%, nous prenons régulièrement 48 clones et effectuons d’abord le génotypage en utilisant 24 d’entre eux. Si plusieurs clones de KI ne peuvent pas être obtenus à ce stade, nous poursuivons le dépistage du KI en utilisant les 24 clones restants.
3. Transférer 40 μL de suspension d’ESC (étape 5) dans une plaque de 96 puits sans gélatine contenant 50 μL d’ESCM par puits pour le génotypage par PCR. Transférer les 60 μL restants de suspension d’ESC dans un puits dans une plaque de 24 puits recouverte de gélatine, qui contient 500 μL d’ESCM et de MEF d’alimentation, pour obtenir le stock d’ESC congelé.
4. Stocker des clones d’ESC individuels cultivés dans la plaque de 24 puits (étape 5.3) jusqu’à ce qu’ils atteignent une confluence de 60 % à 80 %. Récupérer des clones d’ESC individuels par trypsinisation comme mentionné ci-dessus, recueillir des cellules dans un nouveau tube de 1,5 mL et centrifuger à 280 x g pendant 5 min. Jeter le surnageant, remettre les cellules en suspension dans 500 μL de milieu de congélation cellulaire et les congeler à l’aide d’un congélateur à -80 °C.
5. Pour le génotypage par PCR, cultiver des clones d’ESC dans la plaque sans alimentation à 96 puits (étape 5.3) jusqu’à ce que l’ESC atteigne plus de 90 % de confluence. Retirer l’ESCM de chaque puits par aspiration et laver deux fois avec 100 μL de PBS.
6. Aspirer le PBS et ajouter 100 μL de tampon de lyse contenant la protéinase K, bien mélanger et transférer le lysat d’ESC dans un nouveau tube de 1,5 mL. Chauffer le lysat de l’ESC à 65 °C pendant au moins 1 h à l’aide d’une chambre thermique. Extraire et purifier l’ADN génomique à l’aide d’une méthode conventionnelle de purification de l’ADN phénol-chloroforme suivie d’une précipitation à l’éthanol.
7. Dissoudre l’ADN précipité dans 20 μL d’eau exempte de DNase et déterminer la pureté et la concentration de l’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre. Effectuer une PCR génomique à l’aide d’ensembles d’amorces spécifiques au locus pour amplifier la région cible. Ensuite, vérifiez la séquence et choisissez les clones ESC avec les séquences KI souhaitées.

6. Préparation d’embryons au stade huit cellules et micro-injection de CSE

1. Injecter 5 UI de gonadotrophine sérique de jument gravide (PMSG) par voie intrapéritonéale aux femelles adultes ICR. Après 48 h, injecter 5 UI de gonadotrophine chorionique humaine (hCG) aux mêmes femelles, puis accoupler les femelles traitées aux hormones avec les mâles ICR. Vérifiez le bouchon copulatoire dans le vagin le lendemain (jour embryonnaire 0,5, ED0,5).
   NOTE: Pour évaluer le chimérisme par rapport de couleur de la robe, utiliser le blastocyste de la souche ICR comme receveur pour un ESC qui a un fond de couleur de robe noir ou agouti, ou le blastocyste de la souche C57BL/6 comme receveur pour un ESC qui a le fond albinos.
2. Recueillir l’oviducte à ED1.5 et le placer dans des gouttes de milieu tamponné HEPES (FHM). Récupérer les embryons au stade bicellulaire ou à quatre cellules en rinçant l’oviducte avec FHM à l’aide d’une aiguille de rinçage insérée dans l’infundibulum.
3. Lavez les embryons prélevés en les déplaçant dans plusieurs gouttes fraîches de MHF à l’aide d’une pipette buccale. Culture des embryons dans 50 μL de KSOM tombent sur une boîte de culture cellulaire de 35 mm recouverte d’huile minérale à 37 °C, incubateur à 5% de CO₂ pendant 1 jour jusqu’à ce que le stade de huit cellules ou morula (ED2.5) soit atteint.
4. Si les embryons ne sont pas utilisés le jour de prélèvement suivant, les congeler par vitrification selon le protocole CARD (http://card.medic.kumamoto-u.ac.jp/card/english/sigen/manual/ebvitri.html) et les conserver dans de l’azote liquide jusqu’à utilisation.
5. Préparer des pipettes en verre pour contenir les embryons (diamètre extérieur de 80 à 100 μm) et l’injection d’ESC (diamètre d’environ 13 μm) à l’aide d’un extracteur et d’une microforge.
6. Intégrez une pipette de maintien contenant FHM dans un support capillaire relié à un micro-injecteur et installé sur le côté gauche du micromanipulateur. Connectez une pipette d’injection à un autre micro-injecteur et installez-la sur le côté droit. Aligner les deux pipettes droites dans le champ de vision du microscope.
7. Distribuer 5 μL de polyvinylpyrrolidone (PVP) à 12 μL de polyvinylpyrrolidone (PVP) dans un milieu HFM et 5 μL de gouttes de FHM sur le même couvercle d’une capsule de 60 mm côte à côte et couvrir les gouttes d’huile minérale. Transférer les embryons dans la goutte de MHF de 5 μL et ajouter 1 à 5 μL de la suspension d’ESC à la goutte de MHF qui contient des embryons.
   NOTA: Laisser la suspension ESC et MEF pendant 30 minutes dans la ESM de 4 ml sur une capsule de culture de 60 mm avant la préparation de la goutte. Étant donné que les MEF adhèrent au fond plus rapidement que les ESC, cette incubation de 30 minutes permet la concentration de cellules ES non attachées dans le surnageant.
8. Laver à l’intérieur de la pipette d’injection avec du PVP, puis passer à la goutte contenant les embryons et les ESC.
9. Prenez trois doublets ECS individuels qui viennent de terminer leur division cellulaire (six cellules) dans la pipette d’injection. Tenir un embryon de stade de huit cellules ou de morula, qui a terminé le compactage, avec la pipette de maintien par aspiration. Faites un trou dans la zone pellucide avec une impulsion piézoélectrique (intensité: 3; vitesse: 3). Expulser l’ESC à six cellules à l’intérieur de la zone pellucide et retirer la pipette des embryons.
10. Lavez doucement les embryons injectés par l’ESC avec plusieurs gouttes de KSOM à l’aide d’une pipette buccale et incubez-les dans une nouvelle goutte KSOM de 50 μL recouverte d’huile minérale à 37 °C, 5% de CO₂ jusqu’à ce que les embryons atteignent le stade de blastocyste.
11. Transférer les 10 blastocystes injectés par l’ESC dans chaque corne utérine de souris femelles pseudo-gravides (2,5 jours après le coït, 20 blastocystes par tête).
12. Après l’accouchement de la mère porteuse, sélectionnez au moins deux chimères mâles présentant le rapport chiméristique le plus élevé (70% ou plus, comme confirmé par la couleur du pelage), puis accouplez-les avec des femelles souches appropriées pour obtenir un KI hétérozygote F1.
13. Élever des souris KI individuelles avec des partenaires appropriés pour obtenir des souris ayant un ou plusieurs génotypes ou antécédents génétiques souhaitables adaptés à la recherche.

Résultats

Nous avons ciblé des gènes spécifiques dans l’ESC suivis de la production de chimères pour développer la production de souris manipulées par des gènes selon notre manuscrit^{précédent 11}. Le génotypage de l’ESC (décrit à la rubrique 4) est systématiquement effectué par PCR à l’aide d’amorces. Les amorces sont conçues sur des séquences génomiques en dehors des bras d’homologie et les séquences spécifiques dans le fragment d’ADN KI (Figure 2A). Dans ce cas, aucun allèle de type sauvage n’est amplifié, alors qu’un amplicon PCR d’une taille spécifique n’est détecté que lorsque l’ADN exogène ciblé est KI au locus cible. Les résultats représentatifs de la PCR par génotypage sont présentés à la figure 2B. Neuf clones sur 22 (40,9%) présentaient une bande spécifique au KI dans ce cas. Trois résultats de ciblage représentatifs, y compris le résultat illustré à la figure 2, sont présentés au tableau 1. Ces résultats indiquent que la méthode présentée ici est efficace et reproductible pour le gène KI sans aucune sélection de médicaments.

L’ESC est prélevé dans une pipette d’injection, puis un trou dans la zone pellucide est fait à l’aide d’un plus piézoélectrique, et l’ESC est libéré entre les cellules embryonnaires (Figure 3). Techniquement, ce protocole d’injection d’un ESC dans un embryon à huit cellules ou au stade morula est similaire au protocole d’injection d’ESC dans un blastocyste couramment utilisé dans de nombreuses installations pour souris. Des souris chimériques représentatives sont illustrées à la figure 4. Pour l’évaluation de la couleur du pelage du chimérisme, l’embryon de la souche ICR (albinos, cheveux blancs) a été utilisé comme receveur de l’ESC B6 ou B6-129 F1, et les embryons B6 ont été utilisés comme receveurs de CSE BALB/c (Figure 4).

Figure 1 : Schéma de l’intégration du plasmide circulaire médié par la ribonucléoprotéine (RNP) CRISPR/Cas9 dans le locus spécifique d’un génome ESC. L’électroporation introduit un plasmide circulaire comme vecteur de ciblage dans les CES avec Cas9-RNP. Abréviations : GOI = gène d’intérêt, HA = bras d’homologie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Analyses PCR génomiques pour le criblage par KI de clones d’ESC ciblés. (A) Les amorces de PCR spécifiques au KI sont conçues sur des séquences génomiques en dehors des bras d’homologie (avant) et dans les séquences spécifiques du fragment d’ADN KI (inverse). (B) Résultats représentatifs de la PCR par génotypage. Un génome de type sauvage a été utilisé comme témoin négatif. Abréviations : GOI = gène d’intérêt, HA = bras d’homologie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Images représentatives de l’injection d’embryons au stade huit cellules. (A) Pour la micro-injection, trois doublets de CSE (six cellules, pointes de flèches) sont prélevés. (B) Un trou dans la zone pellucide est fait avec une impulsion piézoélectrique, et les CES sont expulsés entre chaque blastomère. La barre d’échelle représentée est de 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Images représentatives de souris chimères. (A,B) L’ESC dérivé de C57BL/6N (JM8. A3, cheveux Agouti; A) ou B6-129 F1 (cheveux Agouti; B) sont injectés dans des embryons ICR (albinos, cheveux blancs), suivis du transfert des embryons à la mère porteuse. (C) L’ESC dérivé de BALB/c (albinos, cheveux blancs) est injecté dans des embryons C57BL/6J (cheveux noirs), puis transféré les embryons à des mères porteuses. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

ID du projet	Chorosome	5'HA longueur (pb)	Longueur 3'HA (pb)	Taille d’insertion (pb)	Nombre de clones analysés	Nombre de clones de KI	Efficience (%)	Remarques
R26-CC*	Chr6	965	1006	5321	23	2	8.7%	-
R4-03*	Chr8	1000	997	3070	22	6	27.3%	-
P4-01*	Chr15	1000	1000	2569	22	9	40.9%	illustré à la figure 2

Tableau 1 : Efficacité du KI dans trois loci génomiques indépendants de l’ESC. *Ces projets n’ont pas encore été publiés. Le nom de ces gènes sera divulgué dans des manuscrits indépendants à l’avenir.

Discussion

Le ciblage génique des CSE suivi de la production de chimères a été classiquement utilisé pour développer des souris manipulées par des gènes. Néanmoins, l’efficacité de l’incrution génique reste faible même si le vecteur de ciblage contient de longs bras d’homologie (> plusieurs kb en général) avec des cassettes de gènes de sélection de médicaments positives ou négatives. Notre protocole a introduit une méthode ESC KI mise au point de l’ADN exogène long utilisant un plasmide circulaire sans cassettes de sélection de médicaments comme vecteur de ciblage accompagné d’une édition du génome médiée par Cas9-RNP à une efficacité acceptable pour les travaux de routine. Ainsi, ce protocole pourrait contribuer à réduire considérablement le temps nécessaire à la production de souris chimériques génétiquement modifiées par rapport au ciblage conventionnel de l’ESC.

Dans ce protocole, nous avons utilisé CRISPR / Cas9-RNP pour induire des cassures double brin spécifiques au site dans le génome, et un plasmide circulaire a été utilisé comme vecteur de ciblage au lieu d’un vecteur linéarisé. Les plasmides linéarisés sont classiquement utilisés comme vecteur de ciblage pour le gène KI en raison de leur efficacité accrue d’intégration génomique ^8,9,10. Cependant, de nombreuses intégrations génomiques ne sont pas spécifiques même si le vecteur contient des bras homologues⁹. D’autre part, les plasmides circulaires sont rarement utilisés comme vecteurs de ciblage en raison de leur caractéristique difficile à intégrer dans le génome des^CSE12 ou des fibroblastes¹³. Ainsi, il serait possible que l’application d’un plasmide circulaire comme vecteur de ciblage accompagné d’une édition du génome médiée par CRISPR / Cas9 minimise l’intégration aléatoire non spécifique, mais maximise l’intégration spécifique au site dans le génome ESC. Il serait à noter que l’efficacité d’induction de la cassure double brin par CRISPR/Cas9 est assez importante¹⁴, il serait donc essentiel d’utiliser l’ARNg qui induit une rupture double brin à haute efficacité. Il devrait être envisagé de reconcevoir l’ARNg lorsque l’efficacité du KI est trop faible. Dans le cas illustré à la figure 2, 40,9 % des clones de l’ESC présentaient une bande spécifique au KI. En fait, en tant que laboratoire principal de l’institut, nous effectuons régulièrement le ciblage génique à l’aide d’ESC par la méthode décrite ici et avons atteint des rendements de KI de 10% à 50% pour des séquences de 1 à 2 kb telles que Cre, CreERT ou les rapporteurs fluorescents, bien qu’il existe certaines variations en fonction du locus du gène. Les séquences d’ADN les plus longues que nous avons obtenues avec succès en utilisant cette méthode sont d’environ 11,2 kb dans le locus Rosa26, et l’efficacité était de 12,2% (cinq colonies de KI sur 41 colonies analysées).

Il convient également de noter que ce protocole utilise des embryons de stade huit cellules ou morula comme receveurs pour la microinjection d’ESC, mais pas des embryons au stade blastocyste. Bien que nous n’ayons pas mené d’expériences comparatives dans cet article, plusieurs rapports ont montré que l’injection de CSE dans des embryons de stade huit cellules ou morula améliore significativement l’efficacité de la contribution de l’ESC à la progéniture chimérique par rapport à l’injection d’ESC dans les blastocystes^15,16,17,18 . En effet, les injections d’ESC de diverses lignées ESC, y compris C57BL/6, B6-129 F1 et BALB/c, ont généralement entraîné le développement d’une chimère de couleur de robe élevée chez certains enfants, mais pas tous (voir la figure 4). La limite de la méthode est que les CSE injectés dans l’embryon préimplantatoire ne pouvaient pas toujours contribuer aux cellules germinales dans une chimère^19,20. La transmission germinale des CES dépendrait de la qualité de chaque clone de l’ESC¹⁹. Par conséquent, il serait avantageux de développer plusieurs lignées de clones ESC comme sauvegarde pour la production stable de souris chimériques. En conclusion, les protocoles présentés ici utilisent des vecteurs de ciblage simples qui n’incluent que chaque bras d’homologie et gène d’intérêt pour le KI sans cassette résistante aux médicaments. Par conséquent, la construction vectorielle serait beaucoup plus facile et la période de culture pourrait être raccourcie par rapport à la technique classique de ciblage ESC. Cela aiderait à produire rapidement et facilement divers types de souris génétiquement modifiées pour une analyse future dans les sciences de la vie.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
BALB/c ESC	-	-	ESC développé à partir de la souche BALB/c
Bambanker	Nippon Genetics	CS-02-001	Milieu de congélation cellulaire. Section 2.6 et autres
sections Cas9 Nuclease V3	IDT	1081059	Section 3.2 et autres dispositions.
CHIR99021	FUJIFILM Wako	038-23101	Section 4.3
Fragment de gène CreERT	GeneWiz		Section 1.1.
CRISPR-Cas9 crisprRNA	IDT		crisprRNA. Section 3.1 et ailleurs.
CRISPR-Cas9 tracrRNA	IDT	1072534	tracrRNA. Section 3.1 et ailleurs.
DMEM	Nacalai	08458-45	MEF moyen. Section 2.3 et ailleurs
Tampon duplex	IDT	1072534	tampon de dilution de l’ARN. Section 3.1 et ailleurs.
Kit d’extraction FastGene Gel/PCR	Nippon Genetics	FG-91302	Section 1.1 et 1.2.
GlutaMax	Thermo Fisher	35-050-061	Substrat L-glutatime
hCG	ASKA Santé		Section 6.1.
Kit de clonage HD In-Fusion	Clontech	639648	kit de clonage d’ADN. Section 1.3 et ailleurs
JM8. A3 ESC	EuMMCR-ESC		développé à partir de la souche C57BL/6N
Knock-out DMEM	Thermo Fisher	10829018	Section 4.3 et ailleurs, milieu commercial modifié à base de DMEM.
KSOM		Merck MR-121-D	Sections 6.3 et 6.9.
Facteur inhibiteur de la leucémie	FUJIFILM Wako	125-05603	Section 4.3. Aucune donnée de concentration unitaire n’est fournie par le fournisseur. Utilisation de la dilution 1 000 fois dans ce protocole.
Système d’électroporation au néon	Thermo Fisher	MPK5000	Section 3.2, 4.5 et ailleurs. Le système contient un tampon d’électroporation comme celui utilisé dans la section 3.2.
Plasmide NucleoSpin Grade Transfection Takara		U0490B	Section 1.6.
PD0325901	FUJIFILM Wako	162-25291	Section 4.3
PMSG	ASKA Santé		Section 6.1.
Tampon de lyse de la queue	Nacalai	06169-95	Section 5.5.
Trypsine-EDTA	Nacalai	32777-15	Section 2.2 et ailleurs
V6.5 ESC	-	-	ESC développé à partir du dispositif d’irradiation par rayons X de souche B6J-129 F1
	Hitachi	MBR-1618R-BE	Section 2.6.