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Article de méthode

Une plateforme à haut débit pour la culture et l’imagerie 3D d’organoïdes

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DOI :

10.3791/64405

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14 octobre 2022

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1Mechanobiology Institute (MBI), National University of Singapore, 2Biomedical Engineering Department, National University of Singapore, 3Department of Biological Sciences, National University of Singapore, 4IRL 3639 CNRS, 5Department of Microbiology & Immunology, Immunology Translational Research Program, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

Dans cet article

Résumé

Cet article présente un protocole de fabrication pour un nouveau type de substrat de culture avec des centaines de microconteneurs par mm2, dans lequel les organoïdes peuvent être cultivés et observés à l’aide de la microscopie à haute résolution. Les protocoles d’ensemencement cellulaire et d’immunomarquage sont également détaillés.

Résumé

La caractérisation d’un grand nombre de cultures organotypiques tridimensionnelles (3D) (organoïdes) à différentes échelles de résolution est actuellement limitée par les approches d’imagerie standard. Ce protocole décrit un moyen de préparer des puces de culture organoïde microfabriquées, qui permettent une imagerie 3D en direct multi-échelle sur un instrument convivial nécessitant un minimum de manipulations et capable d’atteindre un débit d’imagerie allant jusqu’à 300 organoïdes / h. Ces puces de culture sont compatibles avec les objectifs d’air et d’immersion (air, eau, huile et silicone) et une large gamme de microscopes courants (par exemple, disque rotatif, scanner de point confocale, grand champ et fond clair). De plus, ils peuvent être utilisés avec des modalités de feuille de lumière telles que la technologie de microscopie à objectif unique et à plan unique (SPIM) (soSPIM).

Le protocole décrit ici donne des étapes détaillées pour la préparation des copeaux de culture microfabriqués et la culture et la coloration des organoïdes. Il ne faut que peu de temps pour se familiariser avec et les consommables et l’équipement peuvent être facilement trouvés dans les laboratoires biologiques normaux. Ici, les capacités d’imagerie 3D ne seront démontrées qu’avec des microscopes standard commerciaux (par exemple, disque rotatif pour la reconstruction 3D et microscopie à grand champ pour la surveillance de routine).

Introduction

Dans les cultures de cellules organotypiques 3D, ci-après appelées organoïdes, les cellules souches se différencient et s’auto-organisent en structures spatiales qui partagent de fortes similitudes morphologiques et fonctionnelles avec des organes réels. Les organoïdes offrent des modèles précieux pour étudier la biologie humaine et le développement en dehors du corps 1,2,3. Un nombre croissant de modèles imitant le foie, le cerveau, les reins, les poumons et de nombreux autres organessont en cours de développement 2,4,5. La différenciation dans les organoïdes est dirigée par l’ajout de facteurs de croissance solubles et d’une matrice extracellulaire dans une séquence temporelle précise. Cependant, contrairement aux organes, le développement des organoïdes est assez hétérogène.

Au-delà des nombreux défis biologiques6,7, les cultures organoïdes posent également des défis technologiques en termes de méthodes de culture cellulaire, de caractérisation de la transcriptomique et d’imagerie. Le développement in vivo des organes se produit dans un environnement biologique qui se traduit par une auto-organisation hautement stéréotypée des arrangements cellulaires. Toute altération phénotypique peut être utilisée comme proxy pour diagnostiquer un état malade. En revanche, les organoïdes se développent in vitro dans des microenvironnements peu contrôlés compatibles avec les conditions de culture cellulaire, ce qui entraîne une grande variabilité dans la voie de développement et la formation de la forme pour chaque organoïde individuel.

Une étude récente8 a démontré que l’imagerie quantitative de la forme organoïde (descripteurs de phénotype) couplée à l’évaluation de quelques marqueurs génétiques permet de définir des paysages de développement phénotypiques. On peut soutenir que la capacité de relier la diversité de l’expression génomique chez les organoïdes à leur comportement phénotypique est une étape majeure vers la libération du plein potentiel des cultures organotypiques. Ainsi, il demande le développement d’approches d’imagerie dédiées et à haut contenu permettant la caractérisation des caractéristiques organoïdes aux échelles sous-cellulaires, multicellulaires et organoïdes entières en 3D 9,10.

Nous avons développé une plateforme polyvalente de criblage à haut contenu (HCS) permettant une culture organoïde rationalisée (à partir de cellules souches embryonnaires humaines isolées [CSEh], de cellules souches pluripotentes induites par l’homme [CSIPh] ou de cellules primaires à des organoïdes 3D, multicellulaires et différenciés) et une imagerie 3D rapide et non invasive. Il intègre un dispositif de culture cellulaire 3D miniaturisé de nouvelle génération, appelé puce JeWells (la puce ci-après), qui contient des milliers de micropuits bien disposés flanqués de miroirs à 45° qui permettent une imagerie 3D rapide et haute résolution par microscopie à feuille de lumièreà objectif unique 11. Compatible avec n’importe quel microscope inversé standard commercial, ce système permet l’imagerie de 300 organoïdes en 3D avec une résolution subcellulaire en <1 h.

La microfabrication du dispositif de culture cellulaire part d’un moule microstructuré existant, qui contient des centaines de micropyramides (Figure 1A) avec une base carrée et des parois latérales à 45° par rapport à la base. La figure 1C montre des images au microscope électronique (EM) de telles structures. Le moule lui-même est en poly(diméthylsiloxane) (PDMS) et peut être fabriqué comme une réplique moulée d’un moule primaire (non montré ici) avec les caractéristiques correspondantes (comme des cavités) en utilisant des procédures lithographiques douces standard. Le moule primaire peut être produit par différentes procédures. Celui utilisé pour ce protocole a été fabriqué à l’aide de gravure humide au silicium, comme indiqué dans Galland et al. 11; La procédure de fabrication du moule primaire n’est pas critique pour ce protocole. Les pyramides sont disposées en un réseau carré, avec le même pas pour les directions X et Y (dans ce cas, le pas est de 350 μm).

À titre d’illustration, des expériences de preuve de concept12 ont été publiées pour démontrer que la puce permet des protocoles de culture à long terme (mois) et de différenciation tout en définissant précisément le nombre de cellules initiales dans les puits. Le développement individuel d’un grand nombre d’organoïdes peut être automatiquement surveillé en direct à l’aide de microscopes à fluorescence à feuille de lumière 3D standard à fond clair. De plus, les organoïdes peuvent être récupérés pour effectuer d’autres recherches biologiques (par exemple, analyse transcriptomique). Cet article décrit les protocoles détaillés pour la fabrication des lamelles de couverture de culture cellulaire, la procédure d’ensemencement et de coloration pour la microscopie à fluorescence, ainsi que la récupération des organoïdes.

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Protocole

REMARQUE: La première partie de ce protocole détaille la microfabrication du dispositif de culture cellulaire. Un moule primaire original avec des cavités pyramidales peut être produit en interne - si des installations de micro-fabrication sont disponibles - ou sous-traité à des entreprises externes. Le moule primaire utilisé dans ce travail est produit à l’interne, avec des étapes de processus de fabrication décrites ailleurs11,13. Un protocole de base pour la microfabrication du moule est disponible dans le dossier supplémentaire 1. CRITIQUE : Les opérations des étapes 1 à 6 doivent être effectuées dans un environnement exempt de poussière. Une hotte à flux laminaire ou une salle blanche, si disponible, sont préférables. Tout au long de ces étapes, des équipements de protection individuelle (EPI) doivent être utilisés, tels que des gants, une blouse de laboratoire et des lunettes de sécurité.

1. Découpage en dés du moule PDMS

  1. Coupez de petites portions du moule PDMS à la dimension requise pour le dispositif final (p. ex., 1 cm x 1 cm [Figure 1B]). Coupez-les parallèlement aux directions XY du tableau.
    CRITIQUE: Lors de la découpe du moule PDMS en dés de 1 cm x 1 cm, exécutez les coupes en une seule étape; à l’aide d’une lame de rasoir unilatérale, appliquez une pression et coupez le PDMS en une seule étape. Il s’agit d’éviter la formation de petites particules de PDMS, qui peuvent se déposer à la surface du moule et affecter la qualité des étapes de réplique (étape 3).

2. Préparation de substrats PDMS plats

  1. Peser ~15-20 g de résine base PDMS et 1,5-2 g de son agent de réticulation (c.-à-d. un rapport de 10:1), mélanger soigneusement et dégazer dans un pot sous vide pendant ~20 min.
  2. Verser lentement le PDMS dégazé sur une boîte de Petri en plastique de 15 cm de large (diamètre).
  3. Durcir le PDMS en conservant la boîte de Petri dans un four réglé à 65°C pendant 2 h. Après avoir attendu la fin du durcissement, un film PDMS plat de ~1,5 mm d’épaisseur (contenu dans la boîte de Pétri) est prêt à l’emploi (Figure 2A).
  4. À l’aide d’une lame tranchante, couper des morceaux de 2 cm x 2 cm dans le PDMS (figure 2B-D).
    REMARQUE : L’épaisseur exacte de cette feuille PDMS n’est pas critique ; ~1-2 mm est une plage appropriée. La dimension de la coupe doit être plus grande que le moule texturé mais pas beaucoup plus grande, ce qui entraînerait un gaspillage de matériau.

3. Production de la couche texturée en adhésif durcissable aux UV

  1. Placez un dé de moule PDMS (tel que préparé à l’étape 1) face vers le bas sur la coupe PDMS plate (telle que préparée à l’étape 2) (Figure 3A, B).
    REMARQUE: Assurez-vous que les protubérances pyramidales dans le moule sont orientées vers le substrat PDMS plat et que seule la surface supérieure des pyramides tronquées est en contact. Évaluer l’emplacement correct à l’aide d’un microscope optique (figure 3C,D).
  2. D’un côté du moule, à l’aide d’une pipette, déposer une petite quantité (deux gouttes, environ 0,1 à 0,2 mL) d’adhésif durcissable aux UV (figure 4A).
    REMARQUE: Lorsque le liquide entre en contact avec le bord du moule, la capillarité entraînera le liquide pour remplir la cavité entre le moule lui-même et la coupe plate du PDMS utilisé comme substrat.
    1. Suivez la progression du liquide à l’intérieur de la cavité, par exemple, à l’aide d’un microscope optique inversé avec un objectif de grossissement 10x (Figure 4B,C).
  3. Exposez l’adhésif durcissable aux UV à la lumière UV pour le durcir. Ajustez le temps d’exposition en fonction de la densité de puissance de la source UV utilisée (par exemple, une boîte UV-LED avec une densité de puissance de 35 mW/cm 2;2 min à 50% de puissance dans ce protocole pour durcir complètement l’adhésif).
  4. En utilisant la quantité excessive d’adhésif sur un bord, maintenez l’adhésif durci sur le substrat plat PDMS en appuyant doucement avec un doigt (Figure 5A,B). Pendant ce temps, utilisez une pince à épiler pour pincer un coin du moule à côté du même bord maintenu et décollez-le lentement tout en vous assurant que le film texturé n’est pas soulevé aussi bien.
    REMARQUE : La figure 5C montre le résultat d’une procédure appropriée d’élimination de la moisissure; La figure 5E-G montre la mauvaise procédure.
  5. Coupez l’excès d’adhésif et l’excès de substrat PDMS à l’aide d’une lame de rasoir pour laisser la couche adhésive texturée durcie à plat sur le PDMS avec l’excès de PDMS sur un seul bord (Figure 5D), ce qui sera nécessaire à l’étape 5.

4. Préparation du substrat de la lamelle de couverture

REMARQUE: En tant que substrat pour le dispositif final, des lamelles de couverture arrondies standard de 1,5 H de 25 mm de diamètre sont utilisées. Avant de pouvoir être utilisés, ils doivent être nettoyés pour éliminer la poussière et/ou les résidus organiques de leur surface.

  1. Nettoyage des bordereaux de couverture
    1. Plonger les lames de couverture dans de l’eau savonneuse pendant 5 min pendant l’application des ultrasons (40 kHz, puissance sonore 110 W).
    2. Lavez les lamelles de couverture dans de l’eau désionisée propre (DI), d’abord par immersion et enfin avec de l’eau DI courante provenant d’un robinet. Sécher les lamelles de couverture avec une sarbacane à gaz N2 .
    3. Plonger les lamelles dans un bain d’acétone pendant 5 min; passer immédiatement à un bain 2-propanol (IPA) pendant 5 minutes supplémentaires.
    4. Rincez les lamelles de couverture avec de l’IPA propre à l’aide d’un flacon pressé. Sécher les lamelles de couvercle avec la sarbacane à gaz N2 .
      REMARQUE: Les lamelles de couverture nettoyées à l’aide de cette procédure peuvent être stockées dans un récipient fermé jusqu’à ce qu’elles soient nécessaires. Conservez-les dans une armoire sèche pour éviter que l’humidité ne se dépose à leur surface.
  2. Lorsqu’il est prêt à être utilisé, traiter une lamelle de couverture propre avec un procédé plasma O 2 court pour améliorer son hydrophilie: O2 20 sccm, pression de 3 mbar, 60 W au groupe électrogène RF et durée de 60 s.
  3. Immédiatement après l’activation du plasma, procéder à l’essorage de la fine couche d’adhésif durcissable aux UV en plaçant le couvercle sur le mandrin sous vide d’un enduit standard et en versant une petite goutte d’adhésif au centre du couvercle (Figure 6). Exécutez le processus de spin-coating : étalement pendant 5 s à 500 tr/min, revêtement à 3 000 tr/min pendant 45 s (avec accélération et décélération réglées à 100 tr/min/s).
    1. Si le revêtement par centrifugation n’est pas disponible, utilisez l’autre méthode suivante pour produire un film mince d’adhésif UV sur les lamelles de couverture:
      1. Sur une lamelle de couverture propre, déposer ~0,1 mL d’adhésif durcissable aux UV à l’aide d’une pipette (Figure 7A).
      2. Prenez un deuxième bordereau de couverture et placez-le sur le premier pour que l’adhésif liquide se répartisse uniformément entre les deux lamelles de couverture (figure 7B-D).
      3. Une fois que l’adhésif d’étalement a atteint les bords des lamelles de couverture, séparez-les doucement en les faisant glisser l’un sur l’autre. Une fois séparés, les deux lamelles sont entièrement recouvertes d’une fine couche d’adhésif liquide (figure 7E).
        REMARQUE: Le revêtement peut ne pas être uniforme et lisse seulement si la séparation n’est pas effectuée avec un mouvement lisse et continu.
  4. Prédurcissement de l’adhésif durcissable aux UV
    1. Après le revêtement, prédurcir l’adhésif par exposition aux UV. Ajustez le temps d’exposition en fonction de la densité de puissance de la source UV utilisée (ici, un boîtier UV-LED d’une densité de puissance de 35 mW/cm2 a été utilisé pendant 1 min à 50% de puissance).
      CRITIQUE : L’adhésif utilisé ici est une colle optique. Voir la discussion pour les points clés liés aux doses d’énergie pour son durcissement.

5. Transfert du film texturé sur le substrat final

  1. Prenez l’un des films texturés (préparé à l’étape 3) et placez-le en contact avec le couvercle enduit d’adhésif (préparé à l’étape 4). Assurez-vous que le contact entre l’adhésif partiellement durci sur le couvercle et le film texturé est aussi uniforme que possible (Figure 8A-C).
    CRITIQUE: À ce stade, l’adhésif sur la lamelle de couverture doit être suffisamment solide pour éviter le reflux, ce qui remplirait les cavités pyramidales du film texturé lorsqu’il est mis en contact, mais serait également suffisamment plastique et adhésif pour que le contact puisse être optimisé en appuyant doucement sur le film texturé.
  2. Exposez les lamelles de couverture à la lumière UV jusqu’à ce que la couche adhésive enduite sur la lamelle de couverture soit complètement durcie. Cela scellera le film texturé sur la lamelle de couverture et fournira une isolation étanche entre les cavités pyramidales.
  3. Enfin, décollez le substrat plat PDMS (Figure 8D-F). À l’aide d’une pince à épiler, pincez le PDMS dans un coin du bord où l’excès de matière a été laissé après le rognage (étape 3.5). De cette façon, la couche de film texturée est laissée adhésive à la lamelle de couverture avec un accès ouvert en haut pour l’ensemencement cellulaire. CRITIQUE : Lors du décollement du PDMS plat, le film texturé doit rester bien attaché à la lamelle de couverture. Les défauts d’adhérence sont facilement confirmés si le film texturé peut être décollé de la lamelle de couverture après une exposition finale aux UV sans aucun effort.

6. Passivation à long terme de la fiche de couverture de culture cellulaire pour la culture cellulaire

NOTE: La passivation est obtenue en générant un revêtement conforme et continu d’un copolymère biomimétique avec une structure similaire au groupe polaire de phospholipides dans la membrane cellulaire. Ce vernis de protection empêche l’adhésion des cellules au dispositif de culture cellulaire

  1. Préparer une solution avec 0,5% (p/v) du copolymère biomimétique dissous dans de l’éthanol pur. Conservez la solution à 4 °C pour une utilisation ultérieure.
  2. Placer la lamelle de protection de culture cellulaire dans une boîte de Petri de 35 mm et la recouvrir complètement de la solution de copolymère biomimétique.
  3. Après 5 min, retirer la capsule de culture cellulaire du récipient avec la solution de copolymère biomimétique et la laisser sécher à température ambiante à l’intérieur de la capsule finale dans une hotte de biosécurité (>1 h).
    NOTE: Un revêtement plus épais peut être produit en augmentant la concentration du copolymère biomimétique dans la solution de revêtement; les résultats d’un revêtement plus épais sont visibles au microscope à fond clair (figure 9A).

7. Ensemencement cellulaire

  1. Dégazage et stérilisation
    1. Juste avant l’ensemencement cellulaire, distribuer une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile dans les boîtes de culture cellulaire (généralement 1 mL pour une boîte de Petri de 35 mm). Dégazez la capsule avec le PBS stérile à l’aide d’un appareil à ultrasons pendant ~10 min, suivie de plusieurs tours de pipetage pour éliminer toutes les bulles.
      CRITIQUE : Si l’air est piégé à l’intérieur des cavités pyramidales, il empêchera les cellules d’y pénétrer. Pour s’assurer qu’il n’y a pas d’air piégé dans la pyramide avant l’ensemencement cellulaire, il est recommandé de s’assurer visuellement (sous un microscope de paillasse à fond clair à un grossissement de 10x ou 20x) de l’absence d’air dans ces cavités (Figure 10).
    2. Remplacez le PBS par un milieu de culture stérile et stérilisez la plaque avec de la lumière UV pendant 30 minutes sous une hotte de culture cellulaire.
      NOTE: À partir de cette étape, le plat doit être considéré comme stérile et manipulé à l’aide de techniques stériles. Une autre façon d’éliminer l’air emprisonné du dispositif de culture cellulaire consiste à utiliser un pot à vide avec une pompe à vide.
  2. Préparation de la suspension cellulaire
    REMARQUE: Les cellules peuvent être ensemencées sous forme d’agrégats de cellules simples ou petites et entrer dans les puits d’échantillon par l’ouverture supérieure. Au fil du temps, les cellules insérées s’agrègent et se développent à l’intérieur des puits d’échantillon en sphéroïdes d’une taille supérieure à la taille de l’ouverture. Comme modèles de lignées cellulaires validés, utiliser des cellules cancéreuses HCT116 (CCL-247 ATCC) ou MCF7 (HTB-22 ATCC) maintenues dans le milieu de culture recommandé (lignes directrices ATCC).
    1. Préparer une suspension cellulaire (p. ex., en utilisant un procédé de trypsinisation suivant les lignes directrices de l’ATCC). Suivre les recommandations de trypsinisation / préparation de suspension cellulaire pour les cellules d’intérêt.
    2. Compter et ajuster la concentration cellulaire à 0,5 × 106 cellules/ml dans le milieu de culture recommandé.
  3. Distribution de cellules
    1. Retirer le tampon PBS de la boîte de culture cellulaire de 35 mm, puis distribuer 1 mL de la suspension cellulaire ajustée. Voir la figure 11A pour une image au microscope optique d’une procédure d’ensemencement cellulaire avec une densité cellulaire et une homogénéité adéquates.
    2. Replacez la capsule de culture cellulaire dans l’incubateur cellulaire (37 °C, 5 % de CO2 et 100 % d’humidité) pendant 10 min. Environ 80 à 100 cellules pénètrent dans chaque cavité pyramidale.
      REMARQUE: Il est possible d’augmenter le nombre de cellules par boîte de culture cellulaire en augmentant soit la concentration cellulaire, soit le temps passé avant le retrait de la suspension cellulaire. En règle générale, la formation de sphéroïdes prend plusieurs heures (selon le type de cellule) après l’ensemencement cellulaire et peut être suivie d’un microscope à fond clair (objectifs 4x à 40x; Graphique 11). À partir de là, le milieu de culture, les matrices extracellulaires et les facteurs de croissance de différenciation peuvent être modifiés ou ajoutés à la boîte de culture cellulaire contenant les sphéroïdes conformément aux protocoles de différenciation typiques qui peuvent durer quelques jours, semaines ou mois.
    3. Après les 10 min d’incubation, récupérez la boîte de culture cellulaire de l’incubateur et aspirez doucement la suspension cellulaire pour éliminer les cellules non piégées. Ajouter 1 mL de milieu de culture à une capsule de 35 mm et la remettre dans l’incubateur cellulaire.
      CRITIQUE: À ce stade, parce que les sphéroïdes ne se sont pas encore formés, il est très important d’éviter une forte aspiration ou distribution qui entraînera la perte des cellules. Le contrôle visuel à l’aide d’un microscope à fond clair de paillasse est fortement recommandé à cette étape.

8. Immunomarquage et imagerie

  1. Fixation et coloration
    REMARQUE: Différentes procédures classiques de fixation et d’immunomarquage sont entièrement compatibles avec la boîte de culture cellulaire. Un protocole typique est décrit ici.
    1. Fixer les organoïdes/sphéroïdes dans la boîte de culture cellulaire pendant 20 min dans du paraformaldéhyde à 4% à température ambiante.
    2. Perméabiliser les organoïdes pendant 24 h dans une solution de tensioactif à 1 % dans du PBS stérile à 4 °C sur un agitateur orbital et incuber pendant 24 h dans un tampon de blocage (2 % d’albumine sérique bovine [BSA] et 1 % de tensioactif dans du PBS stérile) à 4 °C sur un agitateur orbitaire.
    3. Incuber les échantillons avec des anticorps primaires d’intérêt à une dilution comprise entre 1/50 et 1/200 (ou selon les recommandations du fabricant) dans un tampon de dilution d’anticorps (2 % de BSA et 0,2 % de tensioactif dans du PBS stérile) à 4 °C pendant 48 h.
    4. Rincer les échantillons 3x avec un tampon de lavage sur un agitateur orbital (3% de NaCl et 0,2% de tensioactif dans du PBS stérile) et incuber avec les anticorps secondaires correspondants dans un tampon de dilution d’anticorps (dilution entre 1/100 et 1/300 ou selon les recommandations du fabricant), 0,5 μg/mL 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), et 0,2 μg/mL Alexa Fluor 647 ou 488 Phalloïdine à 4 °C pendant 24 h sur un agitateur orbital, suivi de cinq étapes de rinçage avec PBS. En option, montez les échantillons à l’aide d’un agent de nettoyage soluble dans l’eau préchauffé à 37 °C.
  2. Imagerie
    NOTE: A ce stade, les organoïdes de la plaque de micropuits peuvent être considérés comme une boîte de culture normale contenant des échantillons fixes et colorés pour l’imagerie: toute procédure d’imagerie standard peut être utilisée sans adaptation ni modification requise. La figure 12 illustre un résultat représentatif d’images et de reconstruction 3D obtenues à l’aide d’un microscope confocal à disque rotatif, avec un objectif air 40x (ouverture numérique 0,75).
    1. Utilisez un logiciel constructeur pour le processus d’acquisition automatique d’images avec les paramètres suivants: temps d’exposition = 50 ms, avec un étage motorisé z pour acquérir une pile z (1 μm Z-step, pour une hauteur totale de 70 μm).
    2. Effectuez une reconstruction 3D à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images.

9. Libération et collecte des organoïdes

REMARQUE: La couche adhésive texturée de la boîte de culture cellulaire peut être détachée de la lamelle de couverture pour libérer les sphéroïdes / organoïdes vivants (avant la fixation) contenus à l’intérieur des cavités pyramidales pour l’analyse des cellules avec d’autres procédures telles que le séquençage de l’ARN, les approches -omiques, les expériences in vitro et la transplantation in vivo .

  1. Avec l’échantillon encore dans la boîte de Petri et dans une hotte de biosécurité, utilisez une lame telle qu’un scalpel pour couper un coin de la couche adhésive texturée.
  2. À l’aide d’une pince à épiler, pincez la couche adhésive texturée sur le bord coupé et retirez-la doucement de la couche de verre, mais maintenez-la immergée dans le milieu (certains organoïdes peuvent rester avec la couche adhésive, Figure 13).
  3. Rincer 3x avec le milieu de culture et recueillir les organoïdes par pipetage.

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Résultats

La figure 8F montre l’aspect typique d’une feuille de couverture de culture cellulaire après une fabrication réussie. La couche adhésive durcissable aux UV semble plate et adhère bien à la lamelle de couverture. Le transfert de la couche adhésive sur la lamelle de couverture peut échouer si la couche sur la lamelle de couverture est surdurcie ou si le retrait du substrat PDMS plat est effectué de manière incorrecte (comme illustré à la figure 8G,H

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Discussion

La procédure de fabrication de la boîte de culture de micropuits, qui permet la culture organoïde à haute densité et la différenciation, a été décrite dans cet article. En raison de la géométrie et de la disposition des microcavités, des milliers de sphéroïdes peuvent être cultivés et colorés dans une seule plaque pendant de longues périodes (plusieurs semaines ou plus) sans perte de matière. À titre de comparaison, une zone de 4 mm x 2 mm sur la plaque de culture cellulaire peut contenir autant de sphéroïdes qu’une seul...

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Déclarations de divulgation

Une demande internationale de brevet a été publiée sous le numéro de publication WO 2021/167535 A1.

Remerciements

La recherche est soutenue par le projet CALIPSO soutenu par la National Research Foundation, Cabinet du Premier ministre, Singapour, dans le cadre de son programme Campus for Research Excellence and Technological Enterprise (CREATE). V.V. remercie l’investigateur NRF-NRFI2018-07, le MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005, le financement de démarrage MBI et ANR ADGastrulo. A.B. et G.G. reconnaissent le soutien du financement de base de MBI. A.B. remercie Andor Technologies pour le prêt du microscope BC43.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2-PropanolThermofisher scientifiqueAA19397K7
AcétoneThermofisher scientifiqueAA19392K7
BC43 Microscope confocal de paillasse AndorTechnologyMicroscope confocal à disque rotatif
Sérum bovin albumine  ;Thermofisher scientific37525
Solution de gravure à l’oxyde tamponnéMerck901621-1L
CEE Spin CoaterBrewer Science200X
DAPIThermofisher scientific62248
Développeur AZ400KMerck18441223164
DI Milliq water Millipore
Sérum fœtal bovin (FBS)Invitrogen10082147
Lamelles en verreMarienfled1176501.5H, rond 25 mm de diamètre
HepesInvitrogen15630080
Imaris logicield’analyse d’images BitPlane
Microscope optique à transmission inverséeNikonTSF100-F
Labsonic MSartorius Stedium BiotechHomogénéisateur à ultrasons
LipidureNOF AmericaCM5206copolymère bio-mimétique
NOA73Norland Products17-345Adhésif durcissable aux UV
Pénicilline-StreptomycineInvitrogen15070063
PhalloidinThermofisher scientific  ;A12379Alexa Fluor
Phosphate Buffer SolutionThermofisherscientific 10010023
Photo Resist AZ5214EMerck14744719710
Pico Outil plasmaDiener Electronic GmbH + Co. KGPico PlasmaPour le traitement au plasma O2
RapiClear 1.52Sunjin labRC 152001agent nettoyant soluble dans l’eau
RCT Plaque chauffante/AgitateurIKA (MY)
Outil de gravure ionique réactiveSamco Inc. (JPN)RIE-10NR
RPMI 1640de11875093 Invitrogenpour cellules HCT116
Sylgard 184 Kit d’élastomère de siliconeDow Corning4019862Polydiméthylsiloxane ou en abrégé, PDMS
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silaneSigma Aldrich448931-10G
Triton X-100Sigma AldrichT9284tensioactif
Trypsine EDTAThermofisher scientifique15400054
Nettoyeur à ultrasonsBransonicCPX2800
UV-KUB 2KLOESource lumineuse UV-LED, longueur d’onde 365 nm, 35 mW/cm2
masque UV à densité de puissance aligneurSUSS Microtec Semiconductor (DE)MJB4
Milieu culture

Références

  1. Kim, J., Koo, B. -K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
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