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Les procédures sont rédigées conformément aux normes nationales pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) du Centre des sciences de la santé de l’Université du Tennessee (UTHSC).
REMARQUE: Les porcelets du groupe expérimental sont soumis à une ligature et à une ponction des cæcales, tandis que le groupe simulé ne subit qu’une ouverture de l’abdomen sans ligature ou ponction des cæcales. Les porcelets des deux groupes sont maintenus sous anesthésie pendant 12 heures après l’intervention afin de laisser suffisamment de temps pour que la septicémie et les lésions rénales aiguës (IRA) s’ensuivent dans le groupe expérimental. La mesure transdermique du DFG suivra 8 h après l’intervention pour un total de 12 h.
1. Approvisionnement et logement des porcelets
- Identifiez une ferme porcine locale qui peut fournir des porcelets néonatals âgés de 3 à 5 jours. Planifiez l’accouchement au début de la semaine pour terminer l’expérimentation avant que les porcelets aient plus de 7 jours.
REMARQUE : Le fournisseur a fourni de trois à cinq porcelets le lundi pour cette expérience; vendredi, les porcelets auraient subi l’expérience. L’utilisation du même sexe et du même âge est essentielle pour éviter les facteurs de confusion.
- À l’arrivée du porcelet, assurez-vous qu’il a une pièce d’identité individuelle (p. ex., une étiquette auriculaire et un registre indiquant le poids et l’âge).
- Hébergez les porcelets dans une unité de soins pour animaux de laboratoire (ULAT) sous les soins d’un vétérinaire agréé. Les animaux sont logés en groupe dans un enclos spacieux avec un sol en béton massif qui se lave facilement à l’eau pour maintenir un bon assainissement.
- Ajoutez un meuble tel qu’une balle lourde pour permettre l’enrichissement et la stimulation de l’environnement.
- S’assurer que le LACU offre des conditions environnementales optimales, y compris les éléments clés suivants: assainissement, nutrition, contrôle de la température, ventilation et cycle jour-nuit en contrôlant l’éclairage.
- Demandez au vétérinaire de vérifier quotidiennement le porcelet, y compris la mesure du poids, pour informer l’investigateur si un porcelet semble malade, ce qui peut nécessiter une exclusion de l’expérience.
- Laissez les porcelets pendant au moins 1 jour pour s’acclimater à l’environnement, ce qui aide à minimiser le stress.
2. Préparation préopératoire
- Préparez la station chirurgicale avant de commencer l’expérience. Cela comprend un coussin chauffant, des cathéters, un ventilateur, un tube endotrachéal, une solution saline héparinée et un sac de liquide de lactate de sonnerie.
REMARQUE: Les porcelets ont une faible capacité de thermorégulation et sont sujets à l’hypothermie qui altère l’hémodynamique22,23. Par conséquent, il est essentiel de prévoir suffisamment de temps pour que le coussin chauffant se réchauffe.
- Préparer 10 mg/mL de α-chloralose en le mélangeant avec une solution saline à 60 °C jusqu’à ce que le mélange soit limpide. Ne pas surchauffer la solution pour éviter la cristallisation du médicament lors du refroidissement. Filtrer avec un filtre à seringue (taille 0,22 μm) avant l’administration aux porcelets.
- Établir un médicament anesthésique basé sur le poids de l’animal - Kétamine: 20 mg / kg et Xylazine: 2,2 mg / kg. Utilisez α chloralose (5 mL/kg) pour maintenir l’anesthésie.
REMARQUE: α-chloralose est utilisé en raison de la facilité d’administration IV par rapport à inhalé
Les anesthésiques, car ces derniers nécessitent une machine anesthésique et un système de récupération approprié à administrer via un tube endotrachéal.
3. Anesthésie
- Effectuer l’induction de l’anesthésie dans l’enclos à porcs, un environnement familier pour les porcelets, afin d’éviter un stress excessif.
- Cueillez délicatement le porcelet par les pattes arrière et administrez de la kétamine: 20 mg / kg et de la xylazine: 2,2 mg / kg dans la patte arrière au niveau du muscle semimembranosus/semitendinosus, à l’aide d’une aiguille de 23 G 3/4.
- Attendez quelques minutes pour que les médicaments fassent effet. Vérifiez le niveau d’anesthésie adéquat en vous assurant que l’animal est suffisamment détendu pour être immobile, avec perte du réflexe palpébral et du tonus de la mâchoire pour permettre un transport facile et sûr au poste chirurgical. Évaluer le réflexe palpébral en touchant le coin interne de l’œil; L’absence de clignement des yeux indique une anesthésie adéquate.
4. Trachéostomie
REMARQUE: Cette expérience est la non-survie, donc une trachéotomie est effectuée pour établir une voie respiratoire pour la ventilation mécanique. La trachéostomie est une procédure rapide et facile, par opposition à l’intubation endotrachéale, qui est difficile chez les porcelets compte tenu de l’anatomie de leur tête et de leurs voies respiratoires supérieures24,25. De plus, un laryngospasme est fréquemment signalé pendant l’intubation, entraînant une période prolongée d’hypoxie et d’hypercarbie pouvant compromettre les résultats26.
- Placez le porcelet en position couchée dorsale. Identifier le cartilage cricothyroïdien en palpant la proéminence du cartilage thyroïdien qui se sent ferme. Stériliser la zone avec de la povidone iodée et de l’éthanol à 70% avant d’appliquer un champ stérile.
- À l’aide d’une lame chirurgicale, faites une incision médiane ventrale de 2-3 cm inférieure à l’extrémité caudale du cartilage thyroïdien.
- À l’aide d’un hémostatique de moustique incurvé, disséquez carrément les tissus et les muscles sous-cutanés sus-jacents (sternohyoideus et coli cutané) jusqu’à ce que la membrane cricothyroïdienne et les premiers anneaux trachéaux soient visualisés. Lors de la dissection, soyez prudent pour éviter de blesser les vaisseaux sanguins.
- Obtenez une vue dégagée de la membrane cricothyroïdienne et des anneaux trachéaux24, puis utilisez une paire de pinces à angle droit mixter longues pour élever les structures.
- Avec une paire de petits ciseaux, faites une petite incision au niveau de la membrane cricothyroïdienne ou du premier anneau trachéal. Étendre la coupe horizontalement à ~0,5 cm pour passer un tube endotrachéal de 3,0 mm.
- Insérez le tube jusqu’à la marque de 5 cm. Assurez-vous de l’expansion thoracique bilatérale et des bruits respiratoires avant de fixer le tube.
- Passez du ruban ombilical autour de la trachée pour la fixer en place. Du ruban adhésif supplémentaire est utilisé pour fixer le tube à la base de la mâchoire.
- Allumez le ventilateur, connectez le tube endotrachéal et roulez les boutons spécifiques (par exemple. Boutons SIMV, boutons PEEP, etc.) pour sélectionner les paramètres de base suivants. Mode de contrôle de la pression: ventilation mécanique intermittente synchronisée (SIMV); pression inspiratoire de pointe (PIP) - 15; pression expiratoire positive (PEP) - 5; Taux- 20; I-temps - 0,6. Après la première analyse des gaz du sang, ajuster les réglages du ventilateur en fonction des résultats des gaz du sang, dans le but de maintenir une oxygénation et une ventilation adéquates.
5. Canulation des vaisseaux fémoraux
- Établir les voies respiratoires et la ventilation, avant de porter l’attention sur les vaisseaux fémoraux pour l’accès veineux et la surveillance invasive de la pression artérielle. L’artère fémorale est identifiée en sentant un pouls au sillon entre les muscles sartorius et gracilis, et la veine peut être trouvée juste médiale à l’artère.
- Pendant que le porcelet est couché en position couchée dorsale, stérilisez la région de l’aine à l’aide de povidone iodée et d’éthanol et appliquez un champ de taille appropriée.
- Utilisez une lame chirurgicale pour créer une incision longitudinale de 3-4 cm, commençant crânienne au niveau du pli inguinal et s’étendant distalement le long du canal fémoral.
- Appliquer une dissection émoussée et nette, en utilisant des pinces et des ciseaux incurvés par les moustiques, respectivement, pour disséquer jusqu’au niveau du faisceau neurovasculaire fémoral. Le faisceau se trouve profondément dans le corps du muscle gracillis27. Disséquer circonférentiellement l’artère fémorale et la veine sur une distance de 2 à 3 cm pour permettre la canulation. Ligate petites branches latérales si nécessaire.
- Appliquez une cravate en soie 3.0 aux extrémités proximales et distales de l’artère et de la veine pour appliquer la traction. Attachez la suture de soie distale sur la veine et l’artère, en ligaturant les vaisseaux.
- En commençant par la veine fémorale, maintenez une traction distale et proximale sur les liens de soie, puis utilisez une paire de micro-ciseaux pour créer une veinotomie.
- Ensuite, utilisez un introducteur de cathéter de prélèvement veineux pour ouvrir le vaisseau tout en insérant un cathéter en polyuréthane prémesuré d’un diamètre interne x diamètre extérieur de 0,86 mm x 1,32 mm. Une fois inséré, attachez la suture de soie proximale 3.0 pour fixer le cathéter. Rincer le cathéter avec 3 mL de solution saline héparinée (1 U/mL). Cette solution peut être obtenue en ajoutant 0,5 mL d’héparine à 50 mL de solution saline normale.
- Insérez un cathéter de pression artérielle invasif en utilisant la même approche ci-dessus pour créer une artériotomie et passer le cathéter.
REMARQUE: Le maintien de la traction distale et proximale est essentiel pour minimiser la perte de sang lors de l’accès à l’artère.
- Une fois les cathéters fixés, couvrez le site avec de la gaze imbibée de solution saline et, si nécessaire, la peau peut être suturée à l’aide d’une suture en soie 3.0 pour prévenir l’infection.
6. Maintien de l’anesthésie, des liquides et des gaz du sang
- Surveiller la profondeur de l’anesthésie tout au long de l’expérience, en utilisant le tonus de la mâchoire et le réflexe palpébral, et administrer α-chloralose, par voie intraveineuse, au besoin pour maintenir l’animal sous anesthésie profonde. Utilisez une dose de charge initiale de 50 mg / kg et 20 mg / kg pour les autres bolus.
- Infuser le lactate de sonnerie à un débit de 4 mL/kg/h tout au long de l’expérience comme fluide d’entretien. Par exemple, si le poids du porcelet est de 3 kg, le débit de perfusion de liquide est de 12 mL/h.
- Pour l’analyse des gaz au chevet du patient, prélever un échantillon de sang artériel dans une seringue héparinée et présenter l’échantillon à l’analyseur. Sélectionnez l’option gaz du sang artériel et attendez ~2-3 s que l’analyseur présente l’aiguille de prélèvement sanguin.
- Insérez délicatement l’aiguille dans l’extrémité de la seringue contenant l’échantillon de sang. Attendez que l’analyseur aspire l’échantillon requis et retirez la seringue. Laissez la machine analyser les gaz du sang et présenter les résultats.
- En fonction des résultats, ajuster le ventilateur pour maintenir le pH entre 7,35 et 7,45, la pression partielle de dioxyde de carbone (PCO2) entre 35 et 45 mmHg et la pression partielle d’oxygène (PaO2) entre 80 et 150 mmHg. Les réglages diffèrent en fonction du type de ventilateur, mais impliquent en grande partie l’augmentation ou la réduction de la fréquence respiratoire à l’aide de boutons appropriés pour compenser l’hypoxie et / ou l’hypercapnie.
- Prélever 3 mL de sang dans un tube vert clair (héparine au lithium). Centrifuger l’échantillon à 2000 xg pendant 15 min, maintenu à 4 °C pour extraire le plasma. Une fois terminé, le plasma peut être analysé immédiatement pour le taux de créatinine sérique avec l’analyseur chimique de chevet ou stocké à -80 ° C pour une analyse ultérieure.
- Surveillez la température en continu à l’aide d’un thermomètre à sonde rectale et ajustez la température du coussin chauffant pour maintenir la température du porcelet entre 101 et 103 °F.
7. Groupe expérimental; ligature et perforation des cæcaux (CLP) 25,28,29
REMARQUE : Pour les porcelets du groupe expérimental, effectuer une CLP pour induire une septicémie polymicrobienne28 et surveiller l’animal pendant 12 heures après la chirurgie afin de laisser suffisamment de temps pour qu’une septicémie sévère s’ensuive. L’enregistrement transdermique du DFG commence à 8 h après la ligature des cæcaux pour permettre 4 h d’enregistrement.
- Utilisez une lame chirurgicale pour créer une incision verticale paramédiane gauche de 5 à 6 cm, car le caecum chez les porcs se trouve dans la fosse paralombairegauche 30. Disséquer les couches de la paroi abdominale, en évitant de blesser les vaisseaux épigastriques superficiels.
- Une fois la couche péritonéale incisée, utilisez un rétracteur pour améliorer l’accès aux structures intra-abdominales.
- Identifiez le côlon spiralé dans le quadrant supérieur gauche de l’abdomen. Tracez le côlon en spirale, caudale et dorsale, pour localiser le caecum. L’iléon est vu rejoignant le côlon spiralé à la base du caecum.
- Litérez le caecum juste distal à la jonction iléo-cæcale (Figure 1).
- À l’aide d’une aiguille de 18 G, faire sept ponctions dans le caecum et extruder les matières fécales dans la région péritonéale.
- Fermez l’abdomen en couches avec une suture en soie 3.0 à l’aide de points de suture simples interrompus ou continus. Une agrafeuse peut également être utilisée pour fermer la couche de peau si disponible.
8. Groupe Sham
- Suivez les étapes 7.2-7.4 comme ci-dessus. Après avoir identifié le caecum, replacez-le intact et fermez la paroi abdominale de la même manière.
- Surveiller les porcelets dans le groupe simulé pendant 12 heures pour éliminer tout biais de confusion attribué à une exposition prolongée à l’anesthésie.
9. Configuration du dispositif de DFG transdermique
- Après 8 h de ligature des selles, préparez-vous à initier la mesure transdermique du DFG.
- Utilisez la version 3.0 du logiciel de service MB pour ajuster la fréquence d’échantillonnage sur le périphérique GFR. Brièvement, connectez le dispositif DFG transdermique au logiciel de l’ordinateur à l’aide du connecteur USB. Ouvrez le logiciel, cliquez sur connecter et réglez la synchronisation à 4000 ms. Cliquez sur Écrire pour enregistrer les paramètres.
NOTE: Cela donne jusqu’à 6 h de temps d’échantillonnage total. Chez les porcs, le DFG transdermique est complété en 4 h. Pour les expériences nécessitant un échantillonnage jusqu’à 12 h, choisissez l’option 8000 ms.
- Fixez les patchs adhésifs double face avec une fenêtre transparente à l’appareil. Fixez l’appareil d’un côté, en veillant à ce que la diode électroluminescente recouvre la fenêtre transparente pour permettre la détection du traceur.
- Rasez la zone recouvrant la paroi thoracique latérale. Fixez la batterie à l’appareil et collez immédiatement le patch adhésif avec l’appareil en place et assurez-vous qu’il est bien fixé (Figure 2). Étant donné que les porcelets sont profondément anesthésiés, le ruban adhésif peut être inutile pour maintenir l’appareil en place.
REMARQUE: Le patch adhésif seul suffit à fixer. Cependant, dans les procédures où l’animal serait manipulé, deviendrait actif ou où l’anesthésie pourrait être perturbée, il pourrait être important d’appliquer un ruban. Un pansement pourrait également être une approche alternative31.
- Un enregistrement de base de 3 à 5 minutes est requis avant l’administration de FITC-sinistrin.
10. Préparation et injection de FITC-sinistrin
- Préparer un mélange de FITC-sinistrin avec une solution saline jusqu’à une concentration finale de 50 mg/mL. La dose administrée au porcelet est de 20 mg/kg. FITC-sinistrin est fourni sous forme de poudre.
NOTE: La FITC-sinistrin peut également être administrée par un cathéter veineux périphérique inséré dans la veine auriculaire. Il est essentiel d’atteindre un niveau maximal élevé en administrant FITC-sinistrin comme bolus de poussée à travers le cathéter veineux de la veine fémorale.
- Fixez la seringue avec le médicament à un côté d’un robinet d’arrêt à trois voies et une chasse d’eau saline de l’autre côté du robinet d’arrêt. Poussez la FITC-sinistrin et suivez immédiatement avec un bolus salin de 5 ml avant de fermer le robinet d’arrêt à trois voies sur la veine du porcelet.
11. Enregistrement transdermique du DFG
- Gardez l’appareil attaché au porcelet pendant 4 h. Pendant ce temps, gardez le porcelet sous anesthésie en utilisant des doses intermittentes de α-chloralose à une concentration de 20 mg / kg pour éviter tout artefact de mouvement.
- À la fin des 4 h, retirez l’appareil et débranchez immédiatement la batterie.
12. Mesure du DFG
- Connectez le dispositif de DFG transdermique à l’ordinateur à l’aide du connecteur USB fourni par le fournisseur.
- Ouvrez le logiciel de lecture pour récupérer les données de l’appareil. Enregistrez les données brutes en cliquant sur la séquence : connexion, lecture, renommage et enregistrement. Comme indiqué dans le manuel, traiter et évaluer les données enregistrées dans le logiciel d’analyse.
- En bref, ouvrez le logiciel version 3.0 et importez les données. Ajustez les positions de décalage, de début et de fin à l’aide des marqueurs automatisés. Supprimez les artefacts si nécessaire, puis cliquez sur Adapter. Cela donne une lecture qui montre la clairance FITC-sinistrin en minutes (t1/2). Le t1/2 est ensuite utilisé pour calculer le DFGt32,33 comme suit:

NOTA : En consultation avec le fabricant, le facteur de conversion utilisé pour les porcs est de 20 (ce qui indique que 20 % du poids corporel est constitué d’espace extracellulaire), comparativement à 21,33 chez le rat (DFGt en mL/min) et à 14 616,8 chez la souris (DFGt en μL/min). En effet, le DFG est mesuré avec précision en fonction du liquide extracellulaire 34,35, qui dépend à son tour du poids corporel36.
13. Euthanasie des porcelets
- Prélever 3 mL de sang après 12 h de CLP pour une analyse biochimique plus approfondie.
- Euthanasier le porcelet en administrant 0,2 mL/kg de mélange prémélangé de pentobarbital sodique à 20 % et de phénytoïne sodique par voie intraveineuse.
- Prélevez le bon rein pour l’étude histopathologique avant d’emmener le porcelet à la morgue.