Article de méthode

Quantifier l’activité antifongique des peptides contre Candida albicans

DOI :

10.3791/64416

⸱

13 janvier 2023

 ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Maryland

Dans cet article

Résumé

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Ce protocole décrit une méthode permettant d’obtenir des données quantitatives sur l’activité antifongique de peptides et d’autres composés, tels que des agents antifongiques à petites molécules, contre Candida albicans. Son utilisation de la densité optique plutôt que de compter les unités formant colonie pour quantifier l’inhibition de la croissance permet d’économiser du temps et des ressources.

Résumé

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Les méthodes traditionnelles pour effectuer des tests de sensibilité antifongique pour Candida albicans prennent beaucoup de temps et manquent de résultats quantitatifs. Par exemple, une approche courante repose sur le placage de cellules traitées avec différentes concentrations de molécules antifongiques sur des plaques de gélose et sur le comptage des colonies pour déterminer la relation entre la concentration des molécules et l’inhibition de la croissance. Cette méthode nécessite de nombreuses plaques et beaucoup de temps pour compter les colonies. Une autre approche courante élimine les plaques et le comptage des colonies en inspectant visuellement les cultures traitées avec des agents antifongiques afin d’identifier la concentration minimale requise pour inhiber la croissance; Cependant, l’inspection visuelle ne produit que des résultats qualitatifs et les informations sur la croissance à des concentrations sous-inhibitrices sont perdues. Ce protocole décrit une méthode pour mesurer la sensibilité de C. albicans aux peptides antifongiques. En s’appuyant sur des mesures de densité optique de cultures, la méthode réduit le temps et les matériaux nécessaires pour obtenir des résultats quantitatifs sur la croissance des cultures à différentes concentrations de peptides. L’incubation du champignon avec des peptides est réalisée dans une plaque de 96 puits à l’aide d’un tampon approprié, avec des témoins ne représentant aucune inhibition de la croissance et une inhibition complète de la croissance. Après l’incubation avec le peptide, les suspensions cellulaires résultantes sont diluées pour réduire l’activité peptidique, puis cultivées pendant la nuit. Après une croissance nocturne, la densité optique de chaque puits est mesurée et comparée aux témoins positifs et négatifs pour calculer l’inhibition de la croissance résultante à chaque concentration peptidique. Les résultats obtenus à l’aide de ce test sont comparables à ceux obtenus selon la méthode traditionnelle de placage des cultures sur des plaques de gélose, mais ce protocole réduit les déchets plastiques et le temps passé à compter les colonies. Bien que les applications de ce protocole se soient concentrées sur les peptides antifongiques, la méthode sera également applicable aux tests d’autres molécules ayant une activité antifongique connue ou suspectée.

Introduction

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Candida albicans est un membre du microbiote humain qui colonise de nombreux endroits, y compris la cavité buccale, la peau, le tractus gastro-intestinal et le vagin1. Pour les patients immunodéprimés en raison de maladies telles que le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) et les traitements immunosuppresseurs, la colonisation de C. albicans peut entraîner une candidose locale ou systémique 2,3. L’utilisation de produits thérapeutiques antifongiques à petites molécules actuellement disponibles, tels que l’amphotéricine B, les azoles ou les échinocandines, peut êtr....

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Protocole

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L’approbation a été obtenue du Comité institutionnel de biosécurité (IBC) de College Park de l’Université du Maryland pour le travail avec C. albicans dans ce protocole (PN 274). La souche SC5314 de C. albicans (voir le tableau des matières) a été utilisée dans la présente étude; Cependant, toute autre souche peut également être utilisée.

1. Préparation du tampon, de l’eau stérile et du milieu de culture

  1. Préparer un tampon de phosphate de sodium (NaPB)26 stérile de 0,1 M à pH 7,4 et diluer à 2 mM et 1 mM avec de l’eau stérile. La préparation de 100 mL chac....

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Résultats

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L’utilisation de mesures OD600 pour quantifier la réduction de la croissance due aux peptides antifongiques permet de gagner un temps considérable par rapport au placage des échantillons et au comptage des UFC. La méthode décrite dans ce protocole nécessite d’effectuer les étapes sur trois jours différents. Le premier jour, environ 1 h est nécessaire pour préparer les tampons et les milieux (sans compter le temps de stérilisation) et inoculer la culture de départ de C. albicans pour une nuit d’incubat.......

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Discussion

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Ce protocole décrit une approche efficace pour obtenir des données quantitatives sur l’activité antifongique des AMP contre l’agent pathogène fongique C. albicans. Une approche alternative courante pour tester les peptides et autres agents antifongiques est la microdilution du bouillon décrite dans la norme M2718 du Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI), mais cette norme se concentre sur l’obtention de résultats visuels qualitatifs plutôt que quantitatifs. Une autre approche alte.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (R03DE029270, T32AI089621B), la National Science Foundation (CBET 1511718), le ministère de l’Éducation (GAANN-P200A180093) et une subvention de démarrage intercampus de l’Université du Maryland.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plaques à 96 puits (fond rond)VWR10062-902
Lecteur de microplaques à absorbanceN/A N/ATout lecteur de microplaques disponible est suffisant
C. albicans strain SC5314ATCC  ;MYA-2876D’autres C. albicans peuvent également être utilisés
HémocytomètreN/AN/APeut être utilisé pour réaliser une courbe standard reliant le nombre de cellules à OD600
Agitateur de microplaquesVWR2620-926
PeptideN/AN/ALes peptides peuvent être synthétisés commercialement par n’importe quel fournisseur fiable ; une pureté de &ge ; L’élimination des sels d’acide trifluoroacétique à 95 % et du chlorhydrate sont recommandées
Réservoirs de réactifs pour pipettes multicanauxVWR18900-320Simplifie le pipetage dans des plaques multipuits avec pipette multicanaux
Phosphate de sodium, dibasiqueFisher ScientificBP332-500Pour la fabrication de NaPB
Phosphate de sodium, monobasiqueFisher ScientificBP329-500Pour la fabrication de NaPB
Spectrophotomètre UVN/AN/ATout spectrophotomètre UV disponible est suffisant
YPD medium poudreBD Life Sciences242820Peut également être fabriqué à partir d’extrait de levure, de peptone et de dextrose

Références

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  1. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: Development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
  2. Arya, N. R., Rafiq, N. B. Candidiasis. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2021).
  3. de Oliveira Santos, G. C., et al.....

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Mots-clés

Peptides antifongiquesdensit optiqueinhibition de la croissancequantification des peptidesplaque de 96 puitsdilution en s rieunit s formant coloniessuspension de levuresensibilit aux antifongiques

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