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Article de méthode

Quantifier l’activité antifongique des peptides contre Candida albicans

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DOI :

10.3791/64416

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13 janvier 2023

 ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Maryland

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une méthode permettant d’obtenir des données quantitatives sur l’activité antifongique de peptides et d’autres composés, tels que des agents antifongiques à petites molécules, contre Candida albicans. Son utilisation de la densité optique plutôt que de compter les unités formant colonie pour quantifier l’inhibition de la croissance permet d’économiser du temps et des ressources.

Résumé

Les méthodes traditionnelles pour effectuer des tests de sensibilité antifongique pour Candida albicans prennent beaucoup de temps et manquent de résultats quantitatifs. Par exemple, une approche courante repose sur le placage de cellules traitées avec différentes concentrations de molécules antifongiques sur des plaques de gélose et sur le comptage des colonies pour déterminer la relation entre la concentration des molécules et l’inhibition de la croissance. Cette méthode nécessite de nombreuses plaques et beaucoup de temps pour compter les colonies. Une autre approche courante élimine les plaques et le comptage des colonies en inspectant visuellement les cultures traitées avec des agents antifongiques afin d’identifier la concentration minimale requise pour inhiber la croissance; Cependant, l’inspection visuelle ne produit que des résultats qualitatifs et les informations sur la croissance à des concentrations sous-inhibitrices sont perdues. Ce protocole décrit une méthode pour mesurer la sensibilité de C. albicans aux peptides antifongiques. En s’appuyant sur des mesures de densité optique de cultures, la méthode réduit le temps et les matériaux nécessaires pour obtenir des résultats quantitatifs sur la croissance des cultures à différentes concentrations de peptides. L’incubation du champignon avec des peptides est réalisée dans une plaque de 96 puits à l’aide d’un tampon approprié, avec des témoins ne représentant aucune inhibition de la croissance et une inhibition complète de la croissance. Après l’incubation avec le peptide, les suspensions cellulaires résultantes sont diluées pour réduire l’activité peptidique, puis cultivées pendant la nuit. Après une croissance nocturne, la densité optique de chaque puits est mesurée et comparée aux témoins positifs et négatifs pour calculer l’inhibition de la croissance résultante à chaque concentration peptidique. Les résultats obtenus à l’aide de ce test sont comparables à ceux obtenus selon la méthode traditionnelle de placage des cultures sur des plaques de gélose, mais ce protocole réduit les déchets plastiques et le temps passé à compter les colonies. Bien que les applications de ce protocole se soient concentrées sur les peptides antifongiques, la méthode sera également applicable aux tests d’autres molécules ayant une activité antifongique connue ou suspectée.

Introduction

Candida albicans est un membre du microbiote humain qui colonise de nombreux endroits, y compris la cavité buccale, la peau, le tractus gastro-intestinal et le vagin1. Pour les patients immunodéprimés en raison de maladies telles que le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) et les traitements immunosuppresseurs, la colonisation de C. albicans peut entraîner une candidose locale ou systémique 2,3. L’utilisation de produits thérapeutiques antifongiques à petites molécules actuellement disponibles, tels que l’amphotéricine B, les azoles ou les échinocandines, peut être compliquée par des problèmes de solubilité et de toxicité et par la résistance des infections aux produits thérapeutiques 4,5. En raison des limites des agents antifongiques actuels, les chercheurs sont continuellement à la recherche de nouvelles molécules antifongiques ayant une activité contre C. albicans.

Les peptides antimicrobiens (AMP) sont une alternative potentielle aux agents antifongiques actuels à petites molécules 6,7,8 et sont proposés pour être moins sensibles au développement de la résistance que les médicaments à petites molécules 9. Les AMPs sont un ensemble diversifié de peptides, mais ils sont souvent cationiques, avec un large spectre d’activité10,11,12. Les AMP ayant une activité contre C. albicans comprennent des peptides bien connus des familles de l’histatine et de la cécropine 13,14,15, ainsi que des peptides décrits plus récemment comme ToAP2, NDBP-5.7 et la variante de l’histatine 5 K11R-K17R 16,17. En raison de leur potentiel pour le traitement des infections à Candida, l’identification et la conception de nouveaux AMP qui ciblent C. albicans est un objectif important pour de nombreux groupes de recherche.

Dans le cadre du processus de développement d’AMP efficaces (et d’autres agents antifongiques) ciblant C. albicans, les tests in vitro sont couramment utilisés pour identifier les peptides prometteurs. Les méthodes pour tester l’activité antifongique contre C. albicans impliquent généralement l’incubation de cellules avec des dilutions en série des AMP (en tampon ou en milieu) dans des plaques à 96 puits. Plusieurs méthodes sont disponibles pour évaluer l’activité antifongique après l’incubation. Une technique décrite par le Clinical Laboratory Standards Institute utilise une évaluation purement visuelle de la turbidité des puits pour déterminer la concentration minimale (CMI) pour l’inhibition complète de la croissance (inhibition d’au moins 50 % pour certains agents antifongiques, comme les azoles et les échinocandines) et ne fournit aucune quantification de la croissance à des concentrations inférieures à la CMI18 . Une autre approche couramment utilisée consiste à quantifier la viabilité après l’incubation avec des AMP en plaquant le contenu des puits sur des plaques de gélose, en incubant les plaques, puis en comptant le nombre d’unités formant colonie (UFC) sur la plaque. Cette méthode a été utilisée pour évaluer un certain nombre de peptides, y compris les peptides à base d’histatine 5, LL-37 et lactoferrinehumaine 19,20,21. Cette technique nécessite un volume relativement important de gélose et un nombre élevé de plaques et implique le comptage fastidieux des UFC sur les plaques. Pour obtenir des données plus quantitatives tout en générant moins de déchets plastiques et en évitant de compter les UFC, le contenu des puits peut être utilisé pour inoculer le milieu frais dans une autre plaque de 96 puits. Après incubation de la plaque nouvellement inoculée, la croissance peut être quantifiée en mesurant la densité optique à 600 nm (OD600) sur un lecteur de plaque absorbante. Cette méthode a été utilisée pour déterminer l’activité antifongique de l’histatine 5 et de ses fragments de dégradation et peptides pénétrant dans les cellules 17,22,23,24,25.

Ce protocole décrit comment tester l’activité antifongique des peptides et utilise la méthode OD600 pour quantifier la réduction de la viabilité de C. albicans due aux peptides.

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Protocole

L’approbation a été obtenue du Comité institutionnel de biosécurité (IBC) de College Park de l’Université du Maryland pour le travail avec C. albicans dans ce protocole (PN 274). La souche SC5314 de C. albicans (voir le tableau des matières) a été utilisée dans la présente étude; Cependant, toute autre souche peut également être utilisée.

1. Préparation du tampon, de l’eau stérile et du milieu de culture

  1. Préparer un tampon de phosphate de sodium (NaPB)26 stérile de 0,1 M à pH 7,4 et diluer à 2 mM et 1 mM avec de l’eau stérile. La préparation de 100 mL chacun de 2 mM de NaPB et de 1 mM de NaPB sera plus que suffisant pour la plupart des applications de ce protocole.
  2. Préparer un milieu liquide stérile levure-peptone-dextrose (YPD, voir le tableau des matières) (10 g/L d’extrait de levure, 20 g/L de dextrose, 20 g/L de peptone). La préparation de 100 mL de YPD sera plus que suffisante pour la plupart des applications de ce protocole.
  3. Préparez de l’eau stérile ultrapure. La préparation de 100 mL d’eau sera plus que suffisante pour la plupart des applications de ce protocole.
    NOTE: Les tampons, les milieux et l’eau sont stérilisés par autoclavage à 121 °C sur un cycle liquide pendant une durée appropriée en fonction du volume dans les récipients autoclavés27. Par exemple, pour les bouteilles contenant 500 mL, le temps d’exposition devrait être de 40 min.

2. Inoculation, culture et sous-culture de C. albicans

ATTENTION : Respectez toutes les réglementations institutionnelles et gouvernementales pour travailler avec C. albicans, qui est souvent classé par les établissements de recherche universitaires comme un organisme de niveau de biosécurité (BSL) 2, quelle que soit sa résistance aux médicaments, et par l’American Type Culture Collection (ATCC) comme un organisme BSL1 ou BSL2, selon la résistance aux médicaments de la souche28.

REMARQUE: Effectuez les parties d’inoculation et de culture de cette étape (étapes 2.1-2.2) la veille du début du test d’activité antifongique. Si possible, effectuez toutes les étapes du protocole avec les cellules (et les solutions qui seront incubées avec les cellules) dans une enceinte de biosécurité.

  1. Inoculer la souche désirée de C. albicans dans 10 mL de milieu YPD dans un tube de culture.
    REMARQUE : La culture peut être inoculée à partir d’un congélateur ou d’une plaque de gélose à partir d’une gélose, mais une source cohérente doit être utilisée pour toutes les données qui seront comparées.
  2. Cultiver la culture pendant la nuit (~12-16 h) à 30 °C et 230 tr/min sur un agitateur rotatif.
  3. Sous-culture de la culture nocturne de C. albicans, et atteindre une DO600 de ~1,0-1,2.
    1. Mesurer la DO600 de la culture de nuit à l’aide d’un spectrophotomètre UV (voir le tableau des matériaux).
    2. D’après la DO 600 de la culture de nuit, utiliser la culture de nuit pour inoculer une sous-culture à une DO600 de 0,1 dans10 mL de YPD.
    3. Cultiver la sous-culture à 30 °C sur un agitateur rotatif à 230 tr/min jusqu’à ce que le diamètre optique600 atteigne ~1,0-1,2, ce qui prendra probablement 4 à 6 h. Compléter l’étape 3 (préparation des solutions peptidiques) pendant la croissance de la sous-culture; La sous-culture sera diluée pour être utilisée dans le test à l’étape 4.

3. Préparation des solutions peptidiques dans une plaque de 96 puits

REMARQUE: Cette étape peut être effectuée à l’avance, si les solutions souches de peptides sont stables pendant le stockage. En règle générale, les solutions peptidiques sont stockées à -20 °C jusqu’à leur utilisation. Ils peuvent être décongelés dans un bain-marie à température ambiante avant de passer à l’étape suivante.

  1. Déterminer la concentration la plus élevée de chaque peptide à tester dans le test. Cela variera en fonction des peptides sélectionnés. Pour les données présentées dans la section des résultats représentatifs, l’histatine 5 et les analogues techniques22 ont été testés, et la concentration la plus élevée testée était de 50 μM.
    REMARQUE : La concentration la plus élevée à tester est déterminée à l’aide de données publiées dans la littérature ou en effectuant des expériences préliminaires sur une large gamme de concentrations de peptides. Dans la mesure du possible, la concentration la plus élevée doit être choisie de manière à observer un plateau pour une réduction complète de la viabilité aux concentrations les plus élevées testées et un plateau pour aucune réduction de la viabilité aux concentrations les plus basses testées, ce qui permet de quantifier toute la gamme de l’activité peptidique.
  2. Dissoudre chaque peptide dans de l’eau stérile à deux fois la concentration la plus élevée désirée. Pour les données présentées dans la section des résultats représentatifs, 150 μL de solutions 100 μM d’histatine 5 et d’analogues modifiés ont été préparés dans de l’eau stérile.
    NOTE: Si un peptide n’est pas soluble dans l’eau, une solubilisation dans un autre solvant peut être nécessaire avant cette étape. Le diméthylsulfoxyde (DMSO) est couramment utilisé pour solubiliser les peptides à une concentration élevée avant de les diluer à la concentration de travail. S’assurer que la concentration finale du DMSO est de 1 % (v/v) ouinférieure à 29 et que les solvants alternatifs n’affectent pas la croissance des cellules. Assurez-vous également que la concentration de solvant est maintenue constante dans tous les puits aux étapes 3.4 à 3.5.
  3. Ajouter 40 μL des solutions mères de peptides désirées au premier puits (colonne 1) de chaque rangée dans une plaque de culture à fond rond de 96 puits (voir le tableau des matériaux). Cette plaque est la planche 1 (Figure 1).
    REMARQUE: Chaque plaque a huit rangées qui sont utilisées pour tester les peptides. Ces rangées peuvent être utilisées pour différents peptides ou pour des répliques des mêmes peptides. N’inclure qu’un seul peptide dans chaque rangée.
  4. Ajouter 20 μL d’eau ultrapure stérile dans les colonnes 2 à 12 des rangées contenant le peptide (figure 1).
    NOTE: Si les souches de peptides ont été préparées avec un solvant autre que de l’eau pure à l’étape 3.2, l’eau stérile de cette étape doit être remplacée par le solvant présent dans la souche de peptide ajouté à la première colonne. Par exemple, si le peptide a été solubilisé dans du DMSO et que le stock de peptides contient 1 % (v/v) de DMSO dans l’eau, de l’eau contenant 1 % de DMSO doit être ajoutée aux colonnes 2 à 12.
  5. Diluer en série les solutions mères de peptides sur la plaque jusqu’à la colonne 10 (Figure 1).
    NOTA: Plutôt que d’effectuer les dilutions en série dans la tôle comme décrit ci-dessous, les dilutions pourraient également être effectuées dans des tubes à microcentrifugeuses et transférées dans la plaque à 96 puits.
    1. Retirer 20 μL de la colonne 1, les transférer dans la colonne 2 et mélanger en les pipetant de haut en bas. La colonne 2 contient maintenant 40 μL de solution peptidique à une dilution de 1:2 de la concentration indiquée dans la colonne 1.
    2. Retirer 20 μL de la colonne 2, les transférer dans la colonne 3 et mélanger en pipetant de haut en bas, de sorte que la colonne 3 contient maintenant 40 μL de solution peptidique à une dilution de 1:4 de la concentration dans la colonne 1.
    3. Répéter ce processus jusqu’à ce que la colonne 10 contienne 40 μL de solution peptidique à une dilution de 1:512 de la concentration dans la colonne 1.
    4. Retirer 20 μL de solution peptidique de la colonne 10 et les jeter. Chaque colonne contient maintenant 20 μL de solution peptidique (colonnes 1 à 10) ou d’eau (colonnes 11 et 12).
      NOTE: Les puits de la colonne 11 servent de contrôles de stérilité, et les puits de la colonne 12 servent de témoins ne contenant aucun peptide.

4. Dilution de la sous-culture de C. albicans

Remarque : Commencez cette étape une fois que la sous-culture a atteint un OD600 de ~1.0-1.2 (étape 2.3.3).

  1. Transférer la sous-culture dans un tube à centrifuger de 15 mL et centrifuger à 3 900 x g pendant 3 minutes à température ambiante pour enduire les cellules. Retirer le surnageant par pipetage ou décantation.
  2. Remettez la pastille en suspension avec 1 mL de NaPB 2 mM (étape 1.1) et transférez la suspension dans un tube à centrifuger de 1,7 mL.
  3. les cellules (comme à l’étape 4.1), jetez le surnageant, puis remettez la pastille en suspension dans 1 mL de NaPB 2 mM.
  4. Répétez l’étape 4.3 deux fois de plus pour laisser les cellules lavées dans 1 mL de NaPB 2 mM.
  5. Déterminer la densité cellulaire de la suspension lavée et calculer le facteur de dilution nécessaire pour obtenir une densité cellulaire de 5 x 105 cellules/mL. Cette concentration conduira finalement à ajouter 1 x 104 cellules à chaque puits de la plaque de 96 puits.
    NOTE: La densité cellulaire de la suspension peut être déterminée à l’aide d’un certain nombre de méthodes, y compris un hémocytomètre ou un compteur cellulaire automatisé. Une courbe standard de densité cellulaire par rapport à OD600 pour la souche d’intérêt cultivée dans des conditions pertinentes a été utilisée pour la présente étude. Cette courbe a été préparée à l’aide d’un hémocytomètre (voir le tableau des matériaux) pour déterminer la densité cellulaire des suspensions avec des valeurs de OD600 variables.
  6. Diluer la suspension cellulaire à 5 x 105 cellules/mL dans 2 mM de NaPB. La préparation de 10 mL de cette suspension diluée sera plus que suffisante pour compléter cette étude.

5. Incubation de C. albicans avec des solutions peptidiques et préparation des cellules pour la quantification de la viabilité

  1. Ajouter 20 μL de la suspension diluée de C. albicans (étape 4.6 ) aux colonnes 1 à 10 et à la colonne 12 de chaque rangée (figure 1).
    REMARQUE: La concentration finale de peptide dans la première colonne est maintenant la moitié de la concentration du stock de peptides. Pour la présente étude, la concentration finale de peptides était de 50 μM à ce stade. La suspension cellulaire finale dans chaque puits contient 2,5 x 105 cellules/mL. Les colonnes 1 à 10 servent de puits expérimentaux pour évaluer l’activité antifongique à différentes concentrations peptidiques, et la colonne 12 sert de contrôle de la croissance sans peptide.
  2. Ajouter 20 μL de NaPB 2 mM à la colonne 11. Tous les puits ont maintenant une concentration finale de 1 mM de NaPB. La colonne 11 sert de contrôle de la stérilité.
  3. Couvrir la plaque 1 (contenant à la fois des cellules et du peptide) et l’incuber à 30 °C pendant 30 min.
    NOTE: Un temps d’incubation de 30 min est suffisant pour de nombreux peptides 17,21,22,30, mais le temps d’incubation peut être augmenté à 60 min si désiré pour tenir compte des peptides qui peuvent nécessiter un temps plus long pour exercer leur activité antifongique 25,31,32.
  4. Préparer une nouvelle plaque de culture de 96 puits (planche 2) pour quantifier la viabilité (figure 2).
    NOTE: La plaque de culture doit être préparée pendant l’incubation de la plaque 1.
    1. Ajouter 100 μL de YPD (étape 1.2) à tous les puits de la plaque.
    2. Ajouter 100 μL de NaPB 2 mM (étape 1.1) à tous les puits de la plaque.
  5. Diluer les échantillons dans la plaque 1 (contenant des cellules et des peptides) et transférer dans la plaque 2 (contenant le milieu et le tampon).
    1. Récupérer la planche 1 de l’incubateur après les 30 min d’incubation.
    2. Diluer chaque puits de la plaque 1 en ajoutant 280 μL de NaPB 1 mM (étape 1.1) pour un volume total de 320 μL dans chaque puits (figure 2).
    3. Mélanger tous les puits contenant des cellules et des peptides en pipetant de haut en bas pour s’assurer que toutes les cellules sont remises en suspension et qu’aucune cellule déposée n’est visible au fond des puits.
    4. Transférer 8 μL de chaque puits de la planche 1 au puits correspondant de la plaque 2. Ce volume transfère environ 250 cellules de chaque puits de la planche 1 dans la planche 2 (figure 2).
  6. Couvrir la plaque 2 et incuber sur un agitateur à microtitrage (voir tableau des matières) à 350 tr/min pendant 17 h à 30 °C.

figure-protocol-1
Figure 1 : Préparation de la planche 1 pour l’incubation de dilutions en série peptidiques avec des cellules. Des dilutions en série du peptide sont faites dans de l’eau, et des cellules de C. albicans sont ajoutées à la planche 1. Une couleur bleue indique que le peptide est présent dans le puits, et le gris indique un puits avec de l’eau et pas de peptide. Les puits contenant des cellules sont indiqués par un motif de points noirs. Après ces étapes, la plaque est incubée pour permettre au peptide d’exercer son activité antifongique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-protocol-2
Figure 2 : Préparation de la planche 2 pour quantifier la réduction de la viabilité due au peptide. Le milieu YPD et le NaPB sont ajoutés à la planche 2. Après dilution du contenu de la planche 1, une partie aliquote de chaque puits est transférée de la planche 1 à la planche 2. La plaque 2 est ensuite incubée pour permettre à toutes les cellules viables de se développer pour la quantification en mesurant le OD600. Pour la planche 2, les puits contenant uniquement du YPD et du NaPB sont indiqués en orange. Les puits contenant des aliquotes de la planche 1 mélangées à la DPJ et au NaPB sont indiqués en vert. Voir la légende de la figure 1 pour la description des couleurs sur la planche 1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

6. Détermination de l’activité antifongique

  1. Obtenir des lectures de OD600 pour chaque puits de la planche 2.
    1. Retirer la planche 2 de l’incubateur après 17 h d’incubation.
    2. Mélanger tous les puits de la planche 2 en picetant de haut en bas pour s’assurer que toutes les cellules sont remises en suspension et qu’aucune cellule décantée n’est visible au fond des puits.
      REMARQUE: Évitez de générer des bulles pendant cette étape, car elles peuvent interférer avec les lectures OD600 . Si des bulles se forment, elles peuvent souvent être éclatées avec une pointe de pipette sèche ou enlevées à l’aide de deux pointes de pipettes pour les sortir du puits.
    3. Utiliser un lecteur de plaque absorbante (voir Tableau des matériaux) à une longueur d’onde de 600 nm pour obtenir la DO600 pour chaque puits.
  2. Calculez l’inhibition de la croissance (en pourcentage) et tracez-la pour déterminer l’effet des peptides sur la croissance de C. albicans.
    1. Pour chaque puits, calculez la réduction de viabilité par rapport au témoin (en pourcentage) à l’aide de l’équationsuivante 17,22,23 :
      figure-protocol-3
      où DO avec peptide est la DO 600 d’un puits contenant une concentration donnée de peptide, DO de fond est la DO600 de la colonne 11 de la même rangée (témoin ne contenant pas de cellules), et
      OD no peptide est la OD600 de la colonne 12 dans la même ligne (témoin contenant des cellules et pas de peptide).
    2. Par exemple, utilisez l’expression suivante pour calculer la réduction de viabilité dans le puits B5 à partir des valeurs de DO600 pour la ligne B :
      figure-protocol-4
  3. Tracer la réduction de la viabilité en fonction de la concentration peptidique.

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Résultats

L’utilisation de mesures OD600 pour quantifier la réduction de la croissance due aux peptides antifongiques permet de gagner un temps considérable par rapport au placage des échantillons et au comptage des UFC. La méthode décrite dans ce protocole nécessite d’effectuer les étapes sur trois jours différents. Le premier jour, environ 1 h est nécessaire pour préparer les tampons et les milieux (sans compter le temps de stérilisation) et inoculer la culture de départ de C. albicans pour une nuit d’incubat...

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Discussion

Ce protocole décrit une approche efficace pour obtenir des données quantitatives sur l’activité antifongique des AMP contre l’agent pathogène fongique C. albicans. Une approche alternative courante pour tester les peptides et autres agents antifongiques est la microdilution du bouillon décrite dans la norme M2718 du Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI), mais cette norme se concentre sur l’obtention de résultats visuels qualitatifs plutôt que quantitatifs. Une autre approche alte...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (R03DE029270, T32AI089621B), la National Science Foundation (CBET 1511718), le ministère de l’Éducation (GAANN-P200A180093) et une subvention de démarrage intercampus de l’Université du Maryland.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plaques à 96 puits (fond rond)VWR10062-902
Lecteur de microplaques à absorbanceN/A N/ATout lecteur de microplaques disponible est suffisant
C. albicans strain SC5314ATCC  ;MYA-2876D’autres C. albicans peuvent également être utilisés
HémocytomètreN/AN/APeut être utilisé pour réaliser une courbe standard reliant le nombre de cellules à OD600
Agitateur de microplaquesVWR2620-926
PeptideN/AN/ALes peptides peuvent être synthétisés commercialement par n’importe quel fournisseur fiable ; une pureté de &ge ; L’élimination des sels d’acide trifluoroacétique à 95 % et du chlorhydrate sont recommandées
Réservoirs de réactifs pour pipettes multicanauxVWR18900-320Simplifie le pipetage dans des plaques multipuits avec pipette multicanaux
Phosphate de sodium, dibasiqueFisher ScientificBP332-500Pour la fabrication de NaPB
Phosphate de sodium, monobasiqueFisher ScientificBP329-500Pour la fabrication de NaPB
Spectrophotomètre UVN/AN/ATout spectrophotomètre UV disponible est suffisant
YPD medium poudreBD Life Sciences242820Peut également être fabriqué à partir d’extrait de levure, de peptone et de dextrose

Références

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