Pour l’observation des troubles des voies biliaires néonatales murines, un canal biliaire intact et une préparation efficace sont nécessaires. Par conséquent, une nouvelle approche pour isoler l’ensemble du système des canaux biliaires extrahépatiques chez les nouveau-nés murins a été développée avec succès tout en maintenant l’intégrité des voies biliaires.
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Article de méthode
Dissection des canaux biliaires extrahépatiques et de la vésicule biliaire chez les nouveau-nés de souris âgés de neuf jours
Dans cet article
Résumé
Résumé
La dissection des voies biliaires néonatales murines a été décrite comme difficile. L’objectif principal de la procédure opératoire standard décrite est l’isolement du canal biliaire extrahépatique (EBD) chez les nouveau-nés de souris sans endommager le canal biliaire pendant la préparation. En raison de sa préparation exceptionnellement étroite par rapport à la lignée cellulaire des cholangiocytes et de la récolte de l’ensemble du système des canaux biliaires extrahépatiques (EBDS), l’approche décrite est extrêmement utile dans la recherche de modèles animaux de troubles des voies biliaires chez le nouveau-né, tels que l’atrésie biliaire. Après l’euthanasie, la cavité péritonéale a été consultée et le système des voies biliaires, le duodénum et le foie ont été extraits avec la résection unique En-bloc (EbR). L’échantillon extrait est placé sur un tapis de mousse, et l’EBD est disséqué des cellules contaminantes de manière atraumatique sans contact nécessaire. La dissection de l’ensemble de l’EBDS est un avantage significatif de cette méthode. Des précautions doivent être prises en raison de la petite taille et de la petite quantité de tissu des canaux biliaires. En utilisant la technique décrite, il n’y a pas de dommages aux cholangiocytes. De plus, la pureté de la technique est reproductible (n = 10). Par conséquent, des échantillons comparables de manière optimale peuvent être récoltés. De plus, aucun tissu des canaux biliaires n’est endommagé, car tout contact avec le système des canaux biliaires peut être évité pendant la préparation, laissant le liquide biliaire à l’intérieur de la vésicule biliaire. Plus important encore, lors de la dissection finale de la vésicule biliaire et des voies biliaires, des microinstruments atraumatiques n’ont été utilisés que légèrement latéralement du canal biliaire sans le serrer. C’est la clé d’un échantillon propre et intact, et essentiel pour une investigation histologique plus approfondie ou l’isolement des cholangiocytes. En résumé, la technique de dissection innovante décrite permet aux opérateurs, en particulier inexpérimentés, disposant de l’équipement nécessaire, d’isoler le EBDS aussi proprement que possible.
Introduction
La genèse et la progression des cholangiopathies telles que l’atrésie biliaire, la cholangite sclérosante primitive (CSP) et la cholangite biliaire primitive (CBP) sont inconnues ou incomplètes 1,2. La compréhension limitée de l’origine et de la progression de ces maladies conduit à une pénurie d’options thérapeutiques3. L’obstacle le plus difficile dans l’étude des troubles des voies biliaires néonatales est d’acquérir une compréhension moléculaire de la physiopathologie. L’une des clés essentielles d’une meilleure compréhension de la pathologie moléculaire est la meilleure observation possible des tissus affectés. Pour éviter une comparabilité réduite et des divergences entre les recherches, telles que l’observation de l’étiologie virale potentielle de l’atrésiebiliaire 4, il est nécessaire de préparer et de partager au mieux les techniques de dissection effectuées. Une préparation pure du tissu cible est nécessaire pour des investigations microscopiques ultérieures ou des cultures organoïdes cellulaires et 3D de reproduction. Cependant, dans les troubles néonatals murins, les échantillons de tissus sont rares et ne se produisent qu’en petite quantité en raison de leur très petite taille. En ce qui concerne les troubles des voies biliaires, des difficultés dans une préparation propre des voies biliaires chez les nouveau-nés murins ont été décrites5. En raison du stade néonatal de développement, la différenciation tissulaire n’est pas trop avancée, ce qui complique la préparation et augmente la difficulté par rapport à la préparation d’échantillons adultes. Par conséquent, le groupe de travail opérationnel a étudié une nouvelle stratégie pour préparer l’EBDS dans un modèle murin néonatal. Dans la présente étude, la technique permet une dissection efficace de chaque échantillon.
Le système des canaux biliaires est placé par voie intrapéritonéale dans la partie supérieure droite de l’abdomen, provenant du foie. La vésicule biliaire est située sous la surface viscérale du lobe droit du foie. Le canal biliaire, ainsi que la veine porte et l’artère hépatique, sont intégrés dans le ligament hépatoduodénal. Il relie directement le foie et le duodénum et draine le liquide biliaire dans le duodénum6. Anatomiquement, le canal biliaire est divisé en canaux hépatiques droit et gauche, le canal hépatique commun, le canal kystique et le canal cholédoque, formé par la confluence du canal kystique et du canal hépatique commun7. Celui-ci finit par vider le liquide biliaire et la salive du canal pancréatique dans le duodénum via l’ampoule de Vater.
Les cholangiocytes tapissent les voies biliaires intra- et extra-hépatiques, vivant dans une niche anatomique compliquée où ils aident à la production de bile et à l’homéostasie8. Le liquide biliaire passe quotidiennement ces cellules épithéliales spécialisées à des concentrations élevées. En particulier, l’entretien du parapluie HCO3- est très important pour protéger contre la toxicité des acides biliaires9. Les cholangiocytes sont la première ligne de défense du système hépatobiliaire contre, par exemple, les micro-organismes luminaux10. L’efficacité de défense des cholangiocytes contre les agressions toxiques peut être affaiblie par une prédisposition génétique. Une surcharge toxique provoque des dommages et des destructions et peut donc entraîner des cholangiopathies. De plus, les voies biliaires en développement ne sont pas complètement capables de tous les mécanismes d’autoprotection, ce qui entraîne une plus grande susceptibilité aux toxines environnementales dans les voies biliaires néonatales11.
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Protocole
Suite à l’approbation éthique (N045/2021), des nouveau-nés de souris C57BL/6 mâles et femelles ont été observés jusqu’à l’âge de 9 jours. Les animaux sont nés et fournis à des fins expérimentales par l’animalerie du Centre médical universitaire de Hambourg-Eppendorf, Hambourg, Allemagne. Les nouveau-nés ont été logés dans une cage avec leurs animaux parents. Les conditions environnementales ont été contrôlées en température (20-24 °C), 12:12 h de cycle lumière-obscurité et humidité relative de 40 % à 70 %.
1. Préparation expérimentale
- Préparez l’équipement requis pour l’opération chirurgicale, y compris les ciseaux, les pinces, etc. (voir le tableau des matériaux).
- Placez les instruments désinfectés et autoclavés sur une surface stérile à côté de la table d’opération.
- Euthanasier rapidement une souris néonatale âgée de P9 par décapitation avec un ciseau opératoire. Placez le corps de la souris néonatale euthanasiée sur un champ d’opération stérile. Disséquer les EBDS chez les nouveau-nés de souris âgés de 9 jours (étape 5).
REMARQUE: La procédure de dissection décrite donne à tout scientifique les outils appropriés pour retirer l’EBDS des souris néonatales et plus âgées. Plus la souris est âgée, plus la préparation est facile.
2. Accès à la cavité péritonéale
- Saisissez la peau au-dessus de l’emplacement de la vessie avec une pince. Inciser un trou de 2 mm de diamètre dans la peau à l’aide de ciseaux, sans endommager le péritoine et les structures sous-jacentes. Étendre la coupe à l’emplacement de la décapitation, en suivant la ligne axillaire avant gauche. Retirez la peau de gauche à droite avec les pinces atraumatiques.
- Saisissez le péritoine entourant la rate. Soulevez-le doucement jusqu’à ce que le péritoine ressemble à une structure en forme de tente et coupez un trou de 1 mm de diamètre au centre. Attendez que la « tente péritonéale » se remplisse d’air. Utilisez un grossissement microscopique de 10x pour cette étape et les suivantes.
- Coupez le péritoine dans une fenêtre encadrée par les côtes inférieures, les deux régions abdominales latérales et la région inférieure de la vessie pour assurer un accès complet au foie, au système des voies biliaires, à l’estomac, à l’intestin grêle et au côlon.
REMARQUE: Pour améliorer l’accès au foie, une incision supplémentaire peut être effectuée, en enlevant les trois côtes les plus basses tout en laissant intactes le processus xiphoïde, le ligament falciforme, le foie et les voies biliaires. La vue sur le foie est facile à obtenir.
3. Examen de la vésicule biliaire et des voies biliaires
REMARQUE : Assurez-vous de garder l’échantillon humide régulièrement pendant toutes les étapes suivantes.
- Tirez délicatement le processus xiphoïde en position cranio-ventrale pour examiner la vésicule biliaire.
REMARQUE: La tension sur le ligament falciforme augmente avec ce mouvement, et la vésicule biliaire attachée devient visible.- Ne tirez que légèrement pour éviter une déchirure incontrôlable du ligament falciforme, ce qui pourrait entraîner une déchirure de la vésicule biliaire du système des voies biliaires. Relâchez l’attraction du processus xiphoïde avant l’étape suivante.
- Tirez doucement vers le bas le duodénum pour libérer le système des voies biliaires.
REMARQUE: Lorsque la tension sur le ligament hépatoduodénal augmente, le tissu des canaux biliaires devient visible.
4. Résection en bloc
- Effectuez la mobilisation en-bloc inférieure en suivant les étapes ci-dessous.
- Identifiez la papille duodénale qui relie le système des canaux biliaires au duodénum.
- Couper à travers le duodénum d’environ 2 cm du côté latéral droit de la papille.
- Couper à travers la zone pylorique. Assurez-vous que le contenu de l’estomac est présent dans la région pylorique entre le lieu de coupe et la papille duodénale.
REMARQUE: Il s’agit d’une étape importante pour la sécurité ultérieure de l’orientation pour l’emplacement correct des parties duodénales buccales et aborales.
- Effectuez la mobilisation en-bloc supérieure.
- Tirez doucement sur le processus xiphoïde et accédez au ligament falciforme.
- Effectuer une coupe de 1 cm de long à travers le ligament falciforme, aussi près que possible du processus xiphoïde, entre la vésicule biliaire et le processus xiphoïde. Assurez-vous de ne pas endommager la vésicule biliaire.
- Couper à travers les structures de connexion suivantes entre le foie et le thorax: œsophage, veine cave inférieure, aorte thoracique, tous les ligaments qui entourent la zone nue du foie et toutes les connexions tissulaires restantes dorsalement.
Remarque : L’échantillon en-bloc est complètement disséqué. Il contient le foie, le système des voies biliaires et le corpus duodénal, qui est relié à la région pylorique de l’estomac.
5. Curage final de la vésicule biliaire et des voies biliaires
- Effectuez la préparation brute en suivant les étapes ci-dessous.
- Placez l’échantillon en bloc sur un tampon en mousse habituellement utilisé pour la déshydratation. Utilisez un grossissement microscopique 20x et deux pinces atraumatiques microchirurgicales avec une taille maximale de pointe de 6 mm pour cette étape et les suivantes.
- Assemblez l’échantillon sur le tampon en mousse. Réorganisez l’échantillon dans la bonne position anatomique. Aplatir la partie orale et orale du duodénum, en effectuant un mouvement doux.
- Commencez le mouvement au niveau de la papille duodénale et continuez jusqu’aux bords tranchants à l’aide d’une pince atraumatique. Lissez le contenu pulpeux blanc de l’estomac, qui ne se produira que dans la partie buccale du duodénum. Assurez-vous d’identifier la partie buccale et la partie aborale du duodénum pour exclure une rotation probable des voies biliaires.
- Coupez les gros restes de tissu hépatique pour commencer la dissection du canal biliaire.
- Effectuez l’isolement final.
- Pressez doucement le tissu hépatique restant dans les pores du tapis de mousse. Assurez-vous que les mouvements de grattage commencent à partir du système des canaux biliaires et mènent aux limites du foie.
- Transférer l’échantillon dans une position plus propre sur le tapis de mousse après quelques mouvements de grattage dans différentes directions. Utilisez l’avantage d’un tissu hépatique moins pressé en arrière-plan pour optimiser la vue afin de différencier au mieux possible le EBDS des cellules indésirables. Grattez le tissu hépatique du canal biliaire jusqu’à ce qu’il ne reste rien, ou le moins possible, de tissu hépatique.
- Traiter le ligament hépatoduodénal jusqu’à ce qu’il reste le EBDS isolé. Enlevez les vaisseaux sanguins intraligamentataires comme l’artère hépatique, la veine porte et les petits restes. Retirez ce filament délicat, avec une légère traction et un grand soin, sur le côté latéral gauche. Cette étape de dissection peut avoir déjà commencé involontairement ou partiellement terminée lors de l’ablation préalable du tissu hépatique, ce qui conduit finalement au même résultat.
NOTE: Les vaisseaux sanguins émergent comme un filament blanc et très délicat d’environ 3-5 mm par voie orale de la papille duodénale et rejoignent le ligament hépatoduodénal du côté latéral gauche, s’accumulant avec le canal biliaire à la triade glissonienne. À la fin de cette étape, l’échantillon final est complètement isolé. S’il est nécessaire d’établir un dossier, il est possible de saisir des images après avoir organisé les structures des voies biliaires dans leur position anatomique (Figure 1). Il est recommandé de faire les dernières étapes de préparation sur un tapis de mousse car l’échantillon ne collera pas autant à la surface du champ d’opération. Si les pores sont humides, le canal biliaire lévite ou flotte. Lors du déplacement de l’échantillon, il ne collera pas aussi fermement qu’il le ferait avec la préparation sur le chiffon d’opération, ce qui n’entraînera aucune déchirure lors du déplacement de l’échantillon.
6. Préparation à l’analyse histologique
- Placer l’échantillon isolé dans une solution tamponnée, un milieu spécial ou des fixateurs contenant du formol (voir le tableau des matières) dès que possible après la dissection.
- Choisissez une solution de stockage appropriée en fonction des étapes de traitement prévues.
ATTENTION : Utilisez des fixateurs contenant du formol uniquement sous une bouche d’aération en raison de leur toxicité aiguë, de leur corrosivité et de divers risques pour la santé.
NOTE: Dans l’étude présentée, les échantillons EBDS ont été insérés dans du paraformaldéhyde, déshydratés et incorporés dans de la paraffine. Ils ont été entreposés à température ambiante et refroidis avant le sectionnement. Dans une armoire chauffante, des tranches de 2 μm ont été conservées pendant la nuit et colorées à l’aide d’hématoxyline conventionnelle et d’éosine4 (voir le tableau des matériaux).
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Résultats
La figure 1A montre l’EBDS d’un nouveau-né murin, qui a été disséqué avec la technique décrite. Au microscope, aucun autre tissu hépatique n’est visible. Le tissu hépatique a été enlevé au cours des dernières étapes d’isolement du protocole et pourrait facilement être distingué du tissu des canaux biliaires en ce qui concerne la couleur et la consistance. La figure 1B montre l’échantillon isolé par rapport à une échelle millimétrique. La longueur de l’EBD (mesur...
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Discussion
Cet article rapportait et discutait de la création et de la validation d’une nouvelle approche chirurgicale pour retirer l’EBDS de souris néonatales euthanasiées. Les résultats microscopiques et histologiques révèlent que l’approche détecte rapidement les EBD et les dissèque près des marges du canal, même chez les souris néonatales. Seuls des instruments chirurgicaux et un microscope avec un grossissement de 20x sont nécessaires pour le protocole décrit. De plus, l’approche permet d’isoler l’ensemble de l’EBDS. La techni...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Les auteurs remercient Johanna Hagens, Pauline Schuppert, Clara Philippi, Dr. med Christian Tomuschat, Svenja Warnke, Dr. Diana Lindner, Prof. Dr. Dirk Westermann, Miriam Tomczak, Nicole Lüder, Nadine Kurzawa, Dr. rer nat. Laia Pagerols Raluy, Birgit Appl et Magdalena Trochimiuk pour leurs contributions. Hans Christian Schmidt a été soutenu financièrement par la bourse Else Kröner-Fresenius-Stiftung iPRIME (2021_EKPK.10), UKE, Hambourg.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 2-Propanol | CHEMSOLUTE | 11365000 | utilisé comme agent déshydratant |
| 30 G canula | B Braun/Sterican, Melsungen Germany | 4656300 | canula pour l’hydratation de l’échantillon |
| Air vent | C + P Mö ; belsysteme GmbH & Co. KG, Breidenbach, Allemagne | Tec-Ononmic AZ 1200 | l’utilisation d’une bouche d’aération permet d’éviter l’inhalation de fixateurs contenant du formol |
| Aqua ad injectabilia Braun | B Braun, Melsungen, Allemagne | 2351744 | saline ; Récipient : Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, pince |
| microchirurgicale | DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland | FD253R | droite, 180 mm (7"), pointe plate-forme, poignée ronde, largeur : 0,800 mm, recouverte de poussière de diamant, non stérile, outil réutilisable en option pour l’observation et toutes les étapes de la préparation, sauf la préparation très finale ; Division de la peau du péritoine |
| Caméra " SmartCAM 5 pouces ; | Basler and Vision Engineering, Send, Royaume-Uni | EVC131A | en option Caméra Lynx Exo module : type de capteur : CMOS, résolution 2560 x 1920 pixels, taille du capteur : 1/2" ; Utilisé pour la production vidéo et l’évaluation technique |
| Machine de déshydratation/Citadel 2000 Tissue Processor | Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Allemagne | 12612613 | utilisé pour la déshydratation automatique, programme court (env. 4,8 h) |
| Éponge de déshydratation ; | Éponge Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne | TT56.1 | pour l’étape finale de dissection, d’autres éponges/tampons en mousse avec une taille de pores minimale de 60 pores par pouce conviennent également, l’utilisation de deux tampons en mousse par cassette d’enrobage est recommandée pour couvrir l’échantillon par le bas et par le haut afin d’éviter de glisser à travers la perforation des cassettes d’enrobage |
| Dulbecco´ ; s Phosphat Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Ne & aigu ; t contient du calzium ou du magnésium, 500 mL |
| Cassettes d’enrobage | Engelbrecht GmbH, Edermü ; nde, Allemagne | 17990 | |
| Eosin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Allemagne | 41-6660-00 | solution de coloration, prête à l’emploi |
| Ciseaux fins CeramaCut | FST, Heidelberg Allemagne | 14959-09 | Pointes : Sharp-Sharp, Alliage / Matériau : Acier inoxydable revêtu de céramique, dentelé :, Oui ; Caractéristique : CeramaCut, Forme de la pointe : Droit, Tranchant : 22 mm, Longueur : 9 cm ; Incision cutanée, incision de la fenêtre péritonéale |
| Graefe Forceps | FST, Heidelberg Allemagne | 11051-10 | Longueur : 10 cm, Forme de l’embout : incurvée, dentelée, Largeur de l’embout : 0,8 mm, Dimensions de l’embout : 0,8 x 0,7 mm, Alliage / Matériau : Acier inoxydable |
| Hématoxyline | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Allemagne | 41-5130-00 | solution de coloration, prête à l’emploi |
| Microscope Highresolotion | Vision Engineering, Envoyer Royaume-Uni | EVO503° ; | Capable d’un grossissement jusqu’à 60x, seuls des grossissements de 6x à 20x ont été utilisés. |
| Microscope | Olympus Optical CO, Ltd., Hambourg, Allemagne | BX60F5 | |
| Vitres de couverture de microscope | Marienfeld, Lauda-Kö ; nigshofen, Allemagne | 101244 | 60 mm de large, en verre SCHOTT D 263 |
| Lames de microscope | R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Allemagne | 03-0060 | |
| Microtome | Leica, Nuß ; loch, Allemagne | SM2010R | Outil pour le sectionnement (2 & micro ; tranches M) ; |
| Seringue Omnifix-F 1 mL | B Braun, Melsungen, Allemagne | 9161406V | seringue sans canule |
| Paraffine | Sakura Finetec, Torrance, USA | 4511 | Tissue-Tek Paraffine Wax Tek III, sans DMSO |
| Machine d’enrobage de paraffine | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Allemagne | TES 99 | La machine d’enrobage utilisée dans cette étude contenait les trois modules individuels suivants : TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. L’échantillon doit être incorporé dans de la paraffine directement après la déshydratation, aucun stockage intermédiaire dans un réfrigérateur ne doit être effectué en raison d’un éventuel rétrécissement et de l’humidité dans le réfrigérateur |
| Paraformaldéhyde (PFA) | Morphisto | 1176201000 | Préparez 1 mL d’aliquotes dans 2 mL Tubes coniques Eppendorf pour les échantillons de foie et 0,5 mL d’aliquotes dans 1 mL Tubes coniques Eppendorf pour échantillons de voies biliaires extrahépatiques, 4 % en PBS ph 7,4 ; |
| Petite pince microchirurgicale ; | EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), Bü ; tthard, Bayern, Germany | (00)165 | Manche rond, droit, pointe de 0,3 mm, outil pour l’observation et chaque étape de la préparation, particulièrement utile pour la préparation finale |
| Règle en acier inoxydable | Agntho’s AB, Lidingö ;, Sweden | 30085-15 | 150mm avec métrique & Graduations en pouces |
| Ciseaux chirurgicaux &ndash ; Sharp-blunt pour la décapitation | FST, Heidelberg Allemagne | 14001-14 | Dispositif pour la décapitation |
| Armoire chauffante | Haraeus, Hanau, Allemagne | T 6060 | les échantillons tranchés doivent être conservés dans l’armoire chauffante pour assurer la fixation de l’échantillon sur les lames de microscope |
Références
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Réimpressions et autorisations
