Évaluation de l’intégrité du point de contrôle de l’assemblage de la broche dans les ovocytes de souris

Summary

L’erreur dans la ségrégation chromosomique est une caractéristique commune dans les ovocytes. Par conséquent, l’étude du point de contrôle de l’assemblage de la broche donne des indices importants sur les mécanismes nécessaires pour produire des œufs sains. Le présent protocole décrit trois essais complémentaires pour évaluer l’intégrité du point de contrôle de l’assemblage de la broche dans les ovocytes de souris.

Abstract

L’aneuploïdie est la principale anomalie génétique causant une fausse couche précoce et un échec de grossesse chez l’homme. La plupart des erreurs dans la ségrégation chromosomique qui donnent lieu à l’aneuploïdie se produisent pendant la méiose dans les ovocytes, mais pourquoi la méiose ovocytaire est sujette aux erreurs n’est toujours pas entièrement comprise. Pendant la division cellulaire, les cellules préviennent les erreurs de ségrégation chromosomique en activant le point de contrôle de l’assemblage du fuseau (SAC). Ce mécanisme de contrôle repose sur la détection des attaches kinétochore (KT)-microtubule (MT) et la détection de la tension générée par les fibres de fuseau. Lorsque les KT ne sont pas attachés, le SAC est activé et empêche la progression du cycle cellulaire. Le SAC est activé d’abord par la kinase MPS1, qui déclenche le recrutement et la formation du complexe de points de contrôle mitotiques (MCC), composé de MAD1, MAD2, BUB3 et BUBR1. Ensuite, le MCC diffuse dans le cytoplasme et séquestre CDC20, un activateur du complexe/cyclosome favorisant l’anaphase (APC/C). Une fois que les KT se fixent aux microtubules et que les chromosomes sont alignés sur la plaque de métaphase, le SAC est réduit au silence, CDC20 est libéré et l’APC / C est activé, déclenchant la dégradation de la cycline B et de la sécurine, permettant ainsi l’apparition de l’anaphase. Comparé aux cellules somatiques, le SAC dans les ovocytes n’est pas aussi efficace parce que les cellules peuvent subir une anaphase malgré des KT non attachées. Comprendre pourquoi le SAC est plus permissif et si cette permissivité est l’une des causes des erreurs de ségrégation chromosomique dans les ovocytes nécessite encore des recherches plus approfondies. Le présent protocole décrit les trois techniques permettant d’évaluer de manière exhaustive l’intégrité des OAC dans les ovocytes de souris. Ces techniques comprennent l’utilisation du nocodazole pour dépolymériser les MT afin d’évaluer la réponse au SAC, le suivi du silençage du SAC en suivant la cinétique de destruction de la sécurine et l’évaluation du recrutement de MAD2 en KT par immunofluorescence. Ensemble, ces techniques sondent les mécanismes nécessaires pour produire des œufs sains en fournissant une évaluation complète de l’intégrité du SAC.

Introduction

L’aneuploïdie, qui résulte d’erreurs dans la ségrégation chromosomique, est la principale cause de fausses couches précoces et est fortement liée aux erreurs de la méiose¹. La méiose est distincte de la mitose parce qu’elle consiste en deux cycles de division cellulaire sans étape intermédiaire de réplication de l’ADN. Dans la méiose I, les chromosomes homologues se séparent tandis que les chromatides sœurs restent ensemble. Dans les ovocytes, cette étape est sujette aux erreurs, conduisant à la production d’œufs aneuploïdes².

Pour éviter les erreurs de ségrégation chromosomique, la plupart de....

Protocol

Toutes les souris utilisées dans ces protocoles ont été hébergées et élevées conformément au Rutgers University Institutional Animal Use and Care Committee (Protocol 201702497) et aux directives des National Institutes of Health. Ces organismes de réglementation ont approuvé toutes les procédures expérimentales impliquant des études sur les animaux. Toutes les souris utilisées dans la présente étude étaient des femelles CF-1 âgées de 6 à 8 semaines.

1. Préparation expérimentale

1. Avant de commencer les évaluations du SAC, prélever des ovocytes de souris en suivant le rapport publié précédemment¹²

Results

Évaluation de la réactivité au SAC par le traitement au nocodazole
Le but de cette expérience est d’évaluer l’activation et la force de SAC. En utilisant le nocodazole pour dépolymériser les microtubules fuseau, tous les kinétochores seront détachés, ce qui provoquera un arrêt du cycle cellulaire médié par le SAC. Dans le système d’imagerie actuel, les ovocytes témoins traités par DMSO extrudaient un corps polaire environ 14 heures après la libération de la milrinone (Figure 1

Discussion

Le point de contrôle de l’assemblage de la broche est un mécanisme de contrôle critique pendant la division cellulaire conçu pour prévenir les erreurs de ségrégation chromosomique. Cela permet à la cellule d’avoir suffisamment de temps pour corriger les attachements KT-MT inappropriés. La méiose dans les ovocytes est un processus sujet aux erreurs, où la plupart des erreurs de ségrégation chromosomiques se produisent pendant la méiose I, conduisant à la génération d’ovules aneuploïdes qui sont la principale cause de faus.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumine sérique bovine (BSA)	Sigma	A4503
DAPI	Life Technologies	D1306
Diméthyl-sulfoxyde (DMSO)	Sigma	D5879
Âne-anti-lapin-Alexa-568	Life Technologies	A10042
EVOS FL Auto Imaging System	Life Technologies		Microscope
à fluorescenceEVOS Onstage Incubator	Life Technologies		Chambre d’incubation
Fond en verre Plaques à 96 puits N 1.5 non revêtu	MatTek Corporation	P96G-1.5-5-F
chèvre-anti-humain-Alexa-633	Life Technologies	A21091
HEPES	Sigma	H3537
Anticorps humains anti-ACA	incorporés	15-234	Dilution 1/30
ImageJ	NIH
KCl	Sigma	P5405
KH2PO4	Sigma	P5655
Leica SP8 équipé d’un objectif à immersion dans l’huile 63× ;, 1.40 NA	Leica
MgSO4· ; 7H20	Sigma	M7774
Milrinone	Sigma	M4659
Na2HPO4	Sigma	S2429
NaCl	Sigma	S5886
NaN3	Sigma	S2002
Nocodazole	Sigma	M1404
Paraformaldhyde (PFA)	Sigma	P6148
PIPES	Sigma	P6757
Rabbit anti-MAD2	Biolegend	924601	Dilution 1/1000 ; précédemment Covance #PRB-452C
Reversine	Cayman Chemical	10004412
Triton-X	Sigma	274348
Tween-20	Sigma	X100
Laboratoires Vectashield	Vector	H-1000