Détection du transfert horizontal de gènes médié par des plasmides conjugatifs naturels chez E. coli

Résumé

La conjugaison intervient dans le transfert horizontal de gènes en mobilisant l’ADN plasmidique à travers deux cellules différentes, facilitant ainsi la propagation de gènes bénéfiques. Ce travail décrit une méthode largement utilisée pour la détection efficace du transfert plasmidique conjugatif, basée sur l’utilisation de marqueurs différentiels dans le plasmide conjugatif, le donneur et le receveur pour détecter la transconjugaison.

Résumé

La conjugaison représente l’un des principaux mécanismes facilitant le transfert horizontal de gènes chez les bactéries à Gram négatif. Ce travail décrit des méthodes pour l’étude de la mobilisation des plasmides conjugatifs naturels, en utilisant deux plasmides naturels comme exemple. Ces protocoles reposent sur la présence différentielle de marqueurs sélectionnables dans le plasmide donneur, receveur et conjugatif. Plus précisément, les méthodes décrites comprennent 1) l’identification des plasmides conjugatifs naturels, 2) la quantification des taux de conjugaison en culture solide et 3) la détection diagnostique des gènes de résistance aux antibiotiques et des types plasmidiques réplicons chez les receveurs transconjugués par réaction en chaîne de la polymérase (PCR). Les protocoles décrits ici ont été développés dans le contexte de l’étude de l’écologie évolutive du transfert horizontal de gènes, afin de dépister la présence de plasmides conjugatifs porteurs de gènes de résistance aux antibiotiques dans les bactéries présentes dans l’environnement. Le transfert efficace de plasmides conjugatifs observé dans ces expériences en culture met en évidence la pertinence biologique de la conjugaison en tant que mécanisme favorisant le transfert horizontal de gènes en général et la propagation de la résistance aux antibiotiques en particulier.

Introduction

En 1946, Lederberg et Tatum¹ ont décrit un processus sexuel chez Escherichia coli K-12 qui est maintenant connu sous le nom de conjugaison. La conjugaison bactérienne est le processus par lequel une cellule bactérienne (le donneur) transfère unilatéralement du matériel génétique à une autre cellule (le receveur) par contact direct de cellule à cellule. La conjugaison est largement distribuée dans les bactéries^2,3, bien que la fraction de cellules donneuses exprimant la machinerie de conjugaison soit généralement très petite⁴.

Les plasmides sont des éléments d’ADN extrachromosomiques qui se répliquent de manière autonome. Outre les gènes impliqués dans la réplication et la maintenance des plasmides, les plasmides transportent fréquemment une cargaison de gènes impliqués dans l’adaptation aux défis environnementaux, tels que les métaux lourds ou l’exposition aux antibiotiques⁵. Les plasmides conjugatifs sont une classe de plasmides avec un ensemble de gènes spécialisés qui permettent leur transfert aux cellules réceptrices et soutiennent leur persistance après le transfert⁶. La taille des plasmides conjugués varie de 21,8 kb à 1,35 Mb chez les bactéries du phylum Pseudomonadota (synonyme de Proteobacteria), avec une médiane d’environ 100 kb ^5,7. Ils ont aussi généralement un faible nombre de copies, peut-être pour maintenir la charge métabolique sur l’hôte faible ^8,9.

L’appareil conjugatif typique se compose de quatre composants: une origine de transfert (oriT), une relaxase, une protéine de couplage de type IV et un système de sécrétion de type IV (une structure en forme de tube appelée pilus qui permet aux donneurs de contacter les receveurs)⁶. Seule une très petite fraction des cellules portant des plasmides conjugatifs exprime la machinerie de conjugaison⁴, mais si les plasmides offrent un avantage de fitness, les transconjuguants peuvent rapidement se développer dans la population. Entre 35 % et plus de 80 % des isolats d’E. coli prélevés dans différents habitats ont des plasmides conjugués avec des gènes qui confèrent une résistance à au moins un antibiotique^10,11; Par conséquent, le transfert horizontal de gènes médié par des plasmides conjugatifs est un mécanisme majeur de la propagation mondiale des gènes de résistance aux antibiotiques¹².

Les expériences d’accouplement menées en culture en laboratoire ont montré que la fréquence de conjugaison est affectée par de multiples facteurs, notamment la nature des cellules receveuses, la phase de croissance, la densité cellulaire, le rapport donneur-receveur, si la conjugaison est effectuée dans des milieux liquides ou solides, le carbone, l’oxygène, les sels biliaires, les concentrations de métaux, la présence de cellules de mammifères, la température, le pH et le temps d’accouplement^{13,14, 15}.

Ce travail décrit des protocoles pour détecter la présence de plasmides conjugatifs dans une souche hôte donnée, pour quantifier les taux de conjugaison en culture solide et pour vérifier leur transfert aux cellules receveuses. Ces protocoles peuvent être utilisés comme première étape pour l’identification de plasmides conjugatifs naturels adaptés à la recherche. Ils utilisent un nombre minimum d’étapes simplifiées car ils sont conçus pour dépister la présence de plasmides conjugatifs dans les bactéries obtenues à partir de sources multiples (environnementales, commensales et pathogènes) à grande échelle (des dizaines à des centaines de donneurs).

De plus, des tests permettant de détecter si la mobilisation d’un plasmide conjugatif donné est indépendante de l’antibiotique utilisé pour la détection (c.-à-d. la pertinence du gène de résistance aux antibiotiques en cours de sélection) et de comparer les taux de conjugaison de deux plasmides conjugatifs trouvés dans différents isolats environnementaux sont présentés.

Sur la base de la composition génétique des plasmides conjugatifs pertinents (plasmid replicon et constitution de gènes de résistance aux antibiotiques), chaque étape du protocole peut être modifiée pour étudier l’impact d’une variété de facteurs susceptibles d’affecter le taux de conjugaison.

Plan expérimental général :
Les composants essentiels nécessaires à la mise en place d’une expérience d’accouplement sont les cellules du donneur, une souche receveuse et des milieux solides pour sélectionner les donneurs (antibiotique A), les receveurs (antibiotique B) et les transconjuguants (antibiotiques A et B). Les transconjuguants sont des cellules receveuses qui maintiennent de manière stable le plasmide conjugatif du donneur.

Les cellules du donneur sont résistantes à un antibiotique (antibiotique A) et sont sensibles au ou aux marqueurs utilisés pour sélectionner les cellules receveuses (antibiotique B). Il n’est pas nécessaire de connaître a priori l’emplacement génomique du gène de résistance aux antibiotiques (c.-à-d. s’il est situé dans le chromosome ou dans un plasmide de la cellule du donneur), car la mobilisation des marqueurs de résistance aux antibiotiques chez le receveur (après un contact direct donneur-receveur) implique que les marqueurs fournis par le donneur se trouvaient dans un plasmide.

Une souche receveuse (connue pour prendre des plasmides conjugatifs) doit avoir un marqueur sélectionnable stable qui n’est pas présent chez le donneur; Ce marqueur sélectionnable est généralement résistant à un antibiotique ou biocide situé dans le chromosome. Le choix du receveur à utiliser dans les expériences d’accouplement est critique, car certaines souches d’E. coli varient dans leur capacité à prendre des plasmides conjugatifs¹⁶.

Une fois ces composants établis, toute colonie qui se développe sur un milieu contenant à la fois des antibiotiques (A et B) après un contact entre donneurs et receveurs est un transconjuguant putatif (Figure 1). Cela suppose que les donneurs peuvent se développer dans des milieux avec l’antibiotique A mais ne peuvent pas se développer dans les milieux avec l’antibiotique B, et que les receveurs sont capables de se développer dans les milieux avec l’antibiotique B, mais pas avec l’antibiotique A. La transconjugaison peut être confirmée à l’aide de deux tests diagnostiques. Le premier test consiste en la détection (par amplification par amplification par réaction en chaîne de la polymérase [PCR] de gènes, ou d’autres méthodes) de gènes trouvés dans le plasmide conjugatif dans les colonies transconjuguantes. Le deuxième test implique l’utilisation de marqueurs de couleur différentiels de colonies basés sur le métabolisme du lactose. La couleur différentielle de la colonie est révélée par l’utilisation de la gélose MacConkey; Le lactose contenu dans la gélose peut être utilisé comme source de fermentation par les microorganismes fermenteurs de lactose (^LAC+). Ces micro-organismes produisent des acides organiques, en particulier de l’acide lactique, qui abaissent le pH. Le rouge neutre est un indicateur de pH inclus dans le milieu qui passe du blanc cassé au rouge vif/rose lorsque le pH descend en dessous de 6,8¹⁷. Ainsi, les souches d’E. coli à lactose positif produisent de plus grandes colonies roses sur la gélose MacConkey, tandis que les souches lactose négatives produisent des colonies jaune pâle et des colonies plus petites sur la gélose MacConkey.

Figure 1 : Plan expérimental utilisé pour détecter la présence de plasmides conjugatifs dans les souches de donneurs. Dans cet exemple, le donneur est porteur d’un plasmide conjugatif avec un gène de résistance aux antibiotiques qui lui confère une résistance à l’antibiotique A, mais il est sensible à l’antibiotique B. Inversement, le receveur a un déterminant de résistance chromosomique qui confère une protection contre l’antibiotique B, mais il est sensible à l’antibiotique A. Les transconjuguants sont résistants aux deux antibiotiques (A et B), parce qu’ils ont le plasmide conjugatif du donneur qui confère une résistance à l’antibiotique A et le chromosome du receveur qui confère une protection contre l’antibiotique B. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Le taux de conjugaison d’un couple donneur-receveur (dans des conditions expérimentales données) peut être calculé en divisant le nombre de transconjuguants par le nombre de donneurs ou par le nombre de receveurs; Le premier taux indique la fraction de cellules donneuses présentant une expression fonctionnelle de la machinerie de conjugaison par le donneur^16,18, tandis que le second taux indique la capacité du receveur à prendre des plasmides conjugatifs ^19,20. Dans cette étude, sauf indication contraire, le taux de conjugaison représente la fraction des cellules receveuses qui deviennent transconjuguantes (c.-à-d. le taux par receveur).

Ici, deux expériences d’accouplement indépendantes sont rapportées, impliquant un receveur d’E . coli et deux donneurs d’E. coli. En outre, différents antibiotiques ont été utilisés pour sélectionner des transconjuguants pour l’un des donneurs afin de confirmer qu’un seul plasmide multirésistant peut être sélectionné avec l’un des gènes de résistance aux antibiotiques trouvés dans le plasmide conjugatif.

Les souches donneuses et receveuses utilisées dans ce travail ont été entièrement séquencées pour comprendre toutes les composantes de ce système expérimental; Cependant, ces protocoles ont été conçus pour dépister la présence de plasmides conjugatifs chez des hôtes de séquence inconnue, et peuvent également être utilisés dans ce contexte expérimental; Cependant, dans ce cas, les gènes pertinents sont séquencés en premier.

Les souches donneuses et receveuses utilisées dans le protocole sont les suivantes :

Donateur 1. E. coli SW4955 a été collecté dans un lac de Baton Rouge (LA, USA). Il a un plasmide conjugatif de 134 797 pb (p134797) avec des réponses IncFIC(FII) et IncFIB (AP001918). Ce plasmide conjugatif possède des gènes qui confèrent une résistance aux céphalosporines de troisième génération (bla_CTX-M-55), aux aminosides (aac(3)-IIa et aadA1), aux phénicols (catA2), aux tétracyclines (tet(A)), au triméthoprime (dfrA14) et aux sulfamides (sul3). Pour une carte complète de p134797, veuillez consulter la figure 2A. E. coli SW4955 est positif au lactose, produisant des colonies roses sur gélose MacConkey.

Donateur 2. E. coli SW7037 a été recueilli dans le lac Érié (Ottawa County, OH, USA). Il porte un plasmide conjugatif de 101 718 pb (p101718) avec un réplicon IncI1-I(Alpha). Ce plasmide conjugatif possède un gène qui confère une résistance aux bêta-lactamines (bla_CMJ-2). Pour une carte complète de p101718, veuillez consulter la figure 2B. E. coli SW7037 est également positif au lactose, produisant des colonies roses sur gélose MacConkey.

Figure 2 : Carte génétique des plasmides conjugatifs utilisés dans cette étude. (A) Plasmide p134797, le plasmide conjugatif trouvé dans la souche SW4955 d’E. coli. (B) Plasmide p101718, le plasmide conjugatif trouvé dans la souche SW7037 d’E. coli. Les gènes de résistance aux antibiotiques sont surlignés en bleu et les gènes appartenant à l’appareil conjugatif sont surlignés en rouge. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

destinataire. E. coli LMB100 est utilisé comme destinataire. Il s’agit d’une souche sans plasmide résistante à la rifampicine (100 mg/L) et à la streptomycine (100 mg/L). Avoir une résistance à deux antibiotiques réduit la possibilité de mutations de résistance chez le donneur qui interféreraient avec l’interprétation des résultats. De plus, E. coli LMB100 est lactose-négatif et peut être distingué des deux souches donneuses parce qu’il produit des colonies jaune pâle et de petites colonies (par opposition aux colonies roses plus grandes) sur la gélose MacConkey.

Lorsque le donneur est lactose-négatif, nous recommandons d’utiliser un receveur lactose-positif (par exemple, E. coli J53). Les souches LMB100 et J53 sont disponibles pour d’autres laboratoires. Veuillez envoyer une demande au Dr Gerardo Cortés-Cortés avec une adresse et un numéro FedEx.

Le support solide nécessaire pour sélectionner et compter les donneurs, les receveurs et les transconjuguants est la gélose MacConkey dans des boîtes de Petri de 100 mm de diamètre. L’ajout des antibiotiques suivants est nécessaire : (i) Milieu A : carbénicilline (100 mg/L) pour compter les donneurs et s’assurer que les receveurs ne peuvent pas se développer avec cet antibiotique. (ii) Milieu B : rifampicine (100 mg/L) + streptomycine (100 mg/L) pour compter les receveurs et s’assurer que les donneurs ne peuvent pas cultiver dans ces deux antibiotiques. (iii) Milieux AB : carbénicilline (100 mg/L) + rifampicine (100 mg/L) + streptomycine (100 mg/L) pour obtenir et compter les transconjugants. (iv) Milieu C : pas d’antibiotiques pour strier tous les isolats étudiés.

Les taux de conjugaison des plasmides conjugatifs d’E. coli SW4955 et E. coli SW7037 à E. coli LMB100 sont comparés. De plus, dans le cas du plasmide conjugatif p134797 (souche SW4955), l’antibiotique carbénicilline (100 mg/L) est remplacé par la gentamicine (2 mg/L), le chloramphénicol (25 mg/L), la tétracycline (10 mg/L), le triméthoprime (20 mg/L) ou le sulfaméthoxazole (100 mg/L) dans des expériences ultérieures visant à déterminer si le marqueur de résistance aux antibiotiques utilisé pour la sélection a un impact sur les résultats.

Protocole

1. Méthode 1 : Conjugaison

1. Jour 1 : Striez les donneurs et les receveurs. Strier séparément des stocks de glycérol sur le milieu C (gélose MacConkey sans antibiotiques) et incuber pendant une nuit à 37 °C.
   NOTE: Cette étape est nécessaire pour s’assurer que l’expérience est menée avec des isolats purs et pour confirmer le phénotype du lactose par la couleur des colonies.
2. Jour 2 : Étiqueter un tube de culture de 14,0 ml pour chaque donneur et receveur. Sélectionner une seule colonie de chaque donneur et receveur et les cultiver pendant la nuit (18 h) dans des tubes de culture séparés de 14,0 ml contenant 2 mL de bouillon Mueller Hinton à 37 °C et en agitant à 200 tr/min.
   NOTE: Dans les souches utilisées, la phase stationnaire est atteinte après une culture nocturne de 18 h.
3. Jour 3 : Mesurer la densité optique à 600 nm (OD600) de la culture de nuit de chaque donneur et receveur (sans vortex) en utilisant une dilution 1:10 de 900 μL de solution saline et de 100 μL de culture de nuit.
4. Ajuster la densité optique de chaque donneur et receveur à 2,0 (DO₆₀₀ = 2,0) avec une solution saline stérilisée (0,85 % de NaCl dans l’eau).
   REMARQUE : Une culture nocturne d’E. coli avec une DO₆₀₀ = 2,0 contient 1,6 x 10⁹ UFC/mL.
5. Étiqueter un tube microcentrifuge de 1,5 mL « tube d’accouplement », indiquant les souches donneuse et receveuse. Transfère 500 μL de la suspension ajustée (DO₆₀₀ = 2,0) de chaque donneur et receveur et place-les dans le tube d’accouplement (ce tube d’accouplement aurait 0,8 x 10⁹ UFC/mL de chaque donneur et receveur). Mélanger délicatement le tube d’accouplement par inversion.
6. Centrifuger le tube d’accouplement pendant 10 min à 500 x g à température ambiante.
7. Sans déranger la pastille, extraire à la pipette 800 μL du tube de conjugaison. Il devrait rester 200 μL dans le tube de conjugaison.
   REMARQUE : Jeter le surnageant dans un contenant d’eau de Javel à 10 % pour inactiver les bactéries dans la suspension.
8. Incuber le tube d’accouplement pendant 18 h (pendant la nuit) à 37 °C dans un incubateur. L’accouplement a lieu pendant la période d’incubation.
   NOTE: Cette étape doit être faite sans trembler afin de ne pas casser le philis conjugatif.
9. En tant que contrôle négatif, strier la culture nocturne des donneurs sur le milieu B et des receveurs sur le milieu A. Incuber les plaques pendant la nuit à 37 °C
10. Jour 4: Ajouter 800 μL de solution saline dans le tube d’accouplement et le vortex pour remettre en suspension (cela reconstitue le mélange d’accouplement à 1 mL).
    REMARQUE: Le vortex brise les bactéries d’accouplement et homogénéise la culture pour quantifier l’UFC / mL.
11. Préparer des dilutions 1:10 (de 1 x 10⁰ à 1 x ^10-7) du mélange d’accouplement. Plaque 100 μL de dilutions 10-5 à ^10-7 sur les milieux A et B, et toutes les dilutions sur milieu AB.
    NOTE: Dlution 10⁰ fait référence au tube net.
12. Laissez sécher les assiettes avant de les placer dans l’incubateur à l’envers. Incuber les plaques pendant 18 h (toute la nuit) à 37 °C.
13. Jour 5 : Inspecter les contrôles négatifs pour s’assurer que les traces de cultures pures du jour au lendemain des donneurs ne se sont pas développées sur le milieu B, et que la culture pure du jour au lendemain des receveurs ne s’est pas développée sur le milieu A.
14. Noter le nombre de colonies et de dilutions pouvant être comptées :
    1. Compter les colonies dans le milieu A; Ce sont les donateurs. Les colonies doivent être roses (figure 3A,B).
    2. Compter les colonies dans le milieu B; Ce sont les destinataires et les transconjuguants. Les colonies doivent être jaune pâle (figure 3C).
    3. Compter les colonies dans les médias AB; Ce sont les transjugaisants. Les colonies doivent être jaune pâle.
       REMARQUE: Sélectionnez une plaque dénombrable. Une plaque dénombrable compte entre 30 et 300 colonies (plus de 300 colonies seraient difficiles à compter, et moins de 30 colonies sont considérées comme une taille d’échantillon trop petite pour présenter une représentation précise de l’échantillon original).
15. Calculer la fréquence de conjugaison par donneur ou par receveur
    Fréquence de conjugaison par donneur = (UFC/mL du transconjuguant [média AB])/ (UFC/mL des donneurs [milieu A]) x 100
    Fréquence de conjugaison par receveur = (UFC/mL du transconjuguant [média AB])/ (UFC/ml des receveurs et transconjuguants [milieu B]) x 100
    REMARQUE : La fréquence de conjugaison pour ce protocole a été calculée en divisant les transconjuguants par le nombre de receveurs, multiplié par 100. Selon la littérature, la quantité résultante de conjugaison pourrait être nommée fréquence exconjuguante, fréquence de transfert de gènes, fréquence de conjugaison, rendement recombinant, efficacité du transfert plasmidique, fréquence de conjugaison basée sur le nombre total de bactéries, proportion de transconjuguants, fraction de transconjuguants dans la population receveuse, fréquence des transconjuguants, fréquence de conjugaison, logarithme du taux de conjugaison, constante du taux de transfert, taux de conjugaison par paire d’accouplement, coefficient de conjugaison, ou efficacité de conjugaison²⁰. Ce protocole fait référence au terme efficacité de conjugaison.
16. Conserver les transconjuguants dans des stocks de glycérol à -80 °C. Suivez les sous-étapes pour préparer les stocks de glycérol.
    1. Sélectionner une seule colonie de transconjuguants et les cultiver pendant la nuit (18 h) dans des tubes de culture de 5,0 mL contenant 2 mL de bouillon Mueller Hinton additionné de carbénicilline (100 mg/L), à 37 °C et en agitant à 200 tr/min.
    2. Étiqueter les flacons cryogéniques, en indiquant le nom du transconjuguant, comme suit: Tc + nom du donneur + antibiotique de sélection dans le milieu A (comme ils sont transconjuguants, on sait que leur origine est la souche receveuse, qui est déjà résistante à la streptomycine et à la rifampicine mais abrite en outre le plasmide porteur d’un gène de résistance aux bêta-lactamines); par exemple, TcU1Carb. Ajoutez des nombres continus au cas où plus d’un transconjuguant du même donneur doit être stocké (par exemple, TcU1Carb1, TcU1Carb2, etc.).
    3. Transférer 1 mL de la culture de nuit dans 1 mL de glycérol à 50 % (v/v; la concentration finale de glycérol devrait être de 25 %) et mélanger doucement par inversion. Placez les flacons cryogéniques sur de la glace sèche pendant 15 min et conservez les flacons cryogéniques à -80 °C pour les expériences futures.
17. Pour l’extraction de l’ADN, strier les trasnconjuguants des stocks de glycérol sur gélose Mueller Hinton supplémentée en carbénicilline (100 mg/L) et incuber pendant une nuit à 37 °C; Ensuite, suivez les recommandations de l’étape 2.1.

2. Méthode 2: Réaction en chaîne de la polymérase (PCR) pour amplifier les gènes de résistance aux antibiotiques et les réplicons plasmidiques chez E. coli transconjuguants

REMARQUE : La réaction en chaîne de la polymérase (PCR) a été mise au point par le Dr Kary Mullis en 1983. La PCR dépend d’amorces spécifiques (un court morceau d’ADN complémentaire à une séquence d’ADN donnée qui agit comme un point auquel la réplication peut se dérouler, généralement de 20 à 40 nucléotides de longueur et idéalement avec une teneur en guanine-cytosine de 40% à 60%), qui sont recuits aux brins opposés d’un modèle d’ADN double brin dénaturé et prolongés par une ADN polymérase thermostable, générant ainsi un modèle supplémentaire pour le prochain cycle de réactions, conduisant à l’amplification exponentielle du modèle original²¹. Dans ce protocole, les réplicons et les gènes de résistance présents dans les plasmides conjugatifs ont été amplifiés pour confirmer le transfert dans les cellules réceptrices transconjuguantes.

1. Extraction d’ADN
   1. Pour détecter le transfert de gènes de résistance portés par les plasmides conjugatifs, utilisez l’ADN transconjuguant comme modèle. Utilisez une simple extraction de préparation à l’ébullition pour lyser les parois cellulaires bactériennes.
      REMARQUE: L’extraction simple de préparation à l’ébullition est une approche simple pour lyser les parois cellulaires bactériennes. Cette extraction contient de l’ADN plasmidique mélangé à de l’ADN génomique, mais comme les amorces sont conçues en fonction de séquences d’ADN spécifiques d’intérêt, ce modèle est également utile pour la PCR. Les plasmides peuvent également être spécifiquement purifiés, bien que les rendements aient tendance à diminuer avec l’augmentation de la taille des plasmides²². C’est un point d’arrêt pratique. L’ADN peut être conservé pendant plusieurs mois à -20 °C.
2. PCR
   1. Étant donné que l’expérience a un contrôle négatif et un contrôle positif, il est avantageux de mettre en place un pool pour toutes les réactions dans un tube de 1,5 mL. Étiquetez un tube de 1,5 mL comme « pool » et les tubes de PCR requis avec le nom du gène et de l’échantillon (p. ex., OXA-U1).
   2. Pipeter les réactifs de PCR dans l’ordre suivant dans un tube de 1,5 mL : eau stérile, 2x Master Mix, amorces et polymérase (sauf l’ADN modèle) (voir le tableau 1). Mélanger doucement en pipetant de haut en bas au moins 10 fois. Restez sur la glace tout le temps.
      REMARQUE : Portez des gants pour éviter de contaminer le mélange réactionnel ou les réactifs. Essayez d’éviter d’ouvrir et de mélanger les réactifs et de manipuler les échantillons dans la même zone pour éviter la contamination des réactifs. Placez les réactifs dans le seau à glace pour supprimer l’activité nucléase et l’amorçage non spécifique. Laissez-les décongeler complètement avant de mettre en place une réaction. Gardez les réactifs sur la glace tout au long de l’expérience. Taq Polymerase est ajouté à la fin parce qu’il est sensible aux changements de pH; Il doit être tamponné pour éviter la dégradation ou le mauvais pliage. La séquence des amorces est indiquée dans le tableau 2 - gènes de résistance aux antibiotiques - et le tableau 3 - réplicons 23,24,25,26,27,28.
   3. Ajoutez l’ADN du modèle au tube correspondant. Évitez d’introduire des bulles et des bouchons sécurisés sur les tubes PCR.
   4. Placez les tubes PCR dans le cycleur thermique.
   5. Démarrez le programme. Reportez-vous aux paramètres du programme indiqués pour chaque gène dans le tableau 2 (gènes de résistance) et le tableau 3 (réplicons).
      REMARQUE: Configurez les programmes de PCR pour maintenir les échantillons à 4 ° C après l’exécution.
      1. Conditions de PCR pour les réplicons: un cycle de dénaturation à 94 °C pendant 5 min, suivi de 30 cycles de dénaturation à 94 °C pendant 1 min, recuit à 60 °C pendant 30 s, allongement à 72 °C pendant 1 min, et extension finale d’un cycle à 72 °C pendant 5 min.
         NOTE : Ce sont les conditions normalisées par Carattoli et ^coll.29.
   6. Lorsque le programme est terminé, conservez les tubes PCR à 4 °C.
      REMARQUE: Il s’agit d’un point d’arrêt pratique. Les produits PCR peuvent être conservés pendant plusieurs mois à -20 °C
   7. Préparer un gel d’agarose à 1 % en pesant 0,6 g d’agarose dans une fiole de 250 ml et en ajoutant 60 mL de 1x tampon de tris-acétate-EDTA (TAE) (ajuster les réactifs si une taille de gel différente est nécessaire). Faire fondre l’agarose délicatement et lentement au micro-ondes pour éviter que l’agarose ne se répande sur le ballon et laisser refroidir à environ 55 °C (10-15 min).
      1. Préparer tous les réactifs en utilisant de l’eau désionisée ultrapure et des réactifs de qualité analytique :
      2. TAE 50x Buffer (Tris base, acide acétique et EDTA) (1 L) : Mélanger 121,1 g de Tris base + 372,24 g d’EDTA et ajouter 500 mL d’eau distillée. Dissoudre avec un agitateur magnétique. Ajouter 57,1 mL d’acide acétique et ajouter de l’eau distillée pour obtenir un volume total de 1 000 mL.
      3. Autoclave à 15 psi, 121 °C pendant 15 min, et maintenir à température ambiante jusqu’à ce qu’il soit prêt jusqu’à 6 mois.
      4. TAE 1x tampon (1 L) : Combiner 20 ml de tampon TAE 50x avec 980 ml d’eau distillée et mélanger.
   8. Sous une hotte, ajouter 6 μL de SYBR Green à l’agarose fondue, mélanger et verser dans le plateau (et le peigne), préalablement scellé avec du ruban adhésif pour éviter les déversements. Laisser le gel durcir pendant 15-25 minutes jusqu’à ce que la turbidité apparaisse.
      NOTE: D’autres colorants alternatifs sont également disponibles^30,31,32,33.
   9. Retirez le ruban adhésif et placez le gel dans la chambre d’électrophorèse, en ajoutant suffisamment de 1x tampon TAE pour couvrir le gel.
   10. Mélanger 5 μL de 6x colorant de chargement de gel d’ADN avec 25 μL de chaque réaction. Mélanger doucement en pipetant de haut en bas au moins 10 fois.
       REMARQUE: Tout le produit PCR n’a pas besoin d’être chargé dans le gel pour visualiser le produit attendu (ajuster la quantité de colorant comme correspond). L’échantillon PCR restant a pu être conservé et conservé à -20 °C pendant plusieurs mois.
   11. Chargez le mélange dans des puits (évitez d’introduire des bulles) et posez le couvercle de la chambre.
       NOTE: Chargez le premier échantillon dans le deuxième puits (réservez le premier à l’échelle), en commençant par le témoin négatif.
   12. Chargez 4 μL d’échelle d’ADN de 1 kb dans le premier puits.
   13. Exécutez l’électrophorèse à 120 V, 400 mA et 60 min.
   14. Visualisez le gel sous lumière UV (avec un illuminateur UV) et enregistrez l’image.
       REMARQUE: Si un produit PCR est présent, les bandes d’ADN colorées peuvent être détectées à l’aide d’un transilluminateur UV standard, d’un transilluminateur de lumière visible ou d’un scanner laser.

Réactif	Solution mère	Volume ajouté à la réaction de 50 μL (1x)	Final	Exemple : volume	Exemple : volume	Exemple : volume ajouté à chaque tube Final Vol. 50 μL	Volume ajouté au contrôle positif	Volume ajouté au contrôle négatif
			Concentration	ajouté à 1x	ajouté à 3x (pool)
Eau stérile	-	21,5 μL (q.s. à 50 μL)	-	21,5 μL	64,5 μL	49 μL/tube	49 μL/tube	49 μL/tube
Master Mix	2x	25 μL	1x	25 μL	75 μL
Introduction à l’avant	25 μM	1 μL	0,5 μM	1 μL	3 μL
Abécédaire inversé	25 μM	1 μL	0,5 μM	1 μL	3 μL
Modèle ADN	Variable (100–200 ng/μL)	Variable (1 μL)	Variable	0,5 μL	1,5 μL
Polymérase	5 unités/μL	0,5 μL	2.5 Unités	-	-	1 μL (transconjuguant)	1 μL (donneur)	1 μL (receveur)
REMARQUE: q.s. est une abréviation latine pour quantum satis signifiant la quantité nécessaire.

Tableau 1 : Réactifs de PCR et pool pour trois réactions (un exemple). 

Amorces (séquence listée dans l’orientation 5' - 3')	Programme PCR	Taille attendue
		(bp) Ref.
blaCTX-M groupe 1	94 oC 7 min	(864) 23
CTX-M: GGTTAAAAAATCACTGCGYC	94 oC 50 s (35 cycles)
CTX-M: TTGGTGACGATTTTAGCCGC	50 oC 40 s
	68 oC 1 min
	68 oC 5 min
blaCMY-2	95 oC 3 min	(1855) 24
CMJ-2-F: GATTCCTTGGACTCTTCAG	95 oC 30 s (30 cycles)
CMJ-2-R: TAAAACCAGGTTCCCAGATAGC	53 oC 30 s
	72 oC 30 s
	72 oC 3 min
aac(3')-II	94 oC 5 min	(237) 25
aac(3')-II-F: ACTGTGATGGGATACGCGTC	94 oC 30 s (32 cycles)
aac(3')-II-R: CTCCGTCAGCGTTTCAGCTA	60 oC 45 s
	72 oC 2 min
	72 oC 8 min
aadA	94 oC 5 min	(283) 26
aadA1: GCAGCGCAATGACATTCTTG	94 oC 1 min (35 cycles)
aadA2: ATCCTTCGGCGCGATTTTG	60 oC 1 min
	72 oC 1 min
	72 oC 8 min
SUL-3	94 oC 5 min	(799) 27
sul-3-F: GAGCAAGATTTTTGGAATCG	94 oC 1 min (30 cycles)
sul-3-R: CATCTGCAGCTAACCTAGGGCTTTGGA	51 oC 1 min
	72 oC 1 min
	72 oC 5 min
têt(A)	95 oC 5 min	(957) 28
TETA-1: GTAATTCTGAGCACTGTCGC	95 oC 30 s (23 cycles)
TETA-2: CTGCCTGGACAACATTGCTT	62 oC 30 s
	72 oC 45 s
	72 oC 7 min
DFR Un	95 oC 5 min	(302) Ce travail
DFRA-F: CATACCCTGGTCCGCGAAAG	95 oC 1 min (30 cycles)
	55 oC 1 min
DFRA-R: CGATGTCGATCGTCGATAAGTG	72 oC 1 min
	72 oC 7 min
catA2	95 oC 5 min
catA2-F: GACCCGGTCTTTACTGTCTTTC	95 oC 1 min (25 cycles)	(225) Ce travail
catA2-R: TCCGGTGATATTCAGATTAAAT	60 oC 1 min
	72 oC 1 min
	72 oC 7 min

Tableau 2 : Amorces et programmes de PCR utilisés pour amplifier les gènes de résistance au diagnostic. 

Réplicon	Primer (séquence listée dans l’orientation 5' - 3')				Cible	Programme PCR	Taille attendue (pb)
IncFIB	F: TCTGTTTATTCTTTTACTGTCCAC				repA	94 oC 5 min	683
	R : CTCCCGTCGCTTCAGGGCATT					94 oC 1 min (30 cycles)
						60 oC 30 s
IncFIC	F: GTGAACTGGCAGATGAGGAAGG				repA2	72 oC 1 min	262
	R: TTCTCCTCGTCGCCAAACTAGAT					72 oC 5 min
IncI1	F: CGAAAGCCGGACGGCAGAA				ARNAI		139
	R: TCGTCGTTCCGCCAAGTTCGT

Tableau 3 : Amorces et programme de PCR utilisés pour classer les plasmides p134797 et p101718 par typage réplicon basé sur la PCR²⁹. 

Résultats

Étant donné que les donneurs SW4955 et SW7037 ont été séquencés, ces deux souches de donneurs devraient avoir les phénotypes de résistance correspondant au profil génétique de résistance identifié dans leur séquence génomique. Le plasmide p134797 (de SW4955) a des gènes qui confèrent une résistance aux céphalosporines de troisième génération (bla_CTX-M-55), et une résistance aux aminosides (aac(3)-IIa et aadA1), aux phénicols (catA2), aux tétracyclines (tet(A)), au triméthoprime (dfrA14) et aux sulfamides (sul3); aucun gène de résistance aux antibiotiques n’a été trouvé dans le chromosome SW4955. Le plasmide p101718 (de SW7037) ne porte qu’un seul gène de résistance aux antibiotiques (bla _CMY-2), censé conférer une résistance aux céphalosporines de troisième génération (bla_CTX-M-55). Encore une fois, aucun gène de résistance aux antibiotiques n’a été trouvé dans le chromosome SW7037.

Après l’accouplement, la détection du transfert des deux plasmides conjugatifs portant tous les gènes de résistance mentionnés ci-dessus était attendue. La détection par conjugaison positive implique que les receveurs identifiés comme transconjuguants auraient dû acquérir les plasmides conjugatifs. La présence des gènes de résistance diagnostique pour les plasmides conjugatifs dans les transconjuguants (tels que détectés par PCR) était également attendue.

Pour illustrer les méthodes décrites ici, la capacité de deux isolats environnementaux d’E. coli à transférer l’ADN plasmidique par conjugaison a été testée. Une représentation schématique du contexte expérimental est présentée à la figure 1. Deux donneurs (E. coli SW4955 et SW7037) et un receveur (E. coli LMB100) ont été accouplés indépendamment. La carte génétique des plasmides conjugatifs trouvés chez E. coli SW4955 (p134797) et SW7037 (p101718) est illustrée à la figure 2.

Les plasmides conjugués ont été sélectionnés avec la carbénicilline et contre-sélectionnés à l’aide de la rifampicine et de la streptomycine, dont les déterminants de résistance sont dans le chromosome du receveur. La gélose MacConkey a été utilisée pour distinguer les donneurs positifs au lactose (qui produisent de grandes colonies roses) du receveur et les transconjuguants (qui sont négatifs au lactose et produisent des colonies jaune pâle plus petites) (figure 3).

Figure 3 : Illustration des marqueurs de couleur différentielle pour les colonies donneuses et receveuses sur gélose MacConkey. Les colonies correspondant aux donneurs sont roses sur gélose MacConkey car elles sont positives au lactose. Cela distingue les colonies donneuses des colonies receveuses, qui sont jaune pâle et plus petites (lactose négatif). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La mobilisation du plasmide conjugatif p134797 a été détectée, chacun des cinq antibiotiques correspondant aux cinq classes différentes de gènes de résistance trouvés dans le plasmide.

Un exemple de calcul de l’efficacité de conjugaison (EC) pour la déformation SW4955 est présenté. D’après l’essai avec la souche SW4955, 172 UFC de transconjuguants ont été comptés dans la plaque à partir de la dilution ^10-2; le nombre de receveurs de la dilution correspondante (^10-2) était de 10 300 000 UFC/mL (tableau 4).

Le CE est calculé comme suit :

CE = (174 UFC/mL)/(10 300 000 UFC/mL)

EC = 1,67 x ^10-5 transjugaisants/récepteur

	LMB100		Transconjuguants de la souche SW4955 sélectionnés avec la carbelicilline	Efficacité de la conjugaison
Dilution	UFC (plaque dénombrable)	Approximatif UFC/ml	UFC (plaque dénombrable)
100	confluent	1.03E+09
10-1	confluent	1.03E+08
10-2	confluent	10300000	172	1,67 x 10-5 transconjuguants/récipient
10-3	confluent	1030000
10-4	confluent	103000
10-5	confluent	10300
10-6	confluent	1030
10 à 7	103	103
Les valeurs utilisées pour calculer l’EC sont surlignées en gras.

Tableau 4 : Exemple de calcul de l’efficacité de conjugaison (EC) pour la déformation SW4955.

Les résultats sont présentés dans le tableau 5, exprimés en efficacité de conjugaison par receveur. Les cinq rendements de conjugaison obtenus en utilisant la souche SW4955 comme donneur étaient tous du même ordre de grandeur. Ces résultats indiquent que la mobilisation du plasmide conjugatif peut être détectée quelle que soit la sélection utilisée pour l’identification des transconjuguants.

En utilisant la souche SW7037 comme donneur, l’efficacité de conjugaison obtenue était inférieure de trois ordres de grandeur; Ces résultats permettent de comparer les efficacités de conjugaison de différents donneurs et types de plasmides avec les mêmes receveurs.

	Efficacité de la conjugaison
Filtrer	Carbénicilline (100 mg/L)	Gentamicine (2 mg/L)	Chloramphénicol (25 mg/L)	Tétracycline (10 mg/L)	Triméthoprime (20 mg/L)
SW4955	1,67 x 10-5	5,67 x 10-5	2,17 x 10-5	7,62 x 10-5	1,36 x 10-5
SW7037	2,14 x 10-6

Tableau 5 : Efficacité de conjugaison des souches SW4955 et SW7037 des donneurs d’E. coli selon l’antibiotique utilisé pour la sélection.

Chez les transconjuguants, la présence de réplicons et de tous les gènes de résistance codés dans deux plasmides conjugatifs testés, et leurs réplicons correspondants, a été vérifiée par PCR. Les conditions utilisées pour ces réactions de PCR diagnostique sont présentées dans le tableau 3.

Les gels de diagnostic sont illustrés à la figure 4. Ces gels confirment la présence des réplicons attendus dans les transjugants (IncFIC et IncFIB dans p1347975, et IncI1 dans p101718). Ils confirment également la présence des gènes de résistance aux antibiotiques attendus, à savoir le groupe bla _CTX-M-55 (bêta-lactame), aac(3)-II et aadA (aminoglycoside), catA2 (phénicol), tet(A) (tétracycline), dfrA14 (triméthoprime) et sul3 (sulfamide) pour p1347975, et bla_CMJ-2 pour le p101718 (Figure 4).

Figure 4 : Gels d’électrophorèse diagnostique. Électrophorèse sur gel de produits PCR de gènes de résistance aux antibiotiques et de réplicons plasmidiques trouvés dans les plasmides conjugatifs p134797 et p101718 dans les cellules donneuses (souches SW4955 et SW7037, respectivement) et dans les transconjuguants LMB100 correspondants. La carbénicilline a été utilisée pour la sélection des plasmides. Abréviations. -: contrôle négatif (l’ADN de la souche LMB100 a été utilisé comme témoin négatif); D : donateur; T : transconjuguant. Tailles d’amplicon attendues: bla_CTX-M-55: 864 pb; aac(3)-IIa: 237 pb; aadA1: 283 pb; catA2: 225 pb; tet(A): 957 pb; dfrA14: 302 pb; SUL3: 799 pb; IncFIC(FII): 262 pb; IncFIB: 683 pb; bla_CMJ-2 : 1 855 pb ; IncI1-I : 139 pb. Le gel contient 1% d’agarose. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Les plasmides conjugatifs donnent accès à un pool commun de gènes dans un environnement particulier par recombinaison et transfert horizontal de gènes³⁴. Ainsi, les plasmides conjugatifs sont des entités évolutives capables d’acquérir et de conférer des fonctions qui permettent aux bactéries de s’adapter à de multiples conditions (y compris la résistance aux antibiotiques, la résistance aux métaux, l’acquisition de métaux, la formation de biofilms et les gènes pathogènes, entre autres) dans une échelle temporelle d’heures.

Ce travail présente un protocole pour l’identification des plasmides conjugatifs chez les bactéries. Pour que le protocole fonctionne, les marqueurs utilisés doivent différencier les souches donneuses et receveuses, comme le montrent les contrôles dans les milieux A et B. Ils doivent également sélectionner efficacement les cellules porteuses du plasmide. La réaction d’accouplement est critique. Dans cette réaction, les donneurs et les receveurs doivent établir un contact prolongé (par pili) pour que la conjugaison se produise. Tout ce qui peut perturber le contact de cellule à cellule, comme un temps d’incubation insuffisant ou secouer ou agiter la culture, diminue ainsi l’efficacité de la conjugaison. Le choix du receveur est également critique, car certaines souches de receveurs sont réfractaires à la conjugaison^35,36. LMB100 est proposé comme destinataire de choix, car il est capable de prendre des plasmides de plusieurs types d’incompatibilité.

Le taux de conjugaison est spécifique pour chaque paire plasmido-donneur, receveur et condition environnementale. La conjugaison de plasmides spécifiques s’est avérée sensible à un grand nombre de variables, y compris la phase de croissance, la densité cellulaire, le rapport donneur-receveur, si la conjugaison est effectuée dans un milieu liquide ou solide, le carbone, l’oxygène, les sels biliaires, les concentrations de métaux, la présence de cellules de mammifères, la température, le pH et le temps d’accouplement^13,14,15 . L’étude de ces interactions dépend de la détection initiale d’un plasmide conjugatif à étudier en profondeur. Ainsi, le protocole décrit ici peut également être modifié pour explorer l’impact de différentes variables expérimentales, bien que cela se fasse au prix d’une restriction du nombre de donneurs sélectionnés. Il peut également identifier les plasmides mobilisables chez les hôtes qui ont des plasmides auxiliaires (c’est-à-dire les plasmides qui permettent la conjugaison en fournissant des fonctions manquantes aux plasmides mobilisables dans trans ⁶).

Connaître la séquence du plasmide conjugatif est recommandé (mais pas nécessaire pour détecter la conjugaison, comme discuté ci-dessus). Lorsque les donneurs sont lactose-négatifs (produisant des colonies jaunes sur gélose MacConkey), un receveur positif au lactose (produisant des colonies roses sur gélose MacConkey) peut être utilisé pour distinguer les vrais transconjuguants des cellules de donneur qui sont capables de se développer sur le milieu pour sélectionner des transconjuguants. Le protocole décrit ici est conçu pour détecter les plasmides conjugatifs des membres environnementaux, commenaux et pathogènes de la famille des Enterobacteriaceae; Cependant, il peut être utilisé avec n’importe quelle espèce bactérienne avec un donneur, un receveur, un antibiotique ou des marqueurs de couleur appropriés. L’identification de ces composants critiques dans d’autres bactéries nécessite des études systématiques utilisant plusieurs donneurs, receveurs et marqueurs (antibiotiques et couleurs). Ce protocole n’a pas été testé chez les bactéries à Gram positif.

Plusieurs variantes de la méthode présentée ici ont été rapportées dans la littérature, récemment revue²⁰. Le résultat qualitatif peut également être mentionné de différentes façons (p. ex. fréquence des exconjuguants et fréquence de transfert de gènes), et les unités sans dimension peuvent être utilisées pour rendre compte de l’efficacité de la conjugaison (mL/UFC x h)²⁰.

Le protocole décrit ici résout plusieurs limitations qui n’étaient pas traitées auparavant par les méthodes existantes^16,18,19,20. Tout d’abord, un destinataire approprié a été identifié. Deuxièmement, l’utilisation de deux antibiotiques (rifampicine et streptomycine) pour sélectionner les vrais transconjuguants minimise la possibilité que les donneurs développent une résistance à l’un des antibiotiques utilisés pour sélectionner les transconjuguants par mutagénèse spontanée. Les faux transconjuguants peuvent également résulter de la protection des témoins par hydrolyse de l’antibiotique utilisé pour sélectionner les transconjuguants par des enzymes (p. ex. bêta-lactamases) produites en grande quantité par le donneur. Troisièmement, plusieurs témoins expérimentaux sont inclus pour s’assurer que le produit de l’accouplement est un véritable transconjuguant (c.-à-d. une cellule receveuse qui a incorporé de façon stable le plasmide conjugatif du donneur). Ici, nous avons présenté deux méthodes indépendantes pour tester l’authenticité des transconjuguants, à savoir un marqueur colorimétrique dans la gélose MacConkey et la détection par PCR des réplicons et des gènes de résistance aux antibiotiques du plasmide conjugatif chez le receveur. En outre, le protocole décrit ici est conçu pour isoler et caractériser les plasmides conjugatifs des membres environnementaux, commenaux et pathogènes de la famille des Enterobacteriaceae (Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Salmonella, Shigella et d’autres espèces).

Pour comprendre la mécanique de la conjugaison, des observations expérimentales ont été modélisées à l’aide de simulations informatiques. Ces modèles prédictifs estiment la fréquence du transfert plasmidique pour des densités de croissance données des donneurs, des receveurs et des transconjuguants. Un modèle connu sous le nom de modèle de point final a trouvé des seuils au-dessus desquels le taux de transfert plasmidique en culture liquide et a conclu que le taux de transfert n’est pas affecté par la densité cellulaire, le rapport donneur/receveur et le temps d’accouplement¹⁹. L’hybridation in situ par fluorescence (FISH) a été utilisée comme méthode alternative de détection des plasmides transconjuguants. FISH permet la visualisation plasmidique à l’aide de la microscopie à fluorescence grâce à l’hybridation d’une sonde à ADN et d’un ADN cible. Ainsi, FISH permet la détection visuelle des écoulements plasmidiques à travers différentes populations cellulaires³⁷, bien qu’il n’ait pas le même niveau de sensibilité que la méthode présentée ici si les transconjuguants sont détectés par criblage visuel par opposition à la sélection.

Il y a un énorme besoin de comprendre la biologie des plasmides conjugatifs qui dispersent les gènes de résistance aux antibiotiques à travers différentes composantes de l’écosystème (clinique, agriculture, eaux usées, faune, animaux domestiques, sols, rivières et lacs). En somme, les conditions expérimentales simplifiées présentées dans les protocoles décrits ici facilitent le criblage des donneurs à grande échelle, et représentent ainsi un outil clé pour l’étude du transfert horizontal de gènes provenant de plasmides conjugatifs provenant de diverses sources. Ils peuvent être utilisés pour étudier la prévalence de gènes de résistance aux antibiotiques ou d’autres gènes cliniquement pertinents dans les plasmides conjugatifs provenant de sources multiples et de bactéries. Ils peuvent également être adaptés pour l’étude de la conjugaison in vivo (par exemple, dans l’intestin des vertébrés) et pour étudier les conditions qui modulent l’efficacité de la conjugaison. Toutes ces études permettront de mieux comprendre comment la mobilisation des plasmides conjugatifs multirésistants contribue à la propagation de la multirésistance.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Supports de tubes de 1,5 mL	Thermo Fisher Scientific	22-313630	Il peut être remplacé par une autre marque
Flacons cryogéniques de 2,0 mL Corning		430659	Il peut être remplacé par une autre marque
Tubes coniques de 14 mL	FALCON	149597	Il peut être remplacé par une autre marque
Supports de tubes de 14 mL	Thermo Fisher Scientific	8850	Il peut être remplacé par une autre marque
Échelle d’ADN de 1 kb	New England Biolabs	N0552G  ;
Fioles stériles de 250 mL	PYREX	5320	Il peut être remplacé par un autre marqueur permanent de marque
Acide acétique	Fisher Scientific	A38SI-212	Il peut être remplacé par une autre marque
Agarose (qualité biologie moléculaire, polyvalente)	Fisher Scientific	BP160-500	Il peut être remplacé par une autre marque
Carbenicilline	GOLD BIOTECHNOLOGY	C-103-50	Il peut être remplacé par une autre marque
Boucles d’inoculation jetables : 1 & micro ; L	Fisherbrand	22-363-595	Il peut être remplacé par une autre marque
de colorant de chargement de gel d’ADN 6x  ;	New England Biolabs	B7024S	Il peut être remplacé par une autre marque
EDTA	Fisher Scientific	BP119-500	Il peut être remplacé par une autre marque
Balance numérique électronique	Denver Instrument	APX-2001	Il peut être remplacé par une autre marque
Eppendorf Tubes coniques : 1,5 mL	Eppendorf	14-282-302	Il peut être remplacé par une autre marque
Equipement pour l’électrophorèse sur gel d’agarose	Fisher Scientific	FP300	Il peut être remplacé par une autre marque
Marqueurs résistants à l’éthanol	Sharpie	37001 ; 37002 ; 37003	Il peut être remplacé par une autre marque
Systèmes de documentation sur gel (UVP GelSolo)	Analytakjena	SP-1108 ; 849-97-0936-01 ; 95-0612-01	Il peut être remplacé par une autre marque
Gants	X-GEN	44-100M	N’importe quelle marque de gants en nitrile fonctionne
Seau à glace	Thermo Fisher Scientific	432128	Il peut être remplacé par une autre marque
MacConkey agar  ;	BD DIFCO	212123
Master Mix  ;	BioLabs	M0496S  ;	Il peut être remplacé par une autre marque
Méthanol	Fisher Scientific	A452-4	Il peut être remplacé par une autre marque
Tubes de microcentrifugation : 2.0 mL	Fisherbrand	05-408-138	Il peut être remplacé par une autre marque
Mueller Hinton agar	BD DIFCO	DF0479-17-3
Mueller Hinton broth	BD DIFCO	275730
NucleoSpin Plasmide, Mini kit pour ADN	plasmidiqueTakara Bio USA, Inc., MACHEREY-NAGEL	740588. 250
supports de tubes PCR	AXYGEN  ;	; R96PCRFSP	Il peut être remplacé par des tubes PCR d’une autre marque
(0,2 mL)	AXYGEN  ;	PCR-02-C	Il peut être remplacé par une autre marque
Rifampicine	Fisher Scientific	50-164-7517
Ensemble de micropipettes qui distribuent entre 1 - 10 &mu ; L (P10), 2&ndash ; 20 &mu ; L (P20), 20&ndash ; 200 &mu ; L (P200) et 200&ndash ; 1000 &mu ; L (P1000)	RAININ	17008648 ; 17008650 ; 17008652 ; 17008653	Les micropipettes doivent être calibrées ; peuvent être remplacées par une autre marque
Chlorure de sodium	Fisher Scientific	S671-3	Il peut être remplacé par une autre marque
Spectrophotomètre	Thermo Scientific	335905P	Il peut être remplacé par une autre marque
Embouts stérilisés pour 10 &mu ; L, 200 &mu ; L et 1000 &mu ; L  ;	Eclipse	1011-260-000-9 ; 1018-260-000 ; 1019-260-000-9	Il peut être remplacé par une autre marque
Streptomycine	Fisher Scientific	BP910-50
SYBR Tache de gel d’ADN sûre  ;	Thermo Fisher Scientific	S33102
Taq DNA Polymerase	BioLabs	M0273S
Thermocycleur C1000 Touch  ;	Bio-Rad	1851196	Il peut être remplacé par une autre marque
Tris  ;	Fisher Scientific	BP153-500	Il peut être remplacé par une autre marque