Utilisation de la microscopie accélérée et de l’épuisement nucléaire spécifique au stade des protéines pour étudier la méiose chez S. cerevisiae

Résumé

La microscopie time-lapse est un outil précieux pour étudier la méiose chez la levure bourgeonnante. Ce protocole décrit une méthode qui combine la synchronisation du cycle cellulaire, la microscopie accélérée et l’épuisement conditionnel d’une protéine cible pour démontrer comment étudier la fonction d’une protéine spécifique pendant la ségrégation chromosomique méiotique.

Résumé

La microscopie à fluorescence accélérée a révolutionné la compréhension des événements du cycle cellulaire méiotique en fournissant des données temporelles et spatiales qui ne sont souvent pas vues par imagerie des cellules fixes. La levure bourgeonnante s’est avérée être un organisme modèle important pour étudier la ségrégation des chromosomes méiotiques, car de nombreux gènes méiotiques sont hautement conservés. La microscopie accélérée de la méiose chez la levure bourgeonnante permet de surveiller différents mutants méiotiques pour montrer comment la mutation perturbe les processus méiotiques. Cependant, de nombreuses protéines fonctionnent à plusieurs points de la méiose. L’utilisation de mutants nuls méiotiques ou de perte de fonction peut donc perturber un processus précoce, bloquant ou perturbant le processus ultérieur et rendant difficile la détermination des phénotypes associés à chaque rôle individuel. Pour contourner ce défi, ce protocole décrit comment les protéines peuvent être épuisées conditionnellement du noyau à des stades spécifiques de la méiose tout en surveillant les événements méiotiques à l’aide de la microscopie accélérée. Plus précisément, ce protocole décrit comment les cellules sont synchronisées dans la prophase I, comment la technique d’ancrage est utilisée pour épuiser les protéines du noyau à des stades méiotiques spécifiques et comment l’imagerie accélérée est utilisée pour surveiller la ségrégation chromosomique méiotique. À titre d’exemple de l’utilité de la technique, la protéine kinétochore Ctf19 a été épuisée du noyau à différents moments de la méiose, et le nombre de masses de chromatine a été analysé à la fin de la méiose II. Dans l’ensemble, ce protocole peut être adapté pour épuiser différentes protéines nucléaires du noyau tout en surveillant les divisions méiotiques.

Introduction

La microcopie à fluorescence accélérée est un outil précieux pour étudier la dynamique de la ségrégation des chromosomes méiotiques chez la levure bourgeonnante ^1,2. Les cellules de levure bourgeonnantes peuvent être induites à subir une méiose par la famine de nutriments clés³. Au cours de la méiose, les cellules subissent un cycle de ségrégation chromosomique suivi de deux divisions pour créer quatre produits méiotiques qui sont emballés dans des spores (Figure 1). Les cellules individuelles peuvent être visualisées à chaque étape de la méiose, ce qui gén....

Protocole

1. Préparation du matériel nécessaire

1. Préparer des réactifs pour la croissance et la sporulation des cellules de levure.
   NOTE: Si les souches de levure bourgeonnantes sont ade2 - et trp1-, compléter tous les milieux aux étapes 1.1.1-1.1.3 avec une concentration finale de 0,01% d’adénine et 0,01% de tryptophane à partir de souches de 1%. Si les milieux sont stérilisés par autoclave, ajouter ces acides aminés seulement après que les réactifs ont été autoclavés et laissés refroidir à température ambiante.
   1. Pour la croissance végétative, préparer 2x milieu synthétique complet + dextrose (2XSC) en dissolvant 6,7 g de ba....

Résultats

Pour surveiller la ségrégation de la chromatine, la protéine histones Htb2 a été marquée avec mCherry. Dans la prophase I, la chromatine apparaît comme une masse unique de Htb2. Après la ségrégation des chromosomes homologues dans la première division méiotique, la chromatine apparaît comme deux masses distinctes (Figure 3A). Après la ségrégation des chromatides sœurs, la chromatine apparaît sous la forme de quatre masses. Si certains chromosomes ne parviennent pas à se fixer aux microtubule.......

Discussion

Ce protocole combine le système NDT80-in pour synchroniser les cellules, la technique d’ancrage pour épuiser les protéines du noyau et la microscopie accélérée à fluorescence pour imager les cellules de levure bourgeonnantes pendant la méiose. Le système NDT80-in est une méthode de synchronisation du cycle cellulaire méiotique qui utilise un arrêt et une libération ^4,8 de la prophase^I. Bien que le temps passé dans chacune des étapes méiotiques s.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
&beta ;-estradiol	Millipore Sigma	E8875	Faire 1mM de stocks à 95 % EtOH
0,22 uM Filtre fileté sur bouteille	Millipore Sigma	S2GPT02RE
100 % EtOH	Fisher Scientific	22-032-601
10X PBS	Fisher Scientific	BP399500	Diluer 1:10 à utiliser comme solvant pour ConA
24 mm x 50 mm lamelle n° 1.5	VWR Lames de microscope nord-américaines	48393241
25 mm x 75 mm	VWR Amérique du Nord	48300-026
Sel d’hémisulfate d’adénine	Millipore Sigma	A9126	Pour compléter SC, SCA et 1 % Kac
Bacto Agar	BD	214030
Concanavialin A	Mllipore Sigma	C2010	Obtenir comme 1mg/mL dans 1X caméra
CCD PBS CoolSNAP HQ2	Photométrie		utilisée dans la section 4.3
D-glucose	Fisher Scientific	D16-10
Base d’azote de levure Difco sans acides aminés	BD	291920
Diméthyl sulfoxyde (DMSO)	Millipore Sigma	D5879
Eclipse Ti2 micrscope à objectif inversé	Nikon		Utilisé dans la section 4.4
Fidji	NIH		Télécharger à partir de https://fiji.sc/
GE Personal DeltaVision Microscope	Applied Precision		utilisé dans la section 4.3
L-Tryptophane  ;	Millipore Sigma	T0254	Pour compléter SC, SCA et 1 % de
pâte à modeler	Crayola	; 2302880000	Pour fixer la lamelle dans le porte-diapositive
NIS-Elements AR 5.30.04 Logiciel d’imagerie	Nikon		Utilisé dans la section 4.4
ORCA-Fustion BT Camera	Hamamatsu	C15440-20UP	Utilisé dans la section 4.4
Porte-pointe de pipette en plastique	Dot Scientific	LTS1000-HR	Coupez une section carrée de 4 x 4 carrée de la partie rack de ce produit.  ;
Acétate de pottassium	Fisher Scientific	BP264
Rapamycine	Fisher Scientific	BP29631	Fabriquer des stocks de 1 mg/mL de
mastic silicone	DMSO Aqueon	100165001	Également connu sous le nom de colle d’aquarium.
SoftWorx7.0.0  ; Logiciel d’imagerie	Applied Precision		utilisé dans la section 4.3
Mélange synthétique complet (Kaiser)  ;	Pour huile	d’immersion DSCK2500
moyenne de type N  ;	Nikon	MXA22166