Établissement et caractérisation de modèles de xénogreffe dérivés de patients de carcinome anaplasique de la thyroïde et de carcinome épidermoïde de la tête et du cou

Le modèle PDX est un modèle animal dans lequel le tissu tumoral humain est transplanté chez des souris immunodéficientes et se développe dans l’environnement fourni par les souris¹. Les modèles traditionnels de lignées cellulaires tumorales présentent plusieurs inconvénients, tels que le manque d’hétérogénéité, l’incapacité à conserver le microenvironnement tumoral, la vulnérabilité aux variations génétiques lors de passages in vitro répétés et la mauvaise application clinique ^2,3. Les principaux inconvénients des modèles animaux génétiquement modifiés sont la perte potentielle des caractéristiques génomiques des tumeurs humaines, l’introduction de nouvelles mutations inconnues et la difficulté d’identifier le degré d’homologie entre les tumeurs de souris et les tumeurs humaines⁴. En outre, la préparation de modèles animaux génétiquement modifiés est coûteuse, prend du temps et est relativement inefficace⁴.

Le modèle PDX présente de nombreux avantages par rapport aux autres modèles tumoraux en termes de reflet de l’hétérogénéité tumorale. Du point de vue de l’histopathologie, bien que la contrepartie de la souris remplace le stroma humain au fil du temps, le modèle PDX préserve bien la structure morphologique de la tumeur primaire. De plus, le modèle PDX conserve l’identité métabolomique de la tumeur primaire pendant au moins quatre générations et reflète mieux les interrelations complexes entre les cellules tumorales et leur microenvironnement, ce qui le rend unique dans la simulation de la croissance, des métastases, de l’angiogenèse et de l’immunosuppression du tissu tumoral humain ^5,6,7. Aux niveaux cellulaire et moléculaire, le modèle PDX reflète avec précision l’hétérogénéité inter- et intra-tumorale des tumeurs humaines, ainsi que les caractéristiques phénotypiques et moléculaires du cancer d’origine, y compris les profils d’expression génique, le statut de mutation, le nombre de copies, la méthylation de l’ADN et la protéomique ^8,9. Les modèles PDX avec des passages différents ont la même sensibilité au traitement médicamenteux, ce qui indique que l’expression génique des modèles PDX est très stable^10,11. Des études ont montré une excellente corrélation entre la réponse du modèle PDX à un médicament et les réponses cliniques des patients à ce médicament^12,13. Par conséquent, le modèle PDX est devenu un puissant modèle de recherche préclinique et translationnelle, en particulier pour le dépistage de médicaments et la prédiction du pronostic clinique.

Le cancer de la thyroïde est une tumeur maligne courante du système endocrinien et une tumeur maligne humaine qui a montré une augmentation rapide de l’incidence au cours des dernières années¹⁴. Le carcinome anaplasique de la thyroïde (ATC) est le cancer de la thyroïde le plus malin, avec une survie médiane des patients de seulement 4,8 mois¹⁵. Bien que seule une minorité de patients atteints d’un cancer de la thyroïde reçoivent un diagnostic d’ATC chaque année en Chine, le taux de mortalité est proche de 100%^16,17,18. L’ATC se développe généralement rapidement et envahit les tissus adjacents du cou ainsi que les ganglions lymphatiques cervicaux, et environ la moitié des patients ont des métastases à distance^19,20. Le carcinome épidermoïde de la tête et du cou (HNSCC) est le sixième cancer le plus fréquent dans le monde et l’une des principales causes de décès par cancer, avec environ 600 000 personnes souffrant de HNSCC chaque année^21,22,23. HNSCC comprend un grand nombre de tumeurs, y compris celles du nez, des sinus, de la bouche, des amygdales, du pharynx et du larynx²⁴. L’ATC et le HNSCC sont deux des principales tumeurs malignes de la tête et du cou. Afin de faciliter le développement de nouveaux agents thérapeutiques et de traitements personnalisés, il est nécessaire de développer des modèles animaux précliniques robustes et avancés tels que les modèles PDX d’ATC et de HNSCC.

Cet article présente des méthodes détaillées pour établir le modèle PDX sous-cutané de l’ATC et du HNSCC, analyse les facteurs clés affectant le taux de prise tumorale dans la construction du modèle et compare les caractéristiques histopathologiques entre le modèle PDX et la tumeur primaire. Pendant ce temps, dans ce travail, des tests pharmacodynamiques in vivo ont été effectués en utilisant les modèles PDX construits avec succès afin de valider leur pertinence clinique.

Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément aux directives et protocoles de l’Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care approuvés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’hôpital de Chine occidentale de l’Université du Sichuan. Des souris immunodéficientes NOD-SCID âgées de 4 à 6 semaines (des deux sexes) et des souris nues Balb/c femelles âgées de 4 à 6 semaines ont été utilisées pour la présente étude. Les animaux ont été obtenus d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux). Le comité d’éthique de l’hôpital de Chine occidentale a autorisé l’étude avec des sujets humains (protocole numéro 2020353). Chaque patient a fourni un consentement éclairé écrit.

1. Préparation expérimentale

1. Disposez des lames jetables, des ciseaux et des pinces à épiler stérilisés et d’autres instruments nécessaires à la transplantation de tumeur, placez-les sur l’établi ultra-propre et irradiez-les à l’avance avec de la lumière ultraviolette.
2. Préparer une solution saline stérile et des boîtes de Petri à utiliser pendant l’essai.

2. Acquisition et transport de tissu tumoral frais

1. Obtenez des échantillons de tumeurs fraîches (généralement de plus de 5 mm x 5 mm) de la salle d’opération et placez-les dans un tube à centrifuger de 15 ml ou 50 ml contenant une solution stérile de HTK (voir le tableau des matériaux) ou une solution saline. Étiqueter les tubes de centrifugation.
   REMARQUE: Des échantillons de tumeurs fraîches ont été obtenus par ablation chirurgicale ou ponction chez des patients atteints d’ATC ou de HNSCC.
2. Placez les tubes de centrifugation dans une glacière préparée à l’avance.
   REMARQUE : Pendant ce temps, l’opérateur de transplantation doit préparer les articles nécessaires à la transplantation (voir le tableau des matériaux).
3. S’assurer que le temps entre le prélèvement de l’échantillon et le transport au laboratoire pour la construction du PDX ne dépasse pas 2 heures. Pendant le transport, entourez les tubes contenant les tissus d’un mélange d’eau glacée ou de blocs réfrigérants pour préserver l’activité des tissus.

3. Transplantation de tumeurs

1. Une fois que les tissus tumoraux arrivent au laboratoire, enregistrez-les et renumérotez-les.
   REMARQUE : Pour la présente étude, les renseignements sur les patients sont demeurés strictement confidentiels. Les autres étapes de la procédure ont été effectuées dans un laboratoire de niveau de biosécurité 2 (BSL-2). Lorsque vous entrez dans le laboratoire, il est recommandé de porter une blouse par-dessus les vêtements de travail ou des vêtements de protection, un chapeau et un masque. Le traitement du tissu tumoral est effectué dans une armoire de biosécurité.
2. Désinfectez les tubes de centrifugation contenant les tissus tumoraux avec de l’alcool à 75% et placez-les sur la table d’opération. Transférer les tissus tumoraux dans des boîtes de Petri de 6 cm remplies de solution saline à l’aide de pinces ophtalmiques stérilisées. Ensuite, coupez-les en petits morceaux d’environ 2 mm x 2 mm et 3 mm x 3 mm à l’aide d’une lame.
3. Transférez les morceaux de tissus tumoraux dans une boîte de Petri de 6 cm contenant la quantité appropriée de solution saline, enveloppez la boîte avec le film d’étanchéité, placez-la dans une glacière et transportez-la dans la salle animalière spécifique exempte d’agents pathogènes (FPS) avec les instruments nécessaires (une paire de ciseaux, des pinces et des aiguilles d’inoculation).
4. Préparez l’animal en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Enlevez les poils du thorax latéral droit de souris immunodéficientes NOD-SCID femelles ou mâles âgées de 4 à 6 semaines et désinfectez la peau avec de l’alcool à 75%. Anesthésiez les souris par une injection intrapéritonéale de 80 mg/kg de kétamine et de 10 mg/kg de xylazine (voir le tableau des matières) et enduisez leurs yeux d’une pommade vétérinaire pour prévenir la sécheresse. Confirmer la profondeur de l’anesthésie par la perte du réflexe de pédale.
   2. Faites une incision de 2 mm avec des ciseaux à travers la peau au milieu du thorax latéral droit des souris.
5. Prenez un morceau tumoral de la boîte de Petri et placez-le dans l’aiguille du trocart de 2,4 mm x 2,0 mm (voir le tableau des matériaux) avec une pince.
6. Tenez la souris, resserrez la peau au site de ponction, utilisez le trocart contenant les morceaux tumoraux pour insérer la tumeur à travers l’incision cutanée initiale de 2 mm, déplacez-vous vers l’arrière de l’épaule et poussez le noyau du trocar.
7. Assurez-vous que la pièce tumorale est poussée vers l’extérieur et est laissée dans le sinus de transition formé par la ponction du trocart, puis retirez le trocart.
8. Si la tumeur se déplace avec l’aiguille lorsqu’elle est retirée, utilisez le trocart pour la réinitialiser et suturer l’incision.
   NOTE: Dans cette étude, chaque souris a été inoculée au niveau des membres antérieurs et postérieurs dorsaux. Une à trois souris ont été inoculées par échantillon de tumeur de chaque patient en fonction de la taille de la tumeur.

4. Préservation des tissus tumoraux, fixation et congélation des protéines

REMARQUE: Les tissus tumoraux restants ont été utilisés pour la préservation des graines, la fixation et la congélation de l’ADN / ARN / protéines, respectivement.

1. Retirez la solution saline de la surface tumorale avec une gaze stérile avant de la placer dans le tube de cryoconservation pour vous assurer que la surface tumorale n’est pas excessivement humide.
2. Mettre quatre à six morceaux de tissu tumoral de 2 mm x 2 mm dans un tube de cryoconservation cellulaire de 2 mL, ajouter 1 mL de solution de cryoconservation composée de 90% de sérum fœtal bovin (FBS) et de 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO) dans le tube, mettre le tube dans une boîte de refroidissement à gradient, le congeler à -80 ° C pendant la nuit, et enfin, Transférez-le à l’azote liquide.
3. Placez les blocs de tissu tumoral de 3 mm x 3 mm dans du formol tamponné à 10% pour la fixation tissulaire en vue d’un examen pathologique.
4. Placez le bloc tissulaire de 3 mm x 3 mm dans un tube de cryoconservation cellulaire de 2 mL, congelez-le rapidement dans de l’azote liquide, puis transférez-le dans un réfrigérateur à −80 °C pour l’extraction de l’ADN/ARN et des protéines.
5. Recueillir les informations cliniques des patients, telles que les antécédents de tabagisme, la taille de la tumeur, la différenciation, le sous-type pathologique, le grade du cancer, le stade du cancer, les métastases à distance, l’origine, les antécédents médicaux, l’immunohistochimie, l’infection par le virus du papillome humain (VPH) chez les patients HNSCC et les médicaments de traitement.

5. Passage, cryoconservation et réanimation des tumeurs modèles PDX

1. Mesurer la longueur et la largeur des tumeurs sous-cutanées chez la souris en utilisant des étriers vernier une fois par semaine et calculer le volume tumoral selon la formule: volume tumoral = 0,5 × longueur ×^{largeur 2}. Dessinez la courbe de croissance tumorale.
2. Lorsque la tumeur PDX atteint 2 000 mm³, passez-la à la génération suivante de souris et effectuez une retransplantation tumorale. Effectuez la préparation des instruments en suivant l’étape 4.
3. Euthanasier les souris par luxation cervicale après anesthésie avec 80 mg/kg de kétamine.
4. Désinfectez la peau avec de l’alcool à 75%. Ensuite, coupez la peau entourant la tumeur à l’aide de ciseaux, puis retirez la tumeur avec une pince et placez-la dans une boîte de Pétri.
5. Effectuez la procédure de transplantation de tumeur après l’étape 3.
6. Effectuer la préservation et la cryoconservation des tumeurs du modèle PDX après l’étape 4.
7. Pour la réanimation du tissu tumoral, suivez le principe de congélation lente et de dissolution rapide. Après avoir retiré les cryoflacons de l’azote liquide, placez-les rapidement dans un bain-marie à 37 °C pour une dissolution rapide.
8. Secouez doucement les cryovials au bain-marie pour accélérer le processus de décongélation.
9. Décongeler, transférer les morceaux tumoraux dans la solution saline normale préparée pour le lavage, puis inoculer la prochaine génération de souris. Pour l’opération spécifique, veuillez consulter la procédure de transplantation de tissus à l’étape 3.

6. Détermination de l’efficacité thérapeutique du lenvatinib et du cisplatine dans le modèle ATC PDX

REMARQUE : Le modèle ATC PDX a été utilisé pour tester l’effet thérapeutique de l’inhibiteur de la tyrosine kinase lenvatinib et du médicament chimiothérapeutique cisplatine^25,26,27.

1. Sélectionnez le tissu tumoral de génération P5 d’un modèle ATC PDX (THY-017), coupé en morceaux de tissu de 2 à 4 mm 3 et inoculé par voie sous-cutanée (étape³ ) à l’arrière droit de dix souris nues Balb/c femelles de 4 à 6 semaines.
2. Sélectionnez 15 souris avec des volumes tumoraux compris entre 50 et 150 mm³ et divisez-les en trois groupes.
3. Administrer le lenvatinib (10 mg/kg) par voie intragastrique à un groupe une fois par jour pendant 15 jours, administrer le cisplatine (3 mg/kg) par voie intrapéritonéale à un groupe tous les 3 jours pour un total de six doses, et administrer le groupe témoin avec le même volume de solution saline normale.
4. Mesurez le poids corporel et le volume tumoral des souris deux fois par semaine.
5. À la fin du test, euthanasier les souris (étape 5.3) et peser les tumeurs.

Au total, 18 échantillons de cancer de la thyroïde ont été transplantés et cinq modèles PDX de cancer de la thyroïde ont été construits avec succès (taux de prise tumorale de 27,8%), dont quatre cas de cancers de la thyroïde indifférenciés et un cas de cancer anaplasique de la thyroïde. La corrélation entre le taux de réussite de la construction du modèle et l’âge, le sexe, le diamètre de la tumeur, le grade tumoral et la différenciation ont été analysés. Bien que le taux de réussite du modèle des échantillons tumoraux de grade 4 soit plus élevé que celui des échantillons de grade inférieur, et que le taux de réussite des échantillons tumoraux indifférenciés soit également supérieur à celui des échantillons hautement différenciés, les résultats de l’analyse de corrélation ont montré que ces facteurs n’étaient pas associés au taux de réussite du modèle PDX (Tableau 1). Dix-sept échantillons de HNSCC ont été inoculés et quatre modèles PDX de HNSCCC ont été construits avec succès. L’analyse de corrélation entre le taux de prélèvement tumoral dans la construction du modèle et les paramètres cliniques des échantillons tumoraux a démontré que le degré de différenciation était associé au taux de réussite du modèle, tandis que l’âge, le sexe, les antécédents de tabagisme, le diamètre de la tumeur, le grade du cancer, les métastases et l’infection par le VPH n’affectaient pas le taux de prise tumorale (tableau 2).

Les courbes de croissance tumorale pour chaque modèle PDX ont été tracées pour mieux comprendre les taux de croissance des modèles PDX de différents patients (Figure 1, Figure 2 et Tableau 3). Les cycles tumorigènes moyens (temps écoulé entre l’inoculation et une taille tumorale de 1 000 mm3) de THY-004 des générations P0 à P5 étaient respectivement de 68 jours, 87 jours, 29 jours, 34 jours, 28 jours et 26 jours. Les cycles tumorigènes moyens de THY-012 des générations P0 à P5 étaient respectivement de 119 jours, 61 jours, 66 jours, 55 jours, 87 jours et 116 jours. Les cycles tumorigènes moyens de THY-017 des générations P0 à P5 étaient respectivement de 27 jours, 17 jours, 30 jours, 13 jours, 22 jours et 15 jours. Les cycles tumorigènes moyens de THY-018 des générations P0 à P3 étaient respectivement de 134 jours, 70 jours, 48 jours et 48 jours. Les cycles tumorigènes moyens de THY-021 des générations P0 à P3 étaient respectivement de 53 jours, 66 jours, 35 jours et 49 jours. Les cycles tumorigènes moyens d’OTO-017 des générations P0 à P4 étaient respectivement de 118 jours, 86 jours, 67 jours, 129 jours et 88 jours. Les cycles tumorigènes moyens d’OTO-022 des générations P0 à P5 étaient respectivement de 155 jours, 55 jours, 32 jours, 37 jours, 27 jours et 46 jours. Les cycles tumorigènes moyens d’OTO-030 des générations P0 à P2 étaient respectivement de 133 jours, 93 jours et 104 jours. Les cycles tumorigènes moyens d’OTO-031 des générations P0 à P5 étaient respectivement de 144 jours, 58 jours, 33 jours, 34 jours, 52 jours et 50 jours. Les échantillons ATC ont été transmis de manière stable à la génération P3 et plus tard, tandis que deux cas d’échantillons HNSCC n’ont pas réussi à former des tumeurs après être passés à la génération P1. Les taux de croissance de certains échantillons étaient relativement lents dans la génération P0, mais leurs taux de croissance ont été accélérés après être passés à la génération P1 et aux générations ultérieures. Les caractéristiques histopathologiques des tumeurs des patients avec celles de différentes générations de modèles PDX ont été comparées. Les résultats ont montré que les tumeurs PDX et les tumeurs primaires dérivées des patients étaient morphologiquement presque similaires (Figure 3), avec de légères différences qui peuvent être dues à l’hétérogénéité de la zone d’échantillonnage entre les patients et les différentes générations de PDX.

L’efficacité antitumorale du lenvatinib (un inhibiteur multi-cibles de la tyrosine kinase approuvé pour le traitement du cancer avancé de la thyroïde28) a été évaluée dans le modèle PDX de l’ATC. Comme le montre la figure 4A, le traitement par lenvatinib a significativement inhibé la croissance tumorale dans le modèle ATC PDX par rapport au groupe témoin salin normal (P < 0,05). À la fin de l’expérience, le tissu tumoral a été excisé et pesé pour déterminer le poids de la tumeur. Par rapport au groupe témoin, le poids tumoral du groupe traité par lenvatinib était inférieur, bien qu’aucune différence statistique n’ait été obtenue (Figure 4B). De plus, aucun changement évident de l’état général et du poids corporel n’a été observé chez les souris traitées par le lenvatinib (figure 4C). En raison de la fréquence excessive de l’administration de cisplatine au cours des expériences, les souris ont montré une toxicité significative, se manifestant par une perte de poids et même la mort. L’efficacité antitumorale du cisplatine est illustrée dans la figure supplémentaire 1.

Figure 1 : Courbe de croissance tumorale des modèles ATC PDX de différents patients. Chaque couleur représente la génération spécifiée et chaque courbe représente une seule tumeur. Une à trois souris ont été inoculées au passage 0 (P0) génération, et cinq souris ont été inoculées dans les passages suivants (P1-P5). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Courbe de croissance tumorale des modèles PDX du HNSCC de différents patients. Chaque couleur représente la génération spécifiée et chaque courbe représente une seule tumeur. Une à trois souris ont été inoculées à la génération P0, et cinq souris ont été inoculées à P1 et aux générations ultérieures. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Étude histopathologique. Comparaison histopathologique entre les tumeurs primaires du patient et les PDX correspondants (passage 1 et passage 3) de l’ATC (THY-012, THY-017) et du HNSCC (OTO-017) (coloration hématoxyline-éosine, 100x). Les sous-types pathologiques de THY-012 et THY-017 étaient le carcinome anaplasique de la thyroïde, et le sous-type pathologique d’OTO-017 était le carcinome épidermoïde. Barres d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Efficacité thérapeutique du lenvatinib dans le modèle ATC PDX. Changements dans (A) le volume tumoral, (B) le poids tumoral et (C) le poids corporel des souris porteuses d’ATC PDX après traitement par lenvatinib (10 mg / kg). Des analyses statistiques ont été effectuées à l’aide de tests T pour comparer le lévatinib au contrôle. *P < 0,05 par rapport au groupe témoin a été considéré comme statistiquement significatif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Paramètres	Classe	Taux de prise tumorale (%)	P
Âge (ans)	<60	16.67 (1/6)	0.615
	≥60	33.33 (4/12)
Genre	Mâle	16.67 (1/6)	0.615
	Femelle	33.33 (4/12)
Diamètre de la tumeur	<6cm	37.50 (3/8)	0.608
	≥6cm	20.00 (2/10)
Stade TNM pathologique	Je	0.00 (0/1)	1
	Ш	0.00 (0/1)
		31.25 (5/16)
Différenciation	Haut	0.00 (0/7)	0.059
	Pauvre	25.00 (1/4)
	Indifférencié	57.14 (4/7)

Tableau 1 : Corrélation entre le taux de prise tumorale ATC et les caractéristiques cliniques des patients.

Paramètres	Classe	Taux de prise tumorale (%)	P
VPH	Négatif	33.33 (2/6)	1
	Inconnu ou positif	36.36 (4/11)
Âge (ans)	<60	33.33 (3/9)	1
	≥60	37.50 (3/8)
Genre	Mâle	50.00 (5/10)	0.304
	Femelle	14.29 (1/7)
Tabagisme	Jamais	44.44 (4/9)	0.62
	Jamais	25.00 (2/8)
Diamètre de la tumeur	<3 cm	40.00 (4/10)	1
	≥3cm	28.57 (2/7)
Stade TNM pathologique	Je	75.00 (3/4)	0.423
		25.00 (2/8)
	Ш	0.00 (0/1)
		33.33 (1/3)
Métastases à distance	Y	28.57 (2/7)	0.633
	N	44.44 (4/9)
Différenciation	Haut	12.50 (1/8)	0.036*
	Modéré à élevé	100.00 (2/2)
	Modéré	0.00 (0/2)
	Modéré à faible	66.67 (2/3)
* P < 0,05

Tableau 2 : Corrélation entre le taux de prise tumorale HNSCC et les caractéristiques cliniques des patients. *P < 0,05.

Tableau 3 : Le cycle tumorigène moyen (temps écoulé entre l’inoculation et une taille tumorale de 1 000mm3) des modèles ATC et HNSCC.

Figure supplémentaire 1 : L’efficacité thérapeutique du cisplatine dans le modèle ATC PDX. Changements dans (A) le volume tumoral, (B) le poids tumoral et (C) le poids corporel des souris porteuses d’ATC PDX après traitement par cisplatine (3 mg / kg). Des analyses statistiques ont été effectuées à l’aide de tests T pour comparer le cisplatine au témoin. *P < 0,05 par rapport au groupe témoin a été considéré comme statistiquement significatif. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Aucun conflit d’intérêts potentiel n’est divulgué.