Procédé d’homogénéisation rapide, simple et normalisé pour préparer des émulsions antigènes/adjuvants pour induire une encéphalomyélite auto-immune expérimentale

Résumé

Pour induire une encéphalomyélite auto-immune expérimentale, un modèle animal de sclérose en plaques, les souris sont immunisées avec une émulsion eau dans huile contenant un autoantigène et un adjuvant de Freund complet. Bien qu’il existe plusieurs protocoles pour la préparation de ces émulsions, un protocole d’homogénéisation rapide, simple et standardisé pour la préparation de l’émulsion est présenté ici.

Résumé

L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) partage des caractéristiques immunologiques et cliniques similaires à celles de la sclérose en plaques (SEP) et est donc largement utilisée comme modèle pour identifier de nouvelles cibles médicamenteuses pour un meilleur traitement des patients. La SEP se caractérise par plusieurs évolutions différentes de la maladie : la SEP cyclique (SEP-RR), la SEP progressive primaire (SPPP), la SEP progressive secondaire (SEP-SP) et une forme rare de SEP progressive-récurrente (SEP-PR). Bien que les modèles animaux n’imitent pas avec précision tous ces phénotypes de maladies humaines contrastées, il existe des modèles EAE qui reflètent certaines des différentes manifestations cliniques de la SEP. Par exemple, l’EAE induite par la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline (MOG) chez les souris C57BL/6J imite la SPPP humaine, tandis que l’EAE induite par la protéine protéolipide de myéline (PLP) chez les souris SJL/J ressemble à la SEP-RR. D’autres autoantigènes, tels que la protéine basique de myéline (MBP), et un certain nombre de souches de souris différentes sont également utilisés pour étudier EAE. Pour induire la maladie dans ces modèles EAE d’auto-immunisation antigène, une émulsion eau dans huile est préparée et injectée par voie sous-cutanée. La majorité des modèles EAE nécessitent également une injection de toxine de la coqueluche pour que la maladie se développe. Pour une induction EAE cohérente et reproductible, un protocole détaillé pour préparer les réactifs à produire des émulsions antigènes/adjuvants est nécessaire. La méthode décrite ici tire parti d’une méthode standardisée pour générer des émulsions eau dans huile. Il est simple et rapide et utilise un homogénéisateur à agitation au lieu de seringues pour préparer des émulsions de qualité contrôlée.

Introduction

Une rupture de la tolérance immunologique peut entraîner la génération de maladies auto-immunes, telles que la sclérose en plaques (SEP). On estime que 2,8 millions de personnes vivent avec la SEP dans le monde¹. Bien que la cause exacte de la SEP soit encore largement inconnue, la dérégulation des cellules T et B autoréactives, ainsi que les défauts de la fonction Treg, jouent un rôle important dans la pathogenèse de la maladie ^2,3.

Les modèles animaux de maladies auto-immunes sont des outils essentiels pour étudier les modalités thérapeutiques potentielles.....

Protocole

Toutes les procédures sur les animaux ont été effectuées conformément aux pratiques du Conseil suédois de la recherche animale et ont été approuvées par le Comité d’éthique animale, Lund-Malmö, Suède (numéro de permis: M126-16).

Remarque : Un flux schématique de la méthode est décrit à la figure 1.

1. Préparation du matériel

NOTE: Préparer tous les réactifs de manière aseptique dans une hotte stérile, et aliquote et conserver à la température indiquée. Les réactifs peuvent être conservés jusqu’à 2 ans sans perdre leur effet.

1. Prép....

Résultats

Le protocole rapide, simple et normalisé pour la préparation des émulsions CFA/MOG est illustré à la figure 1. Cette méthode a récemment été décrite ailleurs⁶. Les émulsions CFA/MOG peuvent également être préparées avec d’autres méthodes, telles que la méthode traditionnelle de seringue ou par vortex. Ces méthodes ont été comparées ici en évaluant la qualité des émulsions. Toutes les méthodes ont produit des émulsions eau dans huile; L’homogénéité et la qualité de ces.......

Discussion

Les émulsions eau-dans-huile, telles que l’antigène/adjuvant de Freund, sont utilisées depuis plus d’un demi-siècle pour induire EAE¹⁷. Il n’existe actuellement aucune méthode normalisée pour préparer des émulsions d’antigènes indépendante de l’influence humaine. Le mélange manuel à l’aide de seringues est standard pour la plupart des laboratoires, mais cette méthode prend du temps, entraîne souvent une perte excessive de matériel et la qualité diffère selon le scientifique qui la prépare.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Seringue d’injection de 1 mL	B. Braun	9166017V  ;
Seringue d’injection de 1 mL	Sigma-Aldrich	Z683531
tubes vides de 7 ml avec bouchons	Bertin-Instruments	P000944LYSK0A.0	Tube de 7 mL tube
50 mL tube à centrifuger stérile	Fisher Scientific	10788561	50 mL tube
Bordetella pertussis toxine	Sigma-Aldrich	P2980	Conserver à -20 ° ; C
Dispersant, huile minérale légère	Sigma-Aldrich	M8410	Stocker chez RT
Kit d’émulsion	Bertin-Instruments	D34200.10 ch	. Contenant un tube, un capuchon et un piston
Adjuvant de Freund incomplet	Sigma-Aldrich	; F5506	Magasin à +4 ° ; C
Mycobacterium tuberculosis, H37RA	Fisher Scientific	DF3114-33-8	Magasin à +4 ° ; C
Mastersizer 2000  ;	Malvern Panalytical	N/A	Analyseur granulométrique
Minilys-Homogénéisateur personnel	Bertin-Instruments	P000673-MLYS0-A	Homogénéisateur à secousses
MOG 35-55 Peptide  ;   ;   ;	Innovagen	N/A
Montanide ISA 51 VG	Seppic	36362Z	Adjuvant d’huile approuvé par la FDA
Pall Acrodisc Seringue Filtres 0.2 &mu ; m	Fisher Scientific	17124381	Filtre Sterlie
PBS, sans Ca2+/Mg2+ Thermo	Fisher Scientific	14190144	Microscope à
détecteur de phase	Olympus	BX40-B
Perles d’acier 3,2 mm	Fisher Scientific	NC0445832	Autoclave et stockage chez RT
Triton X-100	Sigma-Aldrich	648463	Store chez RT

de PBS