Visualisation de la mitophagie avec des colorants fluorescents pour les mitochondries et le lysosome

Résumé

La mitophagie est le principal mécanisme du contrôle de la qualité mitochondriale. Cependant, l’évaluation de la mitophagie in vivo est entravée par le manque de tests quantitatifs fiables. Un protocole d’observation de la mitophagie dans les cellules vivantes est présenté ici à l’aide d’un colorant mitochondrial vert-fluorescent perméable de cellules et d’un colorant lysosome fluorescent rouge.

Résumé

Les mitochondries, étant les centrales électriques de la cellule, jouent un rôle important dans la bioénergétique, la génération de radicaux libres, l’homéostasie du calcium et l’apoptose. La mitophagie est le principal mécanisme de contrôle de la qualité mitochondriale et est généralement étudiée à l’aide d’observations microscopiques, mais les tests de mitophagie in vivo sont difficiles à réaliser. L’évaluation de la mitophagie par imagerie d’organites vivants est une méthode alternative et nécessaire pour la recherche mitochondriale. Ce protocole décrit les procédures d’utilisation du colorant mitochondrial vert-fluorescent MitoTracker Green et du colorant lysosome rouge-fluorescent LysoTracker Red dans les cellules vivantes, y compris le chargement des colorants, la visualisation des mitochondries et du lysosome, et les résultats attendus. Des étapes détaillées pour l’évaluation de la mitophagie dans les cellules vivantes, ainsi que des notes techniques sur les paramètres du logiciel de microscope, sont également fournies. Cette méthode peut aider les chercheurs à observer la mitophagie à l’aide de la microscopie fluorescente à cellules vivantes. En outre, il peut être utilisé pour quantifier les mitochondries et les lysosomes et évaluer la morphologie mitochondriale.

Introduction

Les mitochondries sont les centrales électriques de presque toutes les cellules eucaryotes ^1,2. En plus de la production d’ATP par phosphorylation oxydative, les mitochondries jouent un rôle essentiel dans d’autres processus tels que la bioénergétique, l’homéostasie du calcium, la génération de radicaux libres, l’apoptose et l’homéostasie cellulaire ^3,4,5. Comme les mitochondries génèrent des espèces réactives de l’oxygène (ROS) à partir de multiples complexes dans la chaîne de transport d’électrons, elles sont consta....

Protocole

1. Culture cellulaire et passage

REMARQUE: Le protocole est décrit en utilisant des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) en culture de routine comme exemple.

1. Culture de cellules MEF dans des boîtes de culture cellulaire de 10 cm avec 10 ml de milieu aigle modifié (DMEM) de Dulbecco. Incuber à 37 °C et 5% de CO₂ et surveiller les cellules au microscope à un grossissement de 100x.
2. Effectuer le passage de cellule de routine.
   1. Lorsque les cellules atteignent une confluence de 80 % à 90 % (tous les 3 jours), lavez les cellules avec 2 mL de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbe....

Résultats

MitoTracker Green est une coloration mitochondriale verte-fluorescente capable de se localiser avec précision dans les mitochondries. Le colorant peut facilement colorer les cellules vivantes et est moins efficace pour colorer les cellules mortes ou fixées à l’aldéhyde (Figure 2). Le colorant lysosome fluorescent rouge LysoTracker Red est capable de marquer et de suivre les organites lysosomales acides et ne peut colorer que les cellules vivantes (Figure 2). L’i.......

Discussion

Le protocole décrit ici fournit une méthode d’évaluation et de surveillance du processus dynamique de mitophagie dans les cellules vivantes, impliquant les autophagosomes, les lysosomes et la fission mitochondriale, par co-coloration avec des mitochondries perméables aux cellules et des colorants lysosomes. La méthode peut également être utilisée pour identifier les mitochondries et évaluer la morphologie mitochondriale. Les deux colorants utilisés dans cette étude doivent être protégés de la lumière, les cycles multiple.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Compteur de cellules automatisé	Countstar	IC1000
Lames de chambre de comptage de cellules	Countstar	12-0005-50
Milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM)	Corning	10-013-CV
Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS)	Corning	21-031-CVC
Boîte de culture cellulaire à fond de verre (boîte confocale)	NEST	801002
Image J (Rasband, NIH)	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Krebs&ndash ; Tampon Henseleit(KHB)	Auto-préparé
			mol/L, colorant lysosome fluorescent rouge
MitoTracker Green	Invitrogen	1842298	200 µ ; stock mol/L, colorant mitochondriale vert-fluorescent
Fibroblastes embryonnaires			auto-préparé
(lentille d’huile 63x)	ZEISS	ZEISS LSM 880
Trypsine-EDTA 0,25 %	Gibico	Cat# 25200056
ZEISS LSM 880 Microscope confocal à balayage laser	ZEISS	ZEISS LSM 880
Logiciel de microscopie ZEN 2.1 (confocal logiciel d’imagerie microscope)	ZEISS	ZEN 2.1