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Article de méthode

Modélisation du carcinome épidermoïde bucco-œsophagien dans les organoïdes 3D

4.3K vues

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DOI :

10.3791/64676

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23 décembre 2022

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1Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, Columbia University, 2Organoid and Cell Culture Core, Columbia University Digestive and Liver Diseases Research Center, Columbia University, 3Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, Columbia University, 4Histopathology Facility, Fox Chase Cancer Center, 5Division of Digestive and Liver Diseases, Department of Medicine, Columbia University, 6Department of Genetics and Development, Columbia University, 7Section of Oral, Diagnostic and Rehabilitation Sciences, College of Dental Medicine, Columbia University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit les étapes clés pour générer et caractériser les organoïdes 3D murins oraux-œsophagiens qui représentent les lésions de carcinome épidermoïde normal, prénéoplasique et épidermoïde induites par cancérogenèse chimique.

Résumé

Le carcinome épidermoïde de l’œsophage (ESCC) est répandu dans le monde entier, représentant 90% de tous les cas de cancer de l’œsophage chaque année, et est le plus mortel de tous les carcinomes épidermoïdes humains. Malgré les progrès récents dans la définition des changements moléculaires accompagnant l’initiation et le développement de l’ESCC, le pronostic du patient reste sombre. L’annotation fonctionnelle de ces changements moléculaires est la prochaine étape nécessaire et nécessite des modèles qui capturent les caractéristiques moléculaires de l’ESCC et peuvent être manipulés facilement et à peu de frais pour l’annotation fonctionnelle. Les souris traitées avec la fumée de tabac mimétique 4-nitroquinoléine 1-oxyde (4NQO) forment de manière prévisible un ESCC et une prénéoplasie œsophagienne. Il convient de noter que les lésions de 4NQO apparaissent également dans la cavité buccale, le plus souvent dans la langue, ainsi que dans le préestomac, qui partagent tous l’épithélium pavimenteux stratifié. Cependant, ces souris ne peuvent pas être simplement manipulées pour tester des hypothèses fonctionnelles, car la génération de modèles murins isogéniques nécessite beaucoup de temps et de ressources. Ici, nous surmontons cette limitation en générant des organoïdes tridimensionnels (3D) dérivés de cellules uniques à partir de souris traitées avec 4NQO pour caractériser les ESCC murins ou les cellules prénéoplasiques ex vivo. Ces organoïdes capturent les caractéristiques saillantes de l’ESCC et de la prénéoplasie œsophagienne, peuvent être exploités rapidement et à peu de frais pour former des modèles isogéniques et peuvent être utilisés pour des expériences de transplantation syngénique. Nous démontrons comment générer des organoïdes 3D à partir de tissu œsophagien murin normal, prénéoplasique et SCC et maintenir et cryopréserver ces organoïdes. Les applications de ces organoïdes polyvalents sont vastes et comprennent l’utilisation de souris génétiquement modifiées et une caractérisation plus poussée par cytométrie de flux ou immunohistochimie, la génération de lignées organoïdes isogéniques à l’aide des technologies CRISPR et le criblage de médicaments ou la transplantation syngénique. Nous pensons que l’adoption généralisée des techniques démontrées dans ce protocole accélérera les progrès dans ce domaine pour lutter contre le lourd fardeau de la CSC.

Introduction

Le carcinome épidermoïde œsophagien (ESCC) est le plus mortel des carcinomes épidermoïdes humains, en raison de son diagnostic tardif, de sa résistance au traitement et de ses métastases 1,2. L’ESCC provient de l’épithélium pavimenteux stratifié, qui tapisse la surface luminale de l’œsophage. L’épithélium pavimenteux est composé de cellules basales prolifératives et de cellules différenciées dans la couche de cellules suprabasales. Dans des conditions physiologiques, les cellules basales expriment des marqueurs tels que p63, Sox2 et la cytokératine K5 et K14, tandis que les cellules différenciées expriment K4, K13 et IVL. Les cellules basales elles-mêmes sont hétérogènes et comprennent des cellules souches putatives définies par des marqueurs tels que K153 et CD734. En homéostasie, les cellules basales subissent une différenciation terminale post-mitotique au sein de la couche cellulaire suprabasale, tandis que les cellules différenciées migrent et se desquamate dans la lumière pour compléter le renouvellement épithélial. Rappelant leurs cellules d’origine, l’ESCC présente une différenciation des cellules squameuses à des degrés divers. L’ESCC s’accompagne souvent de lésions précurseurs histologiques multifocales, appelées néoplasie intraépithéliale (IEN) ou dysplasie, comprenant des cellules basaloïdes atypiques. En plus des changements épithéliaux, ESCC affiche un remodelage tissulaire dans le compartiment sous-épithélial, où l’activation des fibroblastes associés au cancer (CAF) et le recrutement de cellules immunitaires / inflammatoires ont lieu pour favoriser le microenvironnement favorisant la tumeur.

La pathogenèse de l’ESCC implique des changements génétiques et l’exposition à des facteurs de risque environnementaux. Les lésions génétiques clés comprennent l’inactivation des gènes suppresseurs de tumeurs TP53 et CDKN2A (p16INK4A) et l’activation des oncogènes CCND1 (cycline D1) et EGFR, qui aboutissent à une altération de la fonction de point de contrôle du cycle cellulaire, à une prolifération aberrante et à la survie sous un stress génotoxique lié à l’exposition à des carcinogènes environnementaux. En effet, les changements génétiques interagissent étroitement avec les facteurs de risque comportementaux et environnementaux, le plus souvent la consommation de tabac et d’alcool. La fumée de tabac contient des cancérogènes pour l’homme tels que l’acétaldéhyde, qui est également le principal métabolite de l’alcool. L’acétaldéhyde induit des adduits à l’ADN et des liaisons croisées interbrins de l’ADN, entraînant des dommages à l’ADN et l’accumulation de mutations de l’ADN et d’instabilité chromosomique. Compte tenu des stimuli mitogènes excessifs et de la prolifération aberrante due à l’activation oncogène, la transformation maligne des cellules épithéliales œsophagiennes est facilitée par des mécanismes permettant de faire face au stress génotoxique, notamment l’activation des antioxydants, l’autophagie et la transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT). Fait intéressant, ces fonctions cytoprotectrices sont souvent activées dans les cellules souches cancéreuses ESCC (CSC) qui sont caractérisées par une expression élevée de CD44 (CD44H) et ont les capacités d’initiation tumorale, d’invasion, de métastases et de résistance au traitement 5,6,7.

L’ESCC a été modélisé en culture cellulaire et dans des modèlesde rongeurs 8,9. Au cours des trois dernières décennies, des modèles robustes de souris génétiquement modifiées d’ESCC ont été développés. Il s’agit notamment des souris transgéniques CCND1 et EGFR 10,11 et p53 et p120Ctn knockout 12,13. Cependant, les changements génétiques uniques n’entraînent généralement pas d’apparition rapide de l’ESCC. Ce défi a été surmonté grâce à l’utilisation de cancérogènes œsophagiens qui récapitulent bien les lésions génétiques humaines dans ESCC14. Par exemple, la 4-nitroquinoléine-1-oxyde (4NQO) accélère le développement de l’ESCC chez les souris transgéniques CCND1 15. Au cours des dernières années, les cellules souches épithéliales œsophagiennes présumées, les cellules progénitrices et leurs destins respectifs ont été étudiés dans des modèles murins traçables par lignée cellulaire 3,4. De plus, ces souris traçables de lignée cellulaire ont été utilisées pour explorer les cellules d’origine de l’ESCC et comment ces cellules donnent naissance à des CSC CD44H via l’histologie conventionnelle et la caractérisation moléculaire basée sur l’omique7.

Un domaine émergent lié à ces modèles murins est la nouvelle application de techniques de culture cellulaire pour analyser les cellules vivantes de l’ESCC et des précurseurs dans un système organoïde tridimensionnel (3D) dans lequel l’architecture des tissus d’origine est récapitulée ex vivo 7,8,9. Ces organoïdes 3D sont rapidement développés à partir d’une suspension unicellulaire isolée à partir de tissus murins, y compris les tumeurs primaires et métastatiques (par exemple, les ganglions lymphatiques, les poumons et les lésions hépatiques). Les cellules sont incorporées dans un extrait de membrane basale (EMB) et alimentées avec un milieu de culture cellulaire sans sérum bien défini. Les organoïdes 3D se développent en 7 à 10 jours, et les structures sphériques résultantes se prêtent à la sous-culture, à la cryoconservation et aux tests pour analyser une variété de propriétés et de fonctions cellulaires, y compris les marqueurs CSC, l’EMT, l’autophagie, la prolifération, la différenciation et la mort cellulaire apoptotique.

Ces méthodes peuvent être largement appliquées à des cultures organoïdes 3D établies à partir de n’importe quel tissu épithélial pavimenteux stratifié, tel que la muqueuse de la tête et du cou (cavité buccale, langue, pharynx et larynx) et même le préestomac. La muqueuse de la tête et du cou est contiguë à l’œsophage, et les deux tissus partagent une organisation, une fonction et une susceptibilité tissulaires similaires à la maladie. Le carcinome épidermoïde de la tête et du cou (HNSCC) et l’ESCC partagent des lésions génétiques et des facteurs de risque environnementaux liés au mode de vie, tels que l’exposition au tabac et à l’alcool. Soulignant cette similitude, les souris traitées avec le 4NQO mimétique de la fumée de tabac développent facilement à la fois HNSCC et ESCC. Compte tenu de la facilité avec laquelle les protocoles décrits ci-dessous peuvent être appliqués à la modélisation HNSCC, nous incluons des instructions spécifiques pour établir des cultures organoïdes 3D à partir de ces lésions.

Ici, nous fournissons des protocoles détaillés pour générer des organoïdes 3D œsophagiens murins (MEO) représentant des lésions normales, prénéoplasiques et ESCC qui se développent chez les souris traitées avec 4NQO. Diverses souches de souris peuvent être utilisées, y compris des souches de laboratoire courantes telles que C57BL / 6 et des dérivés traçables de lignée cellulaire et d’autres dérivés génétiquement modifiés. Nous mettons l’accent sur les étapes clés, y compris l’isolement de l’épithélium œsophagien murin normal ou malade, la préparation de suspensions unicellulaires, la culture et la surveillance des organoïdes 3D en croissance, la sous-culture, la cryoconservation et le traitement pour les analyses ultérieures, y compris la morphologie et d’autres applications.

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Protocole

Les expériences sur les murins ont été planifiées et réalisées conformément à la réglementation et au protocole animal #AABB1502, examinés et approuvés par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université Columbia. Les souris ont été hébergées dans une installation de soins aux animaux appropriée qui assure le traitement sans cruauté des souris et fournit des soins vétérinaires appropriés aux souris et une formation en sécurité de laboratoire pour le personnel de laboratoire.

1. Traitement de souris avec 4NQO pour induire des lésions IEN et ESCC œsophagiennes (temps considéré: jusqu’à 28 semaines)

NOTE: Pour générer des MEO représentant des lésions œsophagiennes néoplasiques, les souris sont soumises à une cancérogenèse chimique médiée par le 4NQO, comme décrit précédemment par Tang et al.14. Les MEO normaux/non néoplasiques sont générés à partir de souris non traitées.

  1. Souris
    1. Hébergez quatre à cinq souris par cage et acclimatez-les à l’animalerie pendant au moins 1 semaine avant de commencer une expérience. Pour réduire la possibilité que les troubles liés à l’âge entraînent l’arrêt prématuré de l’expérience complète de 28 semaines, commencez avec des souris âgées de 8 semaines à 16 semaines.
      NOTE: Des souris C57BL / 6 pesant environ 20-30 g ont été utilisées dans ce protocole. Pour des expériences plus courtes, des souris plus âgées peuvent être utilisées. Les souris mâles ou femelles sont acceptables. Les souris témoins (pas de traitement, voir rubrique 1.3.1) doivent être appariées en âge et en sexe.
  2. Préparation de l’eau potable contenant du 4NQO
    1. Préparer 1 mg/mL de solution mère de 4NQO dans de l’éthylène propylène glycol (table des matières). Dissoudre 100 mg de 4NQO dans 100 mL d’éthylène propylène glycol à 99,9 % dans un bécher en verre de 500 mL recouvert d’un film d’étanchéité. Bien mélanger à température ambiante (RT) à l’aide d’un agitateur magnétique à 800 tr/min pendant 30 min. Conserver à 4 °C.
    2. Ajouter 900 mL d’eau désionisée autoclavée à 100 mL de solution mère 4NQO à 1 mg/mL et mélanger par inversion dans une bouteille graduée en plastique de 2 L recouverte d’un film d’étanchéité. Un volume de 1 L de 100 μg/mL de 4NQO dans 10 % d’éthylène propylène glycol servira deux cages à souris équipées d’un flacon de 500 mL.
      ATTENTION: Il est à noter que le 4NQO est un cancérogène chimique synthétique qui peut causer le cancer. Manipulez avec des gants en nitrile et une blouse de laboratoire à manches longues, et portez des chaussures fermées. Envisagez une protection oculaire, une protection faciale et un couvre-chef appropriés. Pour l’élimination des déchets, le 4NQO doit être placé dans un conteneur étiqueté conformément aux directives institutionnelles pour la gestion des déchets dangereux par la santé et la sécurité environnementales.
  3. Traitement par 4NQO et surveillance
    1. Attachez le flacon et administrez 4NQO via l’eau potable ad libitum aux souris pendant 16 semaines. Utilisez 10 % (p/v) de propylène glycol comme véhicule témoin (sans traitement).
      REMARQUE: Des durées plus courtes de traitement par 4NQO peuvent être utilisées pour induire l’IEN.
    2. Remplissez l’eau une fois par semaine.
    3. Pesez chaque souris chaque semaine en la plaçant dans un récipient en plastique sur une balance de laboratoire.
    4. À la fin de la période de traitement 4NQO de 16 semaines, commencez à donner régulièrement de l’eau potable aux souris pendant la période d’observation post-4NQO pendant une période pouvant aller jusqu’à 12 semaines (Figure 1).
    5. Surveillez quotidiennement les souris pour détecter tout signe de détresse (par exemple, mobilité réduite, habitus voûté et comportement renfermé), de dysphagie et de déshydratation. De plus, évaluez les souris chaque semaine pour les changements de poids corporel ou de nourriture et de liquide. Si le poids corporel diminue de plus de 10% par rapport au poids corporel initial, nourrissez les souris avec un complément alimentaire liquide.
      REMARQUE: Une perte de poids corporel réfractaire aux compléments alimentaires liquides peut indiquer un ESCC, et les souris qui perdent plus de 20% de leur poids corporel doivent être euthanasiées. Il est important de noter que les MEO peuvent être générés à partir de souris euthanasiées prématurément. Notez que les souris C57BL/6 sans modifications génétiques ne présentent généralement pas de signes de morbidité ou de lésions visibles des ESCC avant la fin de la période d’observation post-4NQO.
  4. Préparation des animaux
    1. Euthanasier les souris dans une chambre de CO 2 remplie de CO2 à un débit qui déplace 30% à 70% du volume de la chambre par minute. Confirmer la mort par luxation cervicale.
    2. Épinglez les membres et le nez de la souris en décubitus dorsal à la plate-forme de dissection à l’aide d’aiguilles de 21 G.
    3. Désinfectez la surface ventrale de la souris avec de l’éthanol à 70%.
  5. Dissection (temps : 0,5 h)
    1. Ouvrez la peau en pinçant la fourrure abdominale médiane et la peau pour s’assurer qu’elle est libérée des viscères ci-dessous. Utilisez les ciseaux chirurgicaux pour faire une incision médiane crâniocaudienne et ventrale du bas-ventre au menton.
    2. En commençant par l’incision médiane, utilisez des ciseaux chirurgicaux pour faire des coupes radiales s’étendant jusqu’aux membres des deux côtés de la souris. Écorcher les lambeaux de peau ouverts.
    3. Pour exposer la trachée cervicale, utilisez les ciseaux à dissection pour diviser les glandes salivaires à la ligne médiane. La trachée se trouve profondément dans les glandes.
    4. Pour exposer la trachée thoracique, retirez le sternum.
      1. Pincez et soulevez doucement le péritoine avec une pince et utilisez des ciseaux pour diviser le péritoine crâniocaudale et latéralement le long de la cage thoracique.
      2. Rétractez doucement le foie de la surface caudale du diaphragme et utilisez des ciseaux pour faire une petite incision dans le diaphragme à l’encoche sternale, en particulier à la surface dorsale du processus xiphoïde. Cela libère le poumon et le cœur de la plèvre viscérale.
      3. Séparez la cage thoracique du contenu thoracique. Insérez des ciseaux dans l’incision du diaphragme et disséquez crânienne jusqu’à la ceinture cervicale. Au cours de cette dissection, adhérer étroitement à la surface dorsale du sternum pour éviter d’endommager les organes inférieurs. Assurez-vous que le plan de dissection est antérieur à la trachée.
      4. Coupez les côtes de chaque côté du sternum à l’aide de ciseaux et retirez le sternum. Assurez-vous que le contenu thoracique est exposé.
    5. Exposez l’œsophage abdominal. Soulevez doucement l’estomac antérieurement en tenant l’antre avec une pince. Disséquer la rate, le pancréas et le mésentère de l’estomac et de l’œsophage avec des ciseaux.
    6. Exposez l’œsophage thoracique (figure 2).
      1. Soulevez doucement la trachée immédiatement caudale au cartilage thyroïdien et disséquez l’œsophage de la face dorsale de la trachée à l’aide de ciseaux d’iris.
      2. Divisez la trachée au niveau du cartilage thyroïdien avec des ciseaux d’iris.
      3. Décollez la trachée du reste de l’œsophage par dissection soigneuse dans le sens caudal.
      4. Enlevez le poumon, le cœur et le thymus en masse avec la trachée. Prenez soin d’éviter d’endommager l’œsophage lors de la dissection et de la division de l’aorte et de la veine cave.
    7. Divisez l’estomac au niveau du pylore avec des ciseaux.
    8. Séparez l’œsophage de la vertèbre en tenant l’antre avec une pince et en disséquant crâniennement.
    9. Divisez l’œsophage au niveau du cartilage thyroïdien et récoltez l’œsophage et l’estomac en masse (Figure 3).
    10. Séparez l’estomac et l’œsophage en divisant l’œsophage au niveau du cardia (figure 4, panneau supérieur, ligne rouge).
    11. Disséquez tout fascia sur la surface externe de l’œsophage. Pour réserver un échantillon pour l’histologie (facultatif), retirez la moitié de l’œsophage et fendez-le longitudinalement avec des ciseaux. Placer le reste de l’œsophage intact dans du PBS froid sur de la glace.
    12. Ouvrez l’estomac le long de la plus grande courbure et lavez suffisamment avec du PBS. Séparez le préestomac et lavez avec du PBS froid. Placez le préestomac dans du PBS froid sur de la glace.
    13. Pour récolter la langue, retirez l’aiguille de 21 G sur le nez et retirez la langue avec une pince à épiler. Coupez la langue le plus longtemps possible. Placez la langue dans du PBS froid sur de la glace.

2. Mise en place d’une culture d’organoïdes de l’œsophage murin (MEO)

REMARQUE: Ce protocole peut également être utilisé pour établir une culture organoïde de la langue murine avec l’ajout d’une étape dans laquelle le tissu de la langue est haché avant la trypsinisation. Voir la note de l’étape 2.2.3.

  1. Préparation des réactifs
    REMARQUE : Une liste des réactifs se trouve dans le Tableau des matériaux. Préparer et entreposer les solutions mères conformément aux instructions du fabricant, sauf indication contraire.
    1. S’assurer que les aliquotes à usage unique de la matrice membranaire basale (BME) utilisées dans ce protocole sont entreposées à −20 °C jusqu’au jour de l’utilisation, sont ensuite décongelées sur de la glace ou à 2-8 °C, et sont conservées sur la glace en tout temps lorsqu’elles ne sont pas utilisées.
    2. Dissoudre 250 mg d’inhibiteur de la trypsine (ITS) du soja dans 1 000 mL de PBS (concentration de 250 mg/mL de stock) et le stériliser par filtre (0,22 μm). Distribuer 50 ml d’aliquotes dans des tubes coniques et conserver jusqu’à 6 mois à 4 °C.
    3. Préparer le milieu organoïde de souris (MOM): Compléter DMEM / F12 avancé avec 1 mM N-acétyl-L-cystéine (NAC), 2% R-Spondin et milieu conditionné Noggin (RN CM), 1x supplément N-2, 1x supplément B-27, 10 mM HEPES, 1x antibiotique-antimycotique, 1x supplément de GlutaMAX et 100 ng / mL de facteur de croissance épidermique de souris (mEGF). Préparer le MOM 500 mL à la fois, le diviser en aliquotes de 50 mL et conserver entre 2 et 8 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à être utilisé. Ajouter 0,5 μg/mL d’amphotéricine B et 10 μM Y-27632 juste avant utilisation.
    4. Préchauffer le MOM, la trypsine à 0,25 % et l’inhibiteur de la trypsine (ITS) de soja à 37 °C dans un bain d’eau ou de billes avant utilisation.
  2. Isolement des kératinocytes du tissu murin disséqué (temps considéré: 2 h)
    1. Transférer le tissu œsophagien dans 500 μL de dispase dans du PBS (2,5-5 unités au total) et incuber dans un thermomélangeur pendant 10 minutes à 37 °C et 800 tr/min.
    2. Transférer le tissu dans une boîte de culture et retirer délicatement la couche musculaire de l’épithélium à l’aide d’une pince (Figure 4).
      NOTE: Cette étape peut également être effectuée par un chercheur expérimenté avant l’incubation avec dispase.
    3. Transférer l’épithélium dans un tube microcentrifuge contenant 500 μL de trypsine à 0,25 % et incuber dans un thermomélangeur pendant 10 min à 37 °C et 800 tr/min.
      REMARQUE: Si le matériau de départ est du tissu de la langue, hacher le tissu avec un scalpel stérile en morceaux plus petits, d’environ 1-2 mm2 , avant d’ajouter la trypsine.
    4. Centrifuger brièvement pendant 5 à 10 s à 2 000 x g pour enduire le tissu. Préparez un tube conique de 50 mL avec une crépine à cellules de 100 μm. Transférer la suspension tissulaire/cellulaire à travers la crépine avec une extrémité de large alésage en utilisant des mouvements circulaires.
    5. Ajouter 3 mL d’ITS à travers la passoire, en utilisant des mouvements circulaires pour se laver.
    6. Frottez la passoire avec la base d’un piston de seringue à tuberculine de 1 ml pour pousser les cellules à travers.
    7. Lavez la passoire avec 3 ml de PBS 3 à 5 fois, en frottant la crépine avec la base de la seringue entre les lavages.
    8. Centrifuger le tube à 300 x g pendant 10 min à 4 °C pour granuler les cellules.
    9. Retirer le surnageant en laissant 1 mL de solution dans le tube.
    10. Remettez la pastille en suspension dans le 1 mL restant et transférez la suspension cellulaire à travers une crépine cellulaire de 70 μm dans un nouveau tube conique de 50 mL.
    11. Centrifuger le tube à 300 x g pendant 10 min à 4 °C pour granuler les cellules.
    12. Resuspendre la pastille dans 100 μL de MOM; Ajustez le volume au besoin. Effectuez un comptage automatisé des cellules par exclusion du bleu trypan.
  3. Ensemencement de la suspension cellulaire initiale (temps considéré: <1 h)
    1. Préchauffer une plaque de culture cellulaire de 24 puits dans un incubateur à 37 °C.
    2. Plaquer 5 000 cellules viables dans 75 % (v/v) BME/MOM avec un volume total de 50 μL par puits. Maximisez le nombre de puits plaqués et préparez suffisamment de cellules dans BME pour un puits supplémentaire selon les exemples de calculs ci-dessous.
      REMARQUE : Cryoconserver tout excès de cellules dans le milieu de cryoconservation (10 % de DMSO dans le FBS) à une concentration maximale de 1 x 106 cellules/mL. Conservez les cryovials dans un récipient congelé pendant la nuit à −80 °C. Transférez-les dans de l’azote liquide en phase vapeur pour un stockage à long terme.
    3. Dans un tube à microcentrifugation, préparer d’abord une dilution cellulaire appropriée dans MOM, puis ajouter le BME à l’aide d’une pointe de large alésage juste avant le placage.
    4. À l’aide d’une pointe de forage de 200 μL de largeur, ajouter lentement une gouttelette de 50 μL au centre du puits, en évitant le contact entre la pointe et le fond ou les côtés du puits (figure 5). Veillez à ne pas utiliser trop de force pour expulser le liquide de la pointe, sinon le dôme s’aplatira.
    5. Laisser le BME se solidifier pendant 30 minutes dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2, 95 % d’humidité relative (HR).
    6. Ajouter délicatement 500 μL de MOM par puits, complété par 0,5 μg/mL d’amphotéricine B et 10 μM Y-27632.
      REMARQUE: Ajouter l’amphotéricine à tous les MOM tout au long de la culture primaire initiale. Ajouter Y-27632 uniquement le jour du passage (jour 0) pour tous les passages.
    7. Changez le MOM les jours 3-4, puis tous les 2-3 jours par la suite jusqu’à ce qu’il soit prêt à passer.
    8. Du 7e au 10e jour, imagez les organoïdes et mesurez le taux de formation des organoïdes (OFR) en divisant le nombre d’organoïdes formés par le nombre de cellules initialement ensemencées.
      Exemples de calculs :
      figure-protocol-1
  4. Passage et cryoconservation des organoïdes œsophagiens murins (MEO) (temps considéré: <1,5 h)
    1. Décongeler et garder le BME sur la glace. Préchauffer le MOM, 0,05 % de trypsine et les IST à 37 °C dans un bain d’eau ou de billes avant utilisation. Préchauffer une plaque de culture cellulaire de 24 puits dans un incubateur à 37 °C.
    2. À l’aide d’une pointe de micropipette à large alésage, recueillir les organoïdes dans le dôme BME avec le surnageant. Perturbez le BME en pipetant de haut en bas.
      REMARQUE : Combinez les puits contenant des échantillons identiques dans un seul tube à microcentrifugation.
    3. Centrifuger brièvement pendant 10-15 s à 2 000 x g pour granuler les organoïdes. Retirez et jetez le surnageant.
    4. Délogez délicatement la pastille et remettez la pastille en suspension dans 500 μL de trypsine à 0,05 %.
    5. Incuber le(s) tube(s) dans un thermomélangeur à 37 °C et 800 tr/min pendant 10 min.
    6. Inactiver la trypsine avec 600 μL d’ITS.
    7. Centrifuger le tube à 300 x g pendant 5 min à 4 °C pour granuler les cellules.
    8. Retirez et jetez le surnageant. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans 100 μL de MOM. Effectuez un comptage automatisé des cellules par exclusion du bleu trypan.
      REMARQUE: Le volume peut être ajusté selon les besoins.
    9. Plaquer 2 000 à 5 000 cellules viables dans 75 % (v/v) BME/MOM avec un volume total de 50 μL par puits. Maximiser le nombre de puits plaqués et préparer suffisamment de cellules en BME pour un puits supplémentaire selon les exemples de calculs mentionnés précédemment.
      REMARQUE : Cryoconserver tout excès de cellules dans le milieu de cryoconservation (10 % de DMSO dans le FBS) à une concentration maximale de 1 x 106 cellules/mL. Conservez les cryovials dans un récipient congelé pendant la nuit à −80 °C. Transférez-les dans de l’azote liquide en phase vapeur pour un stockage à long terme.
    10. Dans un tube à microcentrifugation, préparer d’abord une dilution cellulaire appropriée dans MOM, puis ajouter le BME à l’aide d’une pointe de large alésage juste avant le placage.
    11. À l’aide d’une pointe de forage de 200 μL de large, ajouter lentement une gouttelette de 50 μL au centre du puits, en évitant le contact entre la pointe et le fond ou les côtés du puits. Veillez à ne pas utiliser trop de force pour expulser le liquide de la pointe, sinon le dôme s’aplatira.
    12. Incuber la plaque pendant 30 min dans un incubateur à 37 °C, 5% CO 2,95% HR.
    13. Ajouter délicatement 500 μL de MOM par puits complété par 10 μM Y-27632.
      REMARQUE: Ajouter Y-27632 uniquement le jour du passage (jour 0). Il n’est pas nécessaire de l’ajouter lors des changements de support. L’ajout d’amphotéricine B n’est plus nécessaire.
    14. Changez le MOM les jours 3-4, puis tous les 2-3 jours par la suite jusqu’à ce qu’il soit prêt à passer.
    15. Du 7e au 10e jour, imagez les organoïdes et mesurez l’OFR.
  5. Décongélation et récupération des organoïdes œsophagiens murins (MEO) (temps considéré: <1 h)
    1. Décongeler et garder le BME sur la glace. Préchauffer une plaque de culture cellulaire de 24 puits dans un incubateur à 37 °C.
    2. Préparer 10 mL de froid ou RT MOM ou PBS dans un tube conique de 15 mL.
    3. Décongeler un cryovial dans un bain-marie ou un bain de billes à 37 °C pendant environ 30 s à 1 min ou jusqu’à ce qu’il reste un petit granule de glace.
    4. À l’aide d’une pointe de pipette pré-mouillée, transférez lentement la suspension cellulaire dans le tube contenant MOM ou PBS de manière goutte à goutte.
    5. Centrifuger le tube pendant 300 x g et 4 °C pendant 5 min pour granuler les cellules.
    6. Retirez et jetez le surnageant. Resuspendre la pastille de cellule dans 100 μL de MOM; Ajustez le volume au besoin. Effectuez un comptage automatisé des cellules par exclusion du bleu trypan.
    7. Plaque 5 000-10 000 cellules viables dans 75% (v/v) BME/MOM avec un volume total de 50 μL par puits. Maximiser le nombre de puits plaqués et préparer suffisamment de cellules dans BME pour un puits supplémentaire selon les exemples de calculs mentionnés précédemment.
    8. Poursuivre les étapes restantes du protocole de passage et de cryoconservation des organoïdes de l’œsophage murin (MEO) (voir étape 2.4.11).

3. Préparation des organoïdes pour l’incorporation de paraffine (temps considéré: <1 h [plus 1,5 h pour la préparation du réactif])

  1. À l’aide d’une pointe de micropipette de grand calibre, prélever trois puits par tube de microcentrifugeuse. Collectez les organoïdes dans le dôme BME avec le surnageant. Perturbez le BME en pipetant de haut en bas.
  2. Centrifuger brièvement pendant 10-15 s à 2 000 x g pour granuler les organoïdes. Retirez et jetez le surnageant.
  3. Délogez délicatement la pastille et remettez la pastille en suspension dans 300 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 %.
  4. Fixer les organoïdes pendant une nuit à 4 °C.
  5. Centrifuger brièvement pendant 10-15 s à 2 000 x g pour granuler les organoïdes. Retirez et jetez autant de PFA que possible.
  6. Délogez délicatement la pastille et remettez la pastille en suspension dans 500 μL de PBS.
    REMARQUE: Les organoïdes fixes peuvent être conservés à 4 ° C jusqu’à 2 semaines avant de passer à l’étape suivante.
  7. Préparez un bouillon de 50 ml de gel d’agar (2 % de gélose plus 2,5 % de gélatine).
    NOTE: Préparez le stock de gel gélose à l’avance, en raison du temps d’incubation, puis effectuez le cycle d’autoclave.
    1. Remettez en suspension 1 g de bacto-agar et 1,25 g de gélatine dans 50 mL d’eau dans un bécher en verre autoclavable de 150 mL.
    2. Faites tourbillonner la suspension et laissez-la reposer pendant 30-60 minutes à RT.
    3. Autoclave de 20 min à 121 °C.
    4. Refroidir légèrement et distribuer 5 mL d’aliquotes dans des tubes coniques de 15 mL.
    5. Conserver jusqu’à 6 mois chez RT.
  8. Préparez une surface d’encastrement en inversant un support de tubes microcentrifugeuses et en recouvrant la surface d’une feuille de film d’étanchéité. Étiquette avec le(s) ID(s) organoïde(s) correspondant(s).
  9. Centrifuger le tube à 300 x g pendant 5 min pour enduire les organoïdes. Retirez et jetez le surnageant.
  10. Pendant ce temps, liquéfier le gel de gélose en plaçant un tube conique de 15 mL contenant le gel de gélose dans un bécher en verre de 150 mL contenant 100 ml d’eau et en utilisant au micro-ondes sur le réglage de puissance maximale pendant 1-2 minutes ou jusqu’à ce que l’eau commence à bouillir et que le gel de gélose soit à l’état liquide.
    ATTENTION : Desserrez le capuchon du tube conique contenant le gel de gélose avant de passer au micro-ondes.
  11. Immerger partiellement le tube de microcentrifugation contenant la pastille organoïde dans l’eau chaude sans introduire d’eau dans le tube de microcentrifugeuse.
  12. Recouvrir soigneusement la pastille organoïde en ajoutant 50 μL de gélose sur le côté du tube.
  13. Sans déranger la pastille (ne pas remettre en suspension, garder la pastille intacte), transférer la pastille dans la gouttelette de gel gélosé sur le film d’étanchéité sur la surface d’enrobage.
  14. Répétez les étapes 3.12 et 3.13 avec 50 μL supplémentaires de gélose liquide pour recueillir toute pastille organoïde restante et ajoutez-les délicatement à la même gouttelette de gel.
  15. Incuber la gouttelette contenant la pastille organoïde pendant 45 min à 4 °C.
  16. À l’aide d’une pince, transférer délicatement la gouttelette contenant la pastille organoïde dans une cassette de pathologie étiquetée.
  17. Conservez la cassette dans de l’éthanol à 70 % à 4 °C jusqu’à 1 mois.
  18. Procéder à l’incorporation de paraffine via un traitement histologique de routine pour préparer les blocs de paraffine.

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Résultats

Ce protocole décrit le processus de génération d’organoïdes œsophagiens murins (MEO) à partir de tissu œsophagien normal ou de tissu tumoral ESCC à partir de souris traitées par 4NQO selon un schéma thérapeutique spécifique consistant en 16 semaines de 4NQO administré dans l’eau potable, suivies d’une période d’observation de 10 semaines à 12 semaines (Figure 1). Les souris sont ensuite euthanasiées pour la dissection de la langue ou du tissu œsophagien (Figure 2

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Discussion

Il existe plusieurs étapes et considérations critiques pour la génération et l’analyse des opérateurs en économie de marché dans les protocoles décrits ici. Pour assurer la reproductibilité et la rigueur des expériences MEO, les réplications biologiques et techniques sont toutes deux importantes. Pour les réplications biologiques, deux à trois souris indépendantes portant de l’ESCC sont généralement suffisantes par condition expérimentale. Cependant, le nombre approprié de répétitions biologiques peut varier en fonction ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Nous remercions les ressources partagées (cytométrie en flux, pathologie moléculaire et microscopie confocale et spécialisée) du Herbert Irving Comprehensive Cancer Center de l’Université Columbia pour leur soutien technique. Nous remercions les Drs Alan Diehl, Adam J. Bass et Kwok-Kin Wong (NCI P01 Mechanisms of Esophageal Carcinogenesis) et les membres des laboratoires Rustgi et Nakagawa pour leurs discussions utiles. Cette étude a été soutenue par les subventions NIH suivantes: P01CA098101 (H.N. et A.K.R.), R01DK114436 (H.N.), R01AA026297 (H.N.), L30CA264714 (S.F.), DE031112-01 (F.M.H.), KL2TR001874 (F.M.H.),3R01CA255298-01S1 (J.G.), 2L30DK126621-02

(J.G.) R01CA266978 (C.L.), R01DK132251 (C.L.), R01DE031873 (C.L.), P30DK132710 (C.M. et H.N.) et P30CA013696 (A.K.R.). H.N. et C.L. sont récipiendaires du prix pilote multi-IP du Herbert Irving Comprehensive Cancer Center de l’Université Columbia. H.N. est récipiendaire du prix Fanconi Anemia Research Fund. F.M.H. est récipiendaire du prix de la Fondation Mark pour la recherche sur le cancer (20-60-51-MOME) et d’un prix de l’American Association for Cancer Research. J.G. est le récipiendaire du prix de l’American Gastroenterological Association (AGA).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,05 % trypsine-EDTAThermo Fisher Scientific25-300-120
0,25 % trypsine-EDTAThermo Fisher Scientific25-200-114
0,4 % Trypan BlueThermo Fisher ScientificT10282
Seringue à tuberculine 1 mL sans aiguilleBD309659
1,5 mL microtube à centrifugerThermo Fisher Scientific05-408-129
100 & micro ; crépine à cellules mThermo Fisher Scientific22363549
tubes coniques 15 mLThermo Fisher Scientific14-959-53A
200 µ ; Pointes de micropipette à alésage large LThermo Fisher Scientific212361A
Aiguilles 21 GBD305167
plaque à 24 puitsThermo Fisher Scientific12-556-006
4-Nitroquinoléine-1-oxyde (4NQO)Tokyo Chemical IndustryNO250
50 mL tubes coniquesThermo Fisher Scientific12-565-270
6 puits plaqueThermo Fisher Scientific12556004
70 & micro ; Filtre à cellules mThermo Fisher Scientific22363548
99,9 % éthylène propylène glycolSK picglobal
Advanced DMEM/F12Thermo Fisher Scientific12634028
Amphotéricine BGibco, Thermo Fisher Scientific15290018Concentration de stock 250 µ ; g/mL, concentration finale 0,5 & micro ; g/mL
Antibiotique-AntimycosiqueThermo Fisher Scientific15240062Concentration de stock 100x, concentration finale 1x
supplément de B-27Thermo Fisher Scientific17504044Concentration de stock 50x, concentration finale 1x
Gélose BactoBD214010
CO2 incubateur, par exemple Heracell 150iThermo Fisher Scientific51026406ou équivalent
Countess II FL Automated Cell CounterThermo Fisher ScientificAMQAX1000ou équivalent
CryovialsThermo Fisher Scientific03-337-7D
DietGel 76AClear H2O72-07-5022
Dimethyl sulfoxide (DMSO)MilliporeSigmaD4540
DispaseCorning354235Concentration de la matière 50 U/mL, concentration finale 2,5 &ndash ; 5 U/mL
Ciseaux de dissectionVWR25870-002
Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (PBS)Thermo Fisher Scientific14190250Concentration de stock 1x
sérum fœtal de veau (FBS)HyCloneSH30071.03
ForcepsVWR82027-386
Conteneur de congélationCorning432002ou équivalent
GélatineThermo Fisher ScientificG7-500
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061Concentration de stock 100x, concentration finale 1x
HEPESThermo Fisher Scientific15630080Concentration de stock 1 M, concentration finale 10 mM
Plaque chauffante/agitateurCorningPC-420Dou équivalent
Laboratoire Bain de billes d’armure (ou bain-marie)VWR89409-222ou équivalent
Balance de laboratoireOhaus71142841ou équivalent
Extrait de membrane basale Matrigel (BME)Corning354234
Microcentrifugeuse MinispinEppendorf22620100ou équivalent
Rack de tubes de microcentrifugationSouthern Labware0061
Supplément N-2Thermo Fisher Scientific17502048Concentration de stock 100x, concentration finale 1x
N-acétylcystéine (NAC)Sigma-AldrichA9165Concentration de stock 0,5 M, concentration finale 1 mM
Parafilm M wrapThermo Fisher ScientificS37440
Paraformaldéhyde (PFA)MilliporeSigma158127-500G
Cassette de pathologieThermo Fisher Scientific22-272416
Microscope à contraste de phaseNikonou équivalent Facteur de
croissance épidermique (mEGF) de souris recombinantePeprotech315-09-1mgConcentration de stock 500 ng/µ ; L, concentration finale 100 ng/mL
RN Milieu conditionné par cellules exprimant R-Spondin1 et Noggin (RN CM)N/AN/ADisponible sur demande par l’intermédiaire de la carotte de culture organoïde et cellulaire, concentration finale 2 %
Centrifugeuse Sorval ST 16RThermo Fisher Scientific75004380ou équivalent
Inhibiteur de trypsine de soja (IST)MilliporeSigmaT9128Concentration de stock 250 µ ; g/mL
ThermoMixer CThermo Fisher Scientific14-285-562 PMou équivalent
Y-27632Selleck ChemicalsS1049Concentration de stock 10 mM, concentration finale 10 µ ; L

Références

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