Culture à long terme de Caenorhabditis elegans individuelle sur milieu solide pour la surveillance longitudinale de la fluorescence et les interventions aversives

Luis Espejo; Bradford Hull; Leah M. Chang; Destiny DeNicola; Samuel Freitas; Vanessa Silbar; Anne Haskins; Emily A. Turner; George  L. Sutphin

doi:10.3791/64682

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Article de méthode

Culture à long terme de Caenorhabditis elegans individuelle sur milieu solide pour la surveillance longitudinale de la fluorescence et les interventions aversives

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DOI :

10.3791/64682

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2 décembre 2022

Luis Espejo^*¹ , Bradford Hull^*¹ , Leah M. Chang¹ , Destiny DeNicola¹ , Samuel Freitas¹ , Vanessa Silbar¹ , Anne Haskins¹ , Emily A. Turner¹ , George L. Sutphin¹

¹Department of Molecular & Cellular Biology, University of Arizona, Tucson

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole de culture de nématodes individuels isolés sur des milieux solides pour le suivi des paramètres physiologiques tout au long de la vie et la quantification de la fluorescence. Ce système de culture comprend une barrière d’acide palmitique autour des puits à ver unique pour empêcher les animaux de fuir, ce qui permet l’utilisation d’interventions aversives, y compris des bactéries pathogènes et des facteurs de stress chimiques.

Résumé

Caenorhabditis elegans est largement utilisé pour étudier la biologie du vieillissement. La pratique courante dans les études sur le vieillissement de C. elegans consiste à cultiver des groupes de vers sur des milieux de croissance de nématodes solides (NGM), ce qui permet la collecte efficace de données au niveau de la population pour la survie et d’autres phénotypes physiologiques, et l’échantillonnage périodique des sous-populations pour la quantification des biomarqueurs fluorescents. Les limites de cette approche sont l’incapacité (1) de suivre les vers individuels au fil du temps pour développer des trajectoires d’âge pour les phénotypes d’intérêt et (2) de surveiller les biomarqueurs fluorescents directement dans le contexte de l’environnement de culture. Les approches de culture alternatives utilisent la culture liquide ou la microfluidique pour surveiller les animaux individuels au fil du temps, dans certains cas, y compris la quantification de la fluorescence, avec le compromis que l’environnement de culture est contextuellement distinct du NGM solide. Le WorMotel est un dispositif multipuits microfabriqué décrit précédemment pour la culture de vers isolés sur NGM solide. Chaque ver est maintenu dans un puits contenant des NGM solides entouré d’un fossé rempli de sulfate de cuivre, un répulsif de contact pour C. elegans, permettant une surveillance longitudinale des animaux individuels. Nous trouvons que le sulfate de cuivre est insuffisant pour empêcher les vers de fuir lorsqu’ils sont soumis à des interventions aversives courantes dans la recherche sur le vieillissement, y compris la restriction alimentaire, les bactéries pathogènes et les agents chimiques qui induisent un stress cellulaire. Les dispositifs multipuits sont également moulés à partir de polydiméthylsiloxane, qui produit des artefacts de fond élevés en imagerie par fluorescence. Ce protocole décrit une nouvelle approche pour la culture de vers ronds isolés sur NGM solide à l’aide de microplateaux en polystyrène disponibles dans le commerce, conçus à l’origine pour le typage de l’antigène leucocytaire humain (HLA), permettant de mesurer la survie, les phénotypes physiologiques et la fluorescence tout au long de la vie. Une barrière d’acide palmitique empêche les vers de fuir, même en présence de conditions aversives. Chaque plaque peut cultiver jusqu’à 96 animaux et s’adapte facilement à une variété de conditions, y compris les restrictions alimentaires, l’ARNi et les additifs chimiques, et est compatible avec les systèmes automatisés de collecte de données sur la durée de vie et l’activité.

Introduction

C. elegans est un puissant organisme modèle pour la recherche en génétique, en biologie cellulaire et en biologie moléculaire, car ils sont facilement cultivés en laboratoire, ont une durée de vie et une durée de vie courtes, partagent un degré élevé d’homologie protéique avec les mammifères et ont une structure corporelle transparente qui permet la visualisation in vivo des protéines fluorescentes et des colorants¹. En raison de l’utilisation de longue date de C. elegans comme système modèle majeur dans divers domaines, y compris la biologie du développement et le vieillissement, leur croissance et leur développement....