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Article de méthode

Détermination des limites thermiques pour le zooplancton à l’aide d’un bloc thermique

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⸱

DOI :

10.3791/64762

⸱

18 novembre 2022

 ,  , 
1Biology Department, Swarthmore College

Dans cet article

Résumé

Le présent protocole illustre l’utilisation de composants disponibles dans le commerce pour générer un gradient thermique stable et linéaire. Un tel gradient peut ensuite être utilisé pour déterminer la limite thermique supérieure des organismes planctoniques, en particulier des larves d’invertébrés.

Résumé

Les limites thermiques et la largeur ont été largement utilisées pour prédire la répartition des espèces. Alors que la température mondiale continue d’augmenter, il est essentiel de comprendre comment la limite thermique change avec l’acclimatation et comment elle varie entre les stades de vie et les populations pour déterminer la vulnérabilité des espèces au réchauffement futur. La plupart des organismes marins ont des cycles de vie complexes qui comprennent les premiers stades planctoniques. Bien que la quantification de la limite thermique de ces petits stades de développement précoces (des dizaines à des centaines de microns) aide à identifier les goulots d’étranglement du développement, ce processus peut être difficile en raison de la petite taille des organismes cibles, de l’espace de banc et du coût de fabrication initial élevé. Ici, une configuration orientée vers de petits volumes (mL à des dizaines de mL) est présentée. Cette configuration combine des composants disponibles dans le commerce pour générer un gradient thermique stable et linéaire. Les spécifications de production de l’installation, ainsi que les procédures pour introduire et dénombrer les individus vivants par rapport aux individus morts et calculer la température létale, sont également présentées.

Introduction

La tolérance thermique est essentielle à la survie et au fonctionnement des organismes 1,2. Alors que la planète continue de se réchauffer en raison des émissions anthropiques de carbone, une attention croissante est accordée à la détermination et à l’application des limites thermiques3. Divers paramètres, tels que la mortalité, l’incapacité à se développer et la perte de mobilité, ont été utilisés pour déterminer les limites thermiques supérieure et inférieure4. Ces limites thermiques sont souvent considérées comme un indicateur de la niche thermique d’un organisme. Ces informations sont à leur tour utilisées pour identifier les espèces les plus vulnérables au réchauffement climatique, ainsi que pour prédire la répartition future des espèces et les interactions entre espèces qui en résultent 3,5,6,7. Cependant, la détermination des limites thermiques, en particulier pour les petits organismes planctoniques, peut être difficile.

Pour les organismes planctoniques, en particulier les stades larvaires des invertébrés marins, la limite thermique peut être déterminée par exposition chronique. L’exposition chronique est obtenue en élevant les larves à plusieurs températures pendant des jours ou des semaines et en déterminant la température à laquelle la survie des larves et/ou le taux de développement réduit 8,9,10. Cependant, cette approche prend beaucoup de temps et nécessite de grands incubateurs et de l’expérience dans l’élevage larvaire (voir la référence11 pour une bonne introduction à l’élevage de larves d’invertébrés marins).

Alternativement, l’exposition aiguë au stress thermique peut être utilisée pour déterminer les limites thermiques. Souvent, cette approche de détermination consiste à placer de petits flacons contenant des larves dans des bains secs à température contrôlée 12,13,14, à tirer parti des fonctions de gradient thermique dans les thermocycleurs PCR 15,16, ou à placer des flacons en verre / tubes microcentrifugeuses le long d’un gradient thermique généré par le chauffage et le refroidissement appliqués aux extrémités de grands blocs d’aluminium percés de trous dans lesquels les flacons s’adaptent parfaitement 17, 18,19. Les bains secs typiques génèrent une température unique; Par conséquent, plusieurs unités doivent être exploitées simultanément pour évaluer les performances dans une gamme de températures. Les thermocycleurs génèrent un gradient mais ne s’adaptent qu’à un petit volume d’échantillon (120 μL) et nécessitent des manipulations minutieuses. Semblables aux thermocycleurs, les gros blocs d’aluminium créent des gradients de température linéaires et stables. Les deux approches peuvent être couplées à une régression logistique ou probit pour calculer la température létale pour 50% de la population (LT50)12,20,21. Cependant, les blocs d’aluminium utilisés mesuraient ~100 cm de long; Cette taille nécessite un grand espace de laboratoire et l’accès à des fraiseuses spécialisées à commande numérique par ordinateur pour percer les trous. Avec l’utilisation de deux bains d’eau de qualité recherche pour maintenir la température cible, le coût financier de l’assemblage de l’installation est élevé.

Par conséquent, ce travail vise à développer un moyen alternatif de générer un gradient de température stable et linéaire avec des pièces disponibles dans le commerce. Un tel produit doit avoir un faible encombrement et devrait pouvoir être facilement utilisé pour des expériences d’exposition à des contraintes thermiques aiguës pour les organismes planctoniques. Ce protocole est développé avec du zooplancton d’une taille de <1 mm en tant qu’organismes cibles, et il a donc été optimisé pour l’utilisation d’un tube microcentrifuge de 1,5 ou 2 mL. Les organismes de plus grande taille nécessiteront des contenants plus grands que les tubes de microcentrifugation de 1,5 mL utilisés et des trous agrandis dans les blocs d’aluminium.

En plus de rendre l’appareil expérimental plus accessible, ce travail vise à simplifier le pipeline de traitement des données. Bien que les logiciels statistiques commerciaux fournissent des routines pour calculer LT50 en utilisant la régression logistique ou probit, le coût de licence n’est pas négligeable. Par conséquent, un script facile à utiliser qui repose sur le programme statistique open source R22 rendrait l’analyse des données plus accessible.

Ce protocole montre comment un bloc thermique compact peut être fabriqué avec des pièces disponibles dans le commerce et être appliqué à l’exposition du zooplancton (larves du Dendraster excentricus à un dollar des sables) à un stress thermique aigu pour déterminer leur limite thermique supérieure.

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Protocole

1. Fabrication du bloc thermique

  1. Branchez le bande-chauffe de 120 V et 100 W au rhéostat (voir le tableau des matériaux).
  2. Préparez le bloc d’aluminium de 20,3 cm x 15,2 cm x 5 cm (8 po x 5 po x 2 po) en perçant 60 trous dans une grille de 6 x 10 (voir le tableau des matériaux). Assurez-vous que les trous sont espacés de 2 cm d’un centre à l’autre dans les deux sens. Chacun doit avoir un diamètre de 1,1 cm et une profondeur de 4,2 cm (figure 1).
    REMARQUE: Effectuez le perçage sur une fraiseuse ou une perceuse avec des forets en acier rapide. L’élément chauffant et l’élément de refroidissement ont tous deux été choisis pour couvrir autant que possible la surface de contact des surfaces de 15,2 cm x 5 cm.
  3. Percez deux trous supplémentaires sur l’une des surfaces de 20,3 cm x 5 cm entre la 1re et la 2ecolonne et les 9eet 10e colonnes, en fonction de la taille des sondes du régulateur de température (voir le tableau des matériaux).
  4. Construisez un boîtier à partir de feuilles d’acrylique transparent de 1,2 cm (0,5 po) (voir le tableau des matériaux) pour maintenir les éléments en place et isoler le bloc chauffant terminé. Utilisez deux couches d’acrylique pour isoler la face arrière de l’élément chauffant (Figure 1).
  5. Dans l’assemblage final, appliquez de la pâte thermique (voir le tableau des matériaux) pour maximiser la conductance thermique de l’élément chauffant dans le bloc et du bloc à l’élément de refroidissement.

2. Détermination des réglages du gradient thermique

  1. Connectez le bain-marie / refroidisseur d’aquarium avec le tube Tygon (voir le tableau des matériaux). Isolez le tube avec de l’isolant de tuyau en mousse au besoin.
  2. Insérez la sonde du thermostat dans les trous situés sur le côté du bloc d’aluminium. Assurez-vous que la sonde 1 est positionnée près de l’élément chauffant.
  3. Placer les tubes de microcentrifugation remplis à ras bord (1,5 mL) d’eau du robinet dans tous les trous broyés (60 tubes au total).
  4. Allumez le régulateur de température et réglez la température d’arrêt du chauffage de la sonde 1 à 35-37 °C et de la sonde 2 à 21,5-22,5 °C.
    REMARQUE : Le thermostat proposé comporte deux prises qui fonctionnent indépendamment; Seule la sonde 1 est utilisée pour réguler la température chaude dans ce cas d’utilisation particulier. Par conséquent, réglez la température de la sonde 2 sur celle de la température basse.
  5. Faites pivoter le rhéostat pour allumer l’élément chauffant et réglez-le à moyen.
  6. Allumez le bain-marie/refroidisseur d’aquarium et réglez la température du refroidisseur à 15 °C.
  7. Vérifiez que le bloc est chaud à une extrémité et refroidi à l’autre après 10 min.
    ATTENTION : Les extrémités exposées de l’élément chauffant peuvent être chaudes ; Ne les touchez pas.
  8. Vérifiez la température à l’intérieur de chaque tube de microcentrifugation à l’aide d’un thermocouple avec une électrode de type K (voir le tableau des matériaux) toutes les 10 minutes par la suite. La température se stabilisera après ~60 min et apparaîtra linéaire (Figure 2).
  9. Ajustez les valeurs des points de terminaison en modifiant les paramètres du régulateur de température et du bain-marie selon vos besoins.

3. Exposition thermique et dénombrement vivant:mort

REMARQUE: L’étape 2 peut être omise une fois que les paramètres souhaités pour le gradient de température sont déterminés.

  1. Allumez le bain-marie et le chauffe-eau à recirculation et réglez-les à 15 °C et 37 °C, respectivement, pour générer un gradient de température de 19,5 °C à 37 °C.
  2. Pour s’assurer que le gradient thermique est linéaire, placer les tubes de microcentrifugation remplis à ras bord (1,5 mL) d’eau du robinet dans tous les trous broyés (60 tubes au total).
  3. Laissez le bloc de chaleur atteindre la température réglée en attendant 45-60 min. Vérifiez la température à l’intérieur de chaque tube de microcentrifugeuse à l’aide d’un thermocouple avec une électrode de type K pour voir si elle a atteint la température attendue. Notez ces températures.
  4. Si les organismes à l’étude mesurent > 500 μm et peuvent être facilement transférés d’un contenant à un autre (p. ex. un copépode), remplir un tube à microcentrifugeuses de 1,5 mL avec 750 μL d’eau de mer filtrée de 0,45 μm. Sinon, si les organismes à l’étude sont petits, remplissez un tube de microcentrifugation de 1,5 mL avec 250 μL d’eau de mer filtrée de 0,45 μm.
    REMARQUE : Pour les données représentatives, les larves des dendrasters excentriques du dollar des sables, qui sont 2, 4 et 6 jours après la fécondation, ont été utilisées (voir le tableau des matériaux). La taille moyenne (± D.D., n = 15 pour chaque âge) de ces individus était de 152 ± 7 μm, 260 ± 17 μm et 292 ± 14 μm, respectivement. Étant donné que ces larves peuvent être facilement concentrées (étape 3.5), les tubes de microcentrifugeuses ont été remplis de 750 μL d’eau de mer filtrée.
  5. Concentrer la culture des organismes de l’étude avec filtration inversée (c.-à-d. placer la maille dans le récipient contenant les organismes à l’étude et éliminer l’eau par le haut de la maille), de sorte que les organismes à l’étude restent dans le fond du bécher11.
    REMARQUE : Un treillis de nylon de 30 μm a été utilisé pour les larves de sable étudiées (voir le tableau des matériaux).
  6. Rincer l’échantillon animal concentré avec de l’eau de mer filtrée (p. ex., lors de la culture avec des aliments à base d’algues ou d’autres produits chimiques). Répétez la filtration inverse une fois de plus pour concentrer l’échantillon animal.
  7. Placez un nombre connu d’organismes individuels dans les tubes microcentrifugés à moitié remplis. Compter les petits organismes planctoniques au microscope à dissection (voir Tableau des matériaux) et les transférer avec des pipettes Pasteur en verre.
    NOTE: Le nombre d’organismes à placer dépend de la taille; Pour les larves de sable de ~200 μm, 20 individus par tube de microcentrifugeuse étaient appropriés.
    ATTENTION: Les pipettes en verre sont plus souhaitables que les pipettes en plastique car certains organismes planctoniques sont hydrophobes et collent aux surfaces en plastique.
  8. Ajouter 0,45 μm d’eau de mer filtrée dans les tubes microcentrifugeuses contenant des animaux jusqu’à ce que le volume final soit de 1 mL.
  9. Pour permettre aux organismes de se réchauffer progressivement à la température expérimentale souhaitée, placer les tubes de microcentrifugation avec les animaux, préparés à l’étape 3.7, dans le bloc thermique en partant de l’extrémité froide. Placer des paires de tubes microcentrifugeuses sur chaque rangée (12 tubes au total).
  10. Attendez 10 min.
  11. Déplacer les paires de tubes microcentrifugeuses insérées à l’étape 3.9 vers les trous percés adjacents à des températures plus chaudes. Placez des paires supplémentaires de tubes microcentrifugeuses dans chaque rangée à l’extrémité froide. Chaque rangée aura désormais quatre tubes. Attendez encore 10 minutes.
  12. Continuez à ajouter des tubes microcentrifugeuses avec les animaux en déplaçant leurs positions de l’extrémité la plus froide à l’extrémité plus chaude par paires. Attendez 10 minutes entre chaque quart de travail jusqu’à ce que le bloc de chaleur soit complètement rempli.
    REMARQUE : Les étapes 3.9 à 3.12 sont considérées comme une phase d’accélération visant à augmenter graduellement la température ressentie par les organismes de l’étude.
  13. Laissez les animaux incuber à la température désignée pendant 2 h. Cette étape est la phase d’exposition à température constante de l’expérience.
    1. Vérifiez la température des tubes microcentrifugeuses avec un thermocouple toutes les heures si la période d’incubation dépasse 2 h.
      REMARQUE: Ajustez le temps d’incubation en fonction des besoins expérimentaux. Si l’incubation dure plus de 2 h, vérifier la température des tubes à intervalles réguliers avec un thermocouple en cas de défaillance imprévue de l’équipement. Pour minimiser les perturbations pour les organismes à l’étude, placez au hasard six tubes de microcentrifugation ou plus remplis uniquement d’eau de mer filtrée dans le bloc pour la surveillance de la température.
  14. À la fin de la période d’incubation, mesurer la température à l’intérieur de chaque tube de microcentrifugeuse à l’aide d’un thermocouple avec une électrode de type K. Notez ces températures.
  15. Retirez les 60 tubes de microcentrifugation contenant des animaux et placez-les dans des supports pré-étiquetés.
  16. Incuber les tubes (étape 3.14) à la température prédéterminée, telle que la température d’élevage, pendant 1 h, qui est la période de récupération.
    REMARQUE : La période de rétablissement peut être propre à l’espèce. Pour le dollar de sable larvaire, la température d’élevage était de 18 °C, et l’échantillon a donc été placé dans une chambre environnementale. Consulter la documentation pertinente et/ou mener une expérience d’essai pour s’assurer que le nombre de morts vivants n’a pas été affecté par la durée de la période de récupération. Dans les données représentatives, le nombre d’animaux vivants après 1 h était le même qu’après 12 ou 24 h de récupération.
  17. Pour énumérer la proportion de l’organisme à l’étude qui est vivant après l’exposition thermique, transférer le contenu d’un tube microcentrifuge individuel sur une boîte de Petri de 35 mm à l’aide d’une pipette en verre.
  18. Observez et notez le nombre relatif d’individus qui sont encore actifs (vivants) et ceux qui ont saisi la nage ou dissous (morts) au microscope à dissection. S’assurer que le nombre total de personnes observées est égal au nombre de personnes placées dans les tubes à l’étape 3.7. Vérifiez le côté des tubes microcentrifugeux et de la boîte de Petri pour les individus si les chiffres ne correspondent pas.

4. Calcul de LT50

  1. Générez un tableau de données au format CSV avec au moins les en-têtes suivants : variable de regroupement d’intérêt, température du tube en °C, nombre d’individus vivants et nombre d’individus morts.
    NOTE : Pour les données représentatives, la variable de regroupement d’intérêt est remplacée par l’âge puisque l’objectif est de comparer entre les groupes d’âge.
  2. Pour adapter les données à la régression logistique, utilisez un modèle linéaire généralisé avec une distribution binomiale. Le fichier de codage supplémentaire 1 montre un exemple de script utilisant le logiciel open source R22.
  3. Pour déterminer la limite thermique supérieure médiane (LT 50), calculez la valeur prédictive (c.-à-d. la température) à laquelle50 % des individus ont survécu. Le fichier de codage supplémentaire 2 montre un exemple de script utilisant la fonction dose.p du MASS23 dans R22.

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Résultats

Le but de ce protocole est de déterminer la limite thermique supérieure du zooplancton. Pour ce faire, un gradient thermique stable et linéaire est nécessaire. La configuration proposée a pu générer un gradient thermique allant de 14 °C à 40 °C en réglant la température du bain-marie à 8 °C et le chauffage à 39 °C (figure 2A). Le gradient de température peut être réduit et décalé en modifiant les valeurs finales. Un gradient thermique avec une plage plus étroite (19 °C à 37 °C) a également é...

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Discussion

Ce protocole fournit une approche accessible et personnalisable pour déterminer les limites thermiques des petits organismes planctoniques lors d’une exposition thermique aiguë. La conception à 10 trous et les paramètres de température flexibles, contrôlés par le bain-marie à l’extrémité inférieure et le chauffage à l’extrémité supérieure, permettent de déterminer LT50 avec précision. En utilisant cette approche, une différence dans la limite thermique de <1 °C a pu être détectée (Figure 3...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Ce travail est soutenu par le Faculty Research Fund du Swarthmore College [KC] et la bourse de recherche d’été Robert Reynolds et Lucinda Lewis '70 pour BJ.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,45 et micro ; m filtre à membraneVWR74300-042
½ ; ” Feuille acryliqueMcMaster-Carr8560K266Utilisée pour construire un boîtier strié avec une isolation suffisante.
Seringue de 1 mLVWR76290-420
2 canaux 7 types de thermocouples Enregistreur de donnéesOmega EngineeringHH506APeut être remplacé par n’importe quel thermomètre pouvant s’insérer dans un tube de microcentrifugation
Pipette automatique  ;Ranin  ;
Bande chauffante à montage par boulon et pince
avec gaine en acier inoxydable 430, 120V AC, 1-1/2" de large, 100W		McMaster-Carr3619K32
Crystal Sea Bioassay MixPentairCM2BÀ utiliser pour faire de l’eau de mer aritifice  ;
Denraster excentricusM-Rep  ;Dollars des sables de Californie
Microscope de dissection  ;Nikon·s ;SMZ645
DIYhz Bloc de refroidissement par eau en aluminium, refroidisseur d’eau liquide Système de dissipateur de chaleur pour ordinateur PC CPU Graphique Radiateur Dissipateur thermique Tête endothermique Argent (40 mm x 120 mm x 12 mm)AmazonSe connecte au bain-marie et utilisé pour refroidir une extrémité du bloc.
Feuille d’aluminium moulée MIC6 facile à usiner 2 » d’épaisseur 8 » x 8"  ;McMaster-Carr86825K953Ariné à 2 po x 6 po x 8 po avec 60 trous également espacés (11 mm de diamètre, 42 mm de profondeur) avec deux trous d’ajout percés d’un côté pour les sondes de thermostat.
Isolation économique en mousse de polyéthylène flexibleMcMaster-Carr4530K121Couvre le tube en plastique entre le refroidisseur et le bloc pour réduire les pertes de chaleur. Peut être omis si la plage de température est proche de la température ambiante  ;
EVERSECU 72w 110-240v Refroidisseur d’eau d’aquarium Réchauffeur/refroidisseur Contrôleur de température pour poissons Crevettes Réservoir de récif corallien marin Réservoir inférieur à 20 L/30 L Refroidisseur d’aquariumAmazonPeut être utilisé à la place du bain-marie de laboratoire  ;
Exemple avec des larves de dollar des sables  ;
GENNEL 100 g Pâte de graisse de composé thermoconducteur de silicone argenté pour GPU CPU IC Fours LED RefroidissementAmazonAméliore la conductance thermique entre le bloc et les éléments chauffants et de refroidissement.
Inkbird WiFi Thermostat Reptile Contrôleur de température avec 2 sondes et 2 prises, IPT-2CH Thermostat pour tapis chauffant pour reptiles (Max 250 W par prise)Amazonsurveille les extrémités chaudes et froides. Maintient la tête chauffante dans la gamme
Lauda Ecoline Silver Circulateurs réfrigérés refroidis à l’airVWR89202-386Peut être remplacé par un refroidisseur d’aquarium.
Tubes de microcentrifugationVWR76019-014Si des animaux plus grands sont utilisés, les flacons de scanilation (VWR 66022-004) sont une bonne alternative.
Filtre à mailles Nitex  ; FaitUtilisé de la colle chaude pour fixer le treillis Nitex à un tube en PVC de 1/2 "  ;
Pipette PasteurVWR14673-010
Chlorure de potassium (0,35 m)  ;Logiciel statistique Millpore-SigmaP3911-500G
R.  ;Le projet R pour le calcul statistique Aiguille
de seringueVWR89219-346Selon la taille de l’organisme cible, les gagues 14 et 16 peuvent être utilisées
Tygon Tubing  ;McMaster-Carr5233K65Ajuster pour correspondre au refroidisseur et au bloc utilisés.
Zoo Med Repti Temp RheostatChewy.comévalué à 150 W et recâblé pour alimenter directement l’élément chauffant. Utilisé pour contrôler le taux de production de chaleur
maison

Références

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