Article de méthode

Interrogation par appariement spécifique à la cellule de l’épigénome ovarien et du transcriptome de la souris

DOI :

10.3791/64765

⸱

24 février 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Aging and Metabolism Research Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 2Genes & Human Disease Research Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 3Oklahoma City Veterans Affairs Medical Center, 4Nutrition College, Federal University of Pelotas

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans ce protocole, la méthode de purification par affinité des ribosomes de traduction (TRAP) et la méthode d’isolement des noyaux marqués dans des types cellulaires spécifiques (INTACT) ont été optimisées pour l’interrogation par appariement du transcriptome ovarien et de l’épigénome spécifiques à la cellule à l’aide du modèle murin NuTRAP croisé vers une lignée de souris Cyp17a1-Cre.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’évaluation des changements épigénomiques et transcriptomiques spécifiques au type cellulaire est essentielle pour comprendre le vieillissement ovarien. À cette fin, l’optimisation de la méthode de purification par affinité des ribosomes de traduction (TRAP) et l’isolement des noyaux marqués dans des types cellulaires spécifiques (INTACT) ont été réalisées pour l’interrogation ultérieure par appariement du transcriptome ovarien et de l’épigénome spécifiques à la cellule à l’aide d’un nouveau modèle murin NuTRAP transgénique. L’expression de l’allèle NuTRAP est sous le contrôle d’une cassette STOP floxed et peut être ciblée sur des types spécifiques de cellules ovariennes à l’aide de lignées Cre spécifiques au promoteur. Étant donné que des études récentes ont impliqué les cellules stromales ovariennes dans la conduite des phénotypes de vieillissement prématuré, le système d’expression NuTRAP a ciblé les cellules stromales à l’aide d’un pilote Cyp17a1-Cre. L’induction de la construction NuTRAP était spécifique aux fibroblastes stromaux ovariens, et suffisamment d’ADN et d’ARN pour les études de séquençage ont été obtenus à partir d’un seul ovaire. Le modèle NuTRAP et les méthodes présentées ici peuvent être utilisés pour étudier n’importe quel type de cellule ovarienne avec une lignée Cre disponible.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les ovaires sont des acteurs majeurs du vieillissement somatique1, avec des contributions distinctes de populations cellulaires spécifiques. L’hétérogénéité cellulaire de l’ovaire rend difficile l’interprétation des résultats moléculaires des tests en vrac sur des ovaires entiers. Comprendre le rôle de populations cellulaires spécifiques dans le vieillissement ovarien est essentiel pour identifier les facteurs moléculaires responsables du déclin de la fertilité et de la santé chez les femmes âgées. Traditionnellement, l’évaluation multi-omique de types spécifiques de cellules ovariennes était réalisée par des techniques telles que la microdissection laser2, les approches unicellulaires3 ou le tri cellulaire4. Cependant, la microdissection peut être coûteuse et difficile à réaliser, et le tri cellulaire peut modifier les profils phénotypiquescellulaires 5.

Une nouvelle approche pour évaluer les profils épigénomiques et transcriptomiques spécifiques au type de cellules ovariennes utilise le modèle murin NuTRAP (Nuclear Tagging and Translating Ribosome Affinity Purity). Le modèle NuTRAP permet d’isoler des acides nucléiques spécifiques au type cellulaire sans avoir besoin de trier les cellules en utilisant les méthodes de purification par affinité : purification d’affinité des ribosomes de traduction (TRAP) et isolement des noyaux marqués dans des types cellulaires spécifiques (INTACT)6. L’expression de l’allèle NuTRAP est sous le contrôle d’une cassette STOP floxed et peut être ciblée sur des types spécifiques de cellules ovariennes à l’aide de lignées Cre spécifiques au promoteur. En croisant la souris NuTRAP avec une lignée Cre spécifique au type cellulaire, le retrait de la cassette STOP provoque le marquage eGFP du complexe ribosomique et le marquage biotine/mCherry du noyau d’une manière Cre-dépendante6. Les techniques TRAP et INTACT peuvent ensuite être utilisées pour isoler l’ARNm et l’ADN nucléaire du type cellulaire d’intérêt et procéder à des analyses transcriptomiques et épigénomiques.

Le modèle NuTRAP a été utilisé dans différents tissus, tels que le tissu adipeux6, le tissu cérébral 7,8,9 et la rétine10, pour révéler des changements épigénomiques et transcriptomiques spécifiques au type cellulaire qui peuvent ne pas être détectés dans l’homogénat de tissu entier. Les avantages de l’approche NuTRAP par rapport aux techniques traditionnelles de tri cellulaire comprennent : 1) la prévention des artefacts d’activation ex vivo 8, 2) le besoin réduit d’équipement spécialisé (c.-à-d. trieurs de cellules) et 3) l’augmentation du débit et la diminution du coût des analyses spécifiques au type de cellule. En outre, la capacité d’isoler l’ADN et l’ARN spécifiques au type cellulaire d’une seule souris permet des analyses appariées qui augmentent la puissance statistique. Étant donné que des études récentes ont impliqué les cellules stromales ovariennes dans la conduite prématurée des phénotypes de vieillissement 11,12,13, nous avons ciblé le système d’expression NuTRAP sur les cellules stromales et thèques à l’aide d’un pilote Cyp17a1-Cre. Ici, nous démontrons que l’induction de la construction NuTRAP est spécifique aux cellules stromales ovariennes et thèques, et que suffisamment d’ADN et d’ARN pour les études de séquençage sont obtenus à partir d’un seul ovaire. Le modèle NuTRAP et les méthodes présentées ici peuvent être utilisés pour étudier n’importe quel type de cellule ovarienne avec n’importe quelle lignée Cre disponible.

Pour la génération d’une lignée de souris NuTRAP ovarienne spécifique au type cellulaire, l’allèle NuTRAP (Nuclear Tagging and Translating Ribosome Affinity Purity) a un codon STOP floxed qui contrôle l’expression de BirA, du peptide de reconnaissance de la biotine ligase (BLRP) marqué mCherry/mRANGAP1 et eGFP/L10a. Lorsqu’elle est croisée avec une lignée Cre spécifique au type cellulaire, l’expression de la cassette NuTRAP marque la protéine nucléaire mRANGAP1 avec de la biotine/mCherry et la protéine ribosomique L10a avec eGFP d’une manière Cre-dépendante. Cela permet d’isoler les noyaux et les ARNm de types cellulaires spécifiques sans avoir besoin de tri cellulaire. Le flox/flox NuTRAP peut être jumelé à un Cre spécifique au type cellulaire pertinent pour les types de cellules ovariennes pour évaluer cela.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toutes les procédures relatives aux animaux ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Oklahoma Medical Research Foundation (OMRF). Les souris mères ont été achetées au Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) et élevées et logées dans des conditions SPF dans un environnement de barrière HEPA sur un cycle lumière/obscurité de 14 h / 10 h (lumières allumées à 6h00) à l’OMRF.

NOTE: Dans cette démonstration, nous utilisons un Cyp17iCre+/−(Strain # 028547, The Jackson Laboratory) mâle jumelé à une femelle NuTRAP (Strain # 029899, The Jackson Laboratory). La descendance Cyp17-NuTRAP souhaitée (Cyp17iCre+/−; NuTRAPflox/WT) exprimera l’allèle NuTRAP sous le contrôle du promoteur Cyp17a1 dans les cellules stromales ovariennes. Pour cette préparation manuscrite, nous avons utilisé des souris Cyp17-NuTRAP femelles âgées de 4 mois (n = 4). L’ADN a été extrait d’échantillons de poinçons d’oreille de souris pour le génotypage afin de confirmer l’hérédité des transgènes Cyp17iCre et NuTRAP et pour la détection par PCR de 1) Cre générique, 2) Cyp17iCre et 3) NuTRAP floxed en utilisant les amorces énumérées dans le tableau des matériaux, comme décrit précédemment 7,8.

1. Dissection ovarienne de souris

  1. Effectuer l’euthanasie des souris conformément aux directives de soins aux animaux et à l’approbation de l’établissement, suivie d’un prélèvement ovarien.
  2. Disséquer les ovaires pour enlever tout tissu adipeux ou partie des oviductes qui pourraient être attachés au tissu ovarien avant de placer les ovaires dans des tubes avec tampon. Passez immédiatement aux techniques TRAP ou INTACT.
    REMARQUE : Ce protocole n’a pas été optimisé pour une utilisation avec des tissus congelés. L’utilisation d’un ovaire de la même souris pour chaque technique est recommandée pour les analyses statistiques futures.

2. Isolement des noyaux de types spécifiques de cellules ovariennes

  1. Préparation du tampon
    1. Tampon d’épuration nucléaire (NPB) : Pour préparer 100 mL de NPB, combiner 2 mL de 1 M HEPES (concentration finale : 20 mM HEPES), 0,8 mL de 5 M NaCl (40 mM NaCl), 4,5 mL de 2 M KCl (90 mM KCl), 0,4 mL de 0,5 M EDTA (2 mM EDTA), 0,1 mL de 0,5 M EGTA (0,5 mM EGTA), et 92,2 mL d’eau exempte de nucléases. Complétez avec 1x inhibiteur de protéase le jour de l’isolement des noyaux.
      REMARQUE: NPB peut être préparé sans l’inhibiteur de la protéase à l’avance et dure jusqu’à 3 semaines à 4 ° C.
    2. Tampon de lyse des noyaux (complet): Compléter le tampon de lyse des noyaux avec 1x inhibiteur de protéase le jour de l’isolement des noyaux.
  2. Création de la suspension de noyaux
    REMARQUE : Les échantillons doivent être conservés sur la glace en tout temps, sauf indication contraire.
    1. Prélever un ovaire d’une souris Cyp17-NuTRAP (ou d’un autre Cre-NuTRAP pertinent) dans 500 μL de tampon de lyse des noyaux (complet). Hachez l’ovaire en huit parties dans le tampon à l’aide de micro-ciseaux à ouverture automatique.
    2. Utilisez des embouts de pipette de grand calibre pour transférer l’ovaire émincé et 500 μL de tampon de lyse dans un homogénéisateur Dounce en verre sur glace. Homogénéiser l’ovaire 10x-20x avec le pilon lâche A. Ajouter 400 μL de tampon de lyse à l’homogénéisateur Dounce, en lavant le pilon A.
    3. Homogénéiser l’ovaire avec le pilon serré B 10x-20x. Ajouter 1 000 μL de tampon de lyse en lavant le pilon B. Transférer l’homogénat (1,9 mL) dans un tube à fond rond de 2 mL.
    4. Centrifuger à 200 x g pendant 1,5 min à 4 °C pour éliminer les tissus et les vaisseaux sanguins non dissociés14. Le surnageant contient les noyaux; jeter la pastille de tissu non dissocié.
    5. Après pré-mouillage d’une crépine cellulaire de 30 μm avec 100 μL de tampon de lyse, filtrer le surnageant à travers la crépine cellulaire dans un tube conique de 15 mL. Ensuite, transférer le mélange contenant des noyaux dans un tube à fond rond de 2 mL.
    6. Centrifuger l’échantillon à 500 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant. La pastille contient des noyaux.
    7. Resuspendre la pastille nucléaire dans 250 μL de tampon de lyse glacée en tourbillonnant brièvement à vitesse modérée à élevée. Porter le volume à 1,75 mL en ajoutant 1,5 mL de tampon de lyse. Mélanger délicatement et reposer la suspension nucléaire sur la glace pendant 5 min.
    8. Enduire les noyaux par centrifugation à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Jetez soigneusement le surnageant sans déranger la pastille nucléaire. Remettez la pastille en suspension dans 200 μL de tampon de stockage glacé et vortex brièvement pour remettre complètement en suspension la pastille nucléaire.
    9. Réserver 10 % de la pastille remise en suspension (20 μL) comme échantillon de noyaux d’entrée pour les analyses en aval.
    10. Prenez la pastille de noyaux en suspension et portez le volume à 2,0 mL avec de la NPB glacée. Procéder à l’isolement des noyaux marqués à l’aide de la méthode de purification basée sur l’affinité INTACT.
  3. Isolement de noyaux marqués dans des types cellulaires spécifiques (INTACT)
    1. Vortex les billes de streptavidine dans le flacon pendant 30 s à vitesse moyenne pour s’assurer qu’elles sont complètement remises en suspension. Ajouter 30 μL de billes en suspension pour chaque échantillon dans un tube à fond rond de 2 mL (les billes pour un maximum de 10 échantillons peuvent être lavées dans un seul tube), ajouter 1 mL de NPB et bien remettre en suspension par pipetage.
    2. Placez le tube sur le support magnétique pendant 1 min pour séparer les perles. Jetez le surnageant et retirez le tube de l’aimant. Remettez en suspension les billes magnétiques lavées dans 1 mL de NPB.
    3. Répétez l’étape de lavage pour un total de trois lavages. Après le lavage final, remettre les billes en suspension dans le volume initial de NPB (30 μL par échantillon).
    4. Ajouter 30 μL des billes lavées à la suspension nucléaire de 2 mL à l’étape 2.2.10. Bien remettre en suspension le mélange bille-noyaux en pipetant et en retournant doucement le tube.
    5. Placez les tubes sur un mélangeur rotatif dans une chambre froide ou un réfrigérateur pendant 30 min à basse vitesse. Incuber les échantillons d’entrée sans billes dans les mêmes conditions.
    6. Placez les tubes avec la suspension nucléaire et les perles sur l’aimant et séparez les noyaux biotinylés liés aux billes de streptavidine (fraction positive) de la fraction négative des noyaux. Laissez les perles se séparer sur l’aimant pendant 3 min.
    7. Retirer le surnageant, passer la fraction négative dans un tube frais de 2,0 ml et réserver sur de la glace. Pour chaque tube à fraction positive, retirez le tube de l’aimant et remettez en suspension le contenu dans 1 mL de NPB.
    8. Placez le tube sur l’aimant pendant 1 min et jetez le surnageant. Retirez le tube de l’aimant et remettez en suspension le mélange bille et noyaux lavés dans 1 mL de NPB.
    9. Répétez l’étape 2.3.8 pour un total de trois lavages. Après trois lavages, remettre en suspension le mélange corde-noyaux de fraction positive dans 30 μL de NPB.
    10. Pour chaque tube à fraction négative, centrifuger la suspension nucléaire de l’étape 2.3.7 à 500 x g pendant 7 min à 4 °C. Aspirer soigneusement et jeter le surnageant. Resuspendre la pastille de noyaux de fraction négative dans 30 μL de NPB.
    11. Conservez les noyaux de l’entrée (étape 2.2.9), de la fraction négative (étape 2.3.10) et de la fraction positive (étape 2.3.9) dans un congélateur à -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour l’isolement de l’ADN nucléaire ou de l’ARN.
      REMARQUE : Les noyaux ne doivent pas être congelés pour les protocoles exigeant des noyaux intacts en entrée (c.-à-d. dosage de la chromatine accessible à la transposase, immunoprécipitation de la chromatine).

3. Isolement de l’ARNm à partir de types spécifiques de cellules ovariennes

  1. Préparation des tampons
    1. Base tampon TRAP : Préparer 100 mL de base tampon TRAP en combinant 78,8 mL d’eau exempte de RNase, 5 mL de 1 M de Tris-HCl (concentration finale : 50 mM de Tris [pH 7,5]), 5 mL de 2 M KCl (100 mM KCl), 1,2 mL de 1 M MgCl 2 (12 mM MgCl2) et 10 mL de NP-40 à 10 % (1 % NP-40). Conserver à 4 °C jusqu’à 1 mois.
    2. Base tampon à haute teneur en sel : Préparer 100 mL de base tampon à haute teneur en sel en combinant 68,8 mL d’eau exempte de RNase, 5 mL de 1 M de Tris-HCl (concentration finale : 50 mM de Tris [pH 7,5]), 15 mL de 2 M KCl (300 mM KCl), 1,2 mL de 1M MgCl 2 (12 mM MgCl2) et 10 mL de NP-40 à 10 % (1 % NP-40). Conserver à 4 °C jusqu’à 1 mois.
    3. Tampon d’homogénéisation TRAP (complet) : Préparer 1,5 mL par échantillon le jour du prélèvement de tissu. Préparer 10 mL de tampon d’homogénéisation TRAP en combinant 10 mL de base tampon TRAP (à partir de l’étape 3.1.1) avec 10 μL de cycloheximide à 100 mg/mL (concentration finale : 100 μg/mL de cycloheximide), 10 mg d’héparine de sodium (1 mg/mL d’héparine sodique), 20 μL de DTT 0,5 M (1 mM de DTT), 50 μL d’inhibiteur de la RNase 40 U/μL (inhibiteur de la RNase 200 U/mL), 200 μL de spermidine 0,1 M (2 mM de spermidine) et un comprimé d’inhibiteur de protéase sans EDTA (1x).
    4. Tampon de lavage à faible teneur en sel (complet) : Faire 1,5 mL par échantillon le jour du prélèvement de tissu. Pour obtenir 10 mL de tampon de lavage à faible teneur en sel, combiner 10 mL de base tampon TRAP (à partir de l’étape 3.1.1) avec 10 μL de cycloheximide à 100 mg/mL (100 μg/mL de cycloheximide) et 20 μL de DTT 0,5 M (1 mM de DTT).
    5. Tampon de lavage au sel élevé (complet) : Faire 1,5 mL par échantillon le deuxième jour d’isolement TRAP. Pour obtenir 10 mL de tampon de lavage à haute teneur en sel, combiner 10 mL de base tampon à haute teneur en sel (à partir de l’étape 3.1.2) avec 10 μL de cycloheximide à 100 mg/mL et 20 μL de DTT 0,5 M.
  2. Réalisation de la purification de l’affinité des ribosomes de traduction (TRAP)
    1. Prélever l’autre ovaire d’une souris Cyp17-NuTRAP (ou d’un autre Cre-NuTRAP pertinent) et le placer dans un tube sans RNase de 1,5 mL contenant 100 μL de tampon d’homogénéisation TRAP glacé (à partir de l’étape 3.1.3). Hachez l’ovaire en huit parties dans le tampon à l’aide de micro-ciseaux à ouverture automatique.
    2. Utilisez des embouts de grand calibre pour transférer l’ovaire et 100 μL de tampon d’homogénéisation dans un homogénéisateur Dounce en verre. Homogénéiser 10x-20x avec le pilon lâche A. Ajouter 400 μL de tampon d’homogénéisation TRAP, en lavant le pilon A.
    3. Transférer l’homogénat dans un tube à fond rond de 2 mL. Lavez l’homogénéisateur Dounce avec un tampon d’homogénéisation TRAP supplémentaire de 1 mL et transférez le volume lavé dans le tube à fond rond de 2 mL.
    4. Centrifuger l’homogénat à 12 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Transférer le surnageant autorisé dans un nouveau tube à fond rond de 2 mL. Jetez la pastille.
    5. Transférer 100 μL de l’homogénat dégagé dans un nouveau tube à fond rond de 2 mL et réserver comme entrée sur de la glace.
    6. Incuber le reste de l’homogénat éliminé (à partir de l’étape 3.2.4) avec un anticorps anti-GFP (5 μg/mL) pendant 1 h à 4 °C en tournant bout à bout. Incuber l’échantillon d’entrée dans les mêmes conditions.
    7. Au cours des 15 dernières minutes de l’incubation, laver les billes magnétiques de protéine G dans le tampon de lavage à faible teneur en sel en suivant les étapes suivantes (3.2.8-3.2.11).
    8. Vortex le flacon de billes magnétiques de protéine G pendant 30 s pour le remettre complètement en suspension. Transférer 50 μL de billes magnétiques de protéine G pour chaque échantillon (jusqu’à 10 échantillons peuvent être lavés dans un tube) dans un tube à fond rond de 2 mL.
    9. Ajouter 500 μL de tampon de lavage à faible teneur en sel aux billes et pipeter doucement pour mélanger. Placez le tube dans un support magnétique pendant 1 min pour recueillir les perles contre le côté du tube. Retirez et jetez le surnageant.
    10. Retirez le tube du support magnétique et ajoutez 1 ml de tampon de lavage à faible teneur en sel dans le tube. Pipeter doucement pour mélanger. Placez le tube dans un support magnétique pendant 1 min pour recueillir les perles contre le côté du tube. Retirez et jetez le surnageant.
    11. Répétez l’étape 3.2.10 pour un total de trois lavages. Après le lavage final, retirez le tube de la grille magnétique et remettez les billes en suspension dans le volume initial du tampon de lavage à faible teneur en sel (50 μL par échantillon).
    12. Transférer les billes lavées en suspension (50 μL) dans l’échantillon d’antigène/mélange d’anticorps et incuber à 4 °C pendant une nuit tout en tournant dans un mélangeur bout à bout. Incuber les échantillons d’entrée en tournant bout à bout à 4 °C pendant la nuit pour maintenir des conditions équivalentes.
    13. Après l’incubation de nuit, retirez les tubes du rotateur et séparez les billes magnétiques avec les ribosomes / ARN cibles (fraction positive) du surnageant (fraction négative) à l’aide du support magnétique pendant 2,5-3 minutes. Aspirer la fraction négative, la placer dans un nouveau tube à fond rond de 2 ml et la mettre de côté sur de la glace pendant le traitement de la fraction positive.
    14. Ajouter 500 μL de tampon de lavage à haute teneur en sel (à partir de l’étape 3.1.5) dans le tube avec la fraction positive et pipeter doucement pour mélanger. Placez le tube sur un support magnétique maintenu sur de la glace pendant 1 min pour séparer les perles. Jetez le surnageant et retirez le tube de l’aimant.
    15. Répétez l’étape 3.2.14 pour un total de trois lavages. Après le lavage final, remettre les billes en suspension dans 350 μL de tampon de lyse de l’ARN complété par 3,5 μL de 2-mercaptoéthanol (BME). Incuber les tubes à température ambiante tout en mélangeant pendant 10 min à 900 tr/min dans un agitateur numérique.
    16. Séparer les billes de la solution qui contient maintenant les ribosomes/ARN cibles avec un support magnétique pendant 1 min à température ambiante. Recueillir la fraction positive éluée (surnageant) dans un tube frais de 1,5 mL et ajouter 350 μL d’éthanol à 100 %. Inversez pour mélanger. Procéder à l’isolement de l’ARN.
    17. Facultatif : Pour isoler l’ARN de l’échantillon d’entrée (étape 3.2.5) et de la fraction négative (étape 3.2.13), transférer 100 μL de l’échantillon d’entrée et des fractions négatives dans des tubes frais de 1,5 mL. Ajouter 350 μL de tampon de lyse de l’ARN complété par 3,5 μL de BME à chaque échantillon. Inversez pour mélanger. Ajouter 250 μL d’éthanol à 100 % dans chaque tube et retourner pour mélanger. Procéder à l’isolement de l’ARN.
  3. Isolement de l’ARN
    1. Transférer 700 μL de la fraction positive et, éventuellement, de la fraction d’entrée et/ou négative à une colonne de spin d’ARN. Suivez les instructions du fabricant pour isoler l’ARN de la colonne de spin.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un schéma des protocoles TRAP et INTACT est illustré à la figure 1. Ici, la spécificité du modèle murin Cyp17-NuTRAP aux cellules stromales ovariennes / thèques est démontrée par imagerie immunofluorescente et RNA-Seq à partir d’ARN isolé par TRAP. Tout d’abord, l’imagerie par immunofluorescence du signal eGFP dans l’ovaire et la localisation du signal eGFP vers les cellules thèques et stromales ont été réalisées. Brièvement, des sections de 5 μm ont été déparaffinisées avec un gradient de x...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le modèle murin NuTRAP6 est une puissante approche de marquage transgénique pour l’interrogation par appariement du transcriptome et de l’épigénome à partir de types cellulaires spécifiques qui peuvent être adaptés à n’importe quel type de cellule avec un pilote Cre disponible. Ici, nous démontrons la spécificité du modèle murin Cyp17-NuTRAP dans le ciblage des cellules ovariennes thèques et stromales. Le modèle Cyp17-NuTRAP peut être utilisé pour élucider davantage les mécanismes épigénétiques sp...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health (NIH) (R01AG070035, R01AG069742, T32AG052363), de la Fondation BrightFocus (M2020207) et de la Presbyterian Health Foundation. Ce travail a également été soutenu en partie par le prix MERIT I01BX003906 et un prix du Shared Equipment Evaluation Program (ShEEP) ISIBX004797 des États-Unis (É.-U.) Ministère des Anciens Combattants, Service de recherche et de développement en laboratoire biomédical. Les auteurs aimeraient également remercier le Clinical Genomics Center (OMRF) et l’Imaging Core Facility (OMRF) pour leur aide et leur utilisation des instruments.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,1 M SpermidineSigma-Aldrich05292-1ML-F
1 M MgCl2Thermo ScientificAM9530G
10 % NP-40Thermo Scientific85124
100 mg/mL CycloheximideSigma-AldrichC4859-1ML
2-mercaptoéthanolSigma-AldrichM3148
30 et micro ; crépine à cellules M  ;Miltenyi Biotec130-098-458
All Prep DNA/RNA Mini KitQiagen80204
anticorps anti-GFPAbcamAb290Pour TRAP et IHC (Rabbit polyclonal to GFP)
Buffer RLTQiagen79216RNA Lysis Buffer in protocol
cOmplete, mini, sans EDTA comprimé inhibiteur de protéaseRoche11836170001pour l’homogénéisation TRAP Modèle murin Buffer
Cyp17iCreThe Jackson Laboratory28547B6 ; SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J
DynaMag-2aimant Invitrogen12321D
Amorces de génotypageIDTCustomGeneric Cre - Jackson Laboratory protocol 22392, Amorces : oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339
  ;   ;  ;   ;  ;   ;Cyp17iCre - Jackson Laboratory protocol 30847, Amorces : 21218, 31704, 31705, 35663
  ;   ;  ;   ;  ;   ;NuTRAP - Jackson Laboratory protocol 21509, Amorces : 21306, 24493, 32625, 32626
Cocktail d’inhibiteurs de protéase Halt (100X)Thermo Scientific1861278pour tampon NPB
M-280 Streptavidin Dynabeads  ;Invitrogen11205D2.8 et micro ; m diamètre de la bille
MixMateEppendorf5353000529
Nuclei Kit d’isolation : Nuclei EZ PrepSigma-AldrichNuc101Contient un tampon de lyse des noyaux et un tampon de stockage des noyaux
1 M HEPESGibco15630-080
5 M NaClThermo ScientificAM9760G
2M KClThermo ScientificAM9640G
0,5 M EDTAThermo ScientificAM9260G
0,5 M EGTAFisher Scientific50-255-956
Modèle murin NuTRAPThe Jackson Laboratory29899B6 ; 129S6-GT(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J
Pierce DTT No-Weigh FormatThermo ScientificA39255
Protein G DynabeadsThermoFisher10004DPour TRAP
RNaseOUTInvitrogen10777019
Héparine de sodiumFisher ScientificBP2425
Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7.5Invitrogen15567-027
Rotateur de tube VWRFisher ScientificNC9854190

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Broekmans, F. J., Soules, M. R., Fauser, B. C. Ovarian aging: Mechanisms and clinical consequences. Endocrine Reviews. 30 (5), 465-493 (2009).
  2. Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: Theory, technical considerations, and future applications. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).
  3. Morris, M. E., et al. A single-cell atlas of the cycling murine ovary. eLife. 11, 77239(2022).
  4. Kendrick, H., et al. Transcriptome analysis of mammary epithelial subpopulations identifies novel determinants of lineage commitment and cell fate. BMC Genomics. 9, 591(2008).
  5. Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. Does FACS perturb gene expression. Cytometry A. 87 (2), 166-175 (2015).
  6. Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
  7. Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693(2020).
  8. Ocanas, S. R., et al. Minimizing the ex vivo confounds of cell-isolation techniques on transcriptomic and translatomic profiles of purified microglia. eNeuro. 9 (2), (2022).
  9. Raus, A. M., Nelson, N. E., Fuller, T. D., Ivy, A. S. 34;SIT" with Emx1-NuTRAP mice: Simultaneous INTACT and TRAP for paired transcriptomic and epigenetic sequencing. Current Protocols. 2 (10), 570(2022).
  10. Chucair-Elliott, A. J., et al. Translatomic response of retinal Muller glia to acute and chronic stress. Neurobiology Disease. 175, 105931(2022).
  11. Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), 13259(2020).
  12. Briley, S. M., et al. Reproductive age-associated fibrosis in the stroma of the mammalian ovary. Reproduction. 152 (3), 245-260 (2016).
  13. Umehara, T., et al. Female reproductive life span is extended by targeted removal of fibrotic collagen from the mouse ovary. Science Advances. 8 (24), (2022).
  14. Lopez-Sanchez, N., Frade, J. M. Cell cycle analysis in the vertebrate brain using immunolabeled fresh cell nuclei. Bio-Protocol. 3 (22), 973(2013).
  15. Saccon, T. D., et al. Primordial follicle reserve, DNA damage and macrophage infiltration in the ovaries of the long-living Ames dwarf mice. Experimental Gerontology. 132, 110851(2020).
  16. Kinnear, H. M., et al. The ovarian stroma as a new frontier. Reproduction. 160 (3), 25-39 (2020).
  17. Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertility Research and Practice. 6, 5(2020).
  18. Tighe, R. M., et al. Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American Thoracic Society workshop report. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 61 (2), 150-161 (2019).
  19. Zhang, X., et al. Comparative analysis of droplet-based ultra-high-throughput single-cell RNA-Seq systems. Molecular Cell. 73 (1), 130-142 (2019).
  20. Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8, 14049(2017).
  21. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  22. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  23. Prakadan, S. M., Shalek, A. K., Weitz, D. A. Scaling by shrinking: Empowering single-cell 'omics' with microfluidic devices. Nature Reviews Genetics. 18 (6), 345-361 (2017).
  24. Wang, Q., et al. CoBATCH for high-throughput single-cell epigenomic profiling. Molecular Cell. 76 (1), 206-216 (2019).
  25. Luo, C., et al. Robust single-cell DNA methylome profiling with snmC-seq2. Nature Communications. 9, 3824(2018).
  26. Liu, H., et al. DNA methylation atlas of the mouse brain at single-cell resolution. Nature. 598 (7879), 120-128 (2021).
  27. Yamawaki, T. M., et al. Systematic comparison of high-throughput single-cell RNA-seq methods for immune cell profiling. BMC Genomics. 22 (1), 66(2021).
  28. Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77(2016).
  29. Natarajan, K. N. Single-cell tagged reverse transcription (STRT-Seq). Methods in Molecular Biology. 1979, 133-153 (2019).
  30. Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
  31. Aldridge, S., Teichmann, S. A. Single cell transcriptomics comes of age. Nature Communications. 11, 4307(2020).
  32. Clark, S. J., Lee, H. J., Smallwood, S. A., Kelsey, G., Reik, W. Single-cell epigenomics: Powerful new methods for understanding gene regulation and cell identity. Genome Biology. 17, 72(2016).
  33. Christensson, E., Lewan, L. The use of spermidine for the isolation of nuclei from mouse liver. Studies of purity and yield during different physiological conditions. Zeitschrift für Naturforschung. Section C, Biosciences. 29 (5-6), 267-271 (1974).
  34. Levine, M. E., et al. Menopause accelerates biological aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (33), 9327-9332 (2016).
  35. Ossewaarde, M. E., et al. Age at menopause, cause-specific mortality and total life expectancy. Epidemiology. 16 (4), 556-562 (2005).
  36. Wellons, M., Ouyang, P., Schreiner, P. J., Herrington, D. M., Vaidya, D. Early menopause predicts future coronary heart disease and stroke: the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis. Menopause. 19 (10), 1081-1087 (2012).
  37. Camaioni, A., et al. The process of ovarian aging: It is not just about oocytes and granulosa cells. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 39 (4), 783-792 (2022).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Transcriptome ovarienSp cificit du type cellulaireMod le de souris NuTRAPAffinit des ribosomes en traductionM thode INTACTCellules stromales ovariennesAccessibilit de la chromatineS quen age de l ARNImagerie par immunofluorescence

Articles connexes