Techniques et pratiques de culture cellulaire pour éviter la contamination par des champignons et des bactéries dans le laboratoire de culture cellulaire de recherche

Résumé

Ce protocole présente les techniques et pratiques essentielles de culture cellulaire à utiliser dans le laboratoire de culture cellulaire de recherche pour éviter la contamination par des champignons et des bactéries. Dans la catégorie des bactéries, un accent particulier sera mis sur la prévention de la contamination par les mycoplasmes.

Résumé

La culture cellulaire est une compétence délicate nécessaire à la culture de cellules humaines, animales et d’insectes, ou d’autres tissus, dans un environnement contrôlé. L’objectif du protocole est de mettre l’accent sur les techniques correctes utilisées dans un laboratoire de recherche pour prévenir la contamination par des champignons et des bactéries. Un accent particulier est mis sur l’évitement de la contamination par les mycoplasmes, une préoccupation majeure dans la salle de culture cellulaire en raison de sa petite taille et de sa résistance à la plupart des antibiotiques utilisés pour la culture cellulaire. Ces mêmes techniques assurent une croissance continue et maintiennent des cellules saines. Pour les utilisateurs de cultures cellulaires débutants et expérimentés, il est important d’adhérer systématiquement à ces meilleures pratiques pour atténuer le risque de contamination. Une fois par année, les laboratoires devraient examiner les pratiques exemplaires en matière de culture cellulaire et faire un suivi avec une discussion ou une formation supplémentaire au besoin. Prendre des mesures précoces pour prévenir la contamination en premier lieu permettra d’économiser du temps et de l’argent, par rapport au nettoyage après la contamination. Les meilleures pratiques universelles maintiennent les cultures cellulaires en bonne santé, réduisant ainsi le besoin de décongeler constamment de nouvelles cellules, d’acheter des milieux de culture cellulaire coûteux et de réduire la quantité de décontamination et de temps d’arrêt de l’incubateur.

Introduction

La culture cellulaire a de nombreuses utilisations dans le laboratoire de recherche. Depuis les origines de la culture cellulaire au début du 20e siècle, les lignées cellulaires ont contribué à faire progresser la science. Les lignées cellulaires présentent plusieurs avantages; Diverses lignées cellulaires peuvent aider les chercheurs à étudier la biologie cellulaire, à produire des baculovirus pour des études plus approfondies ou à produire de grandes quantités d’une protéine d’intérêt, pour n’en nommer que^{quelques-unes 1}. Parmi les autres utilisations, mentionnons l’étude de la croissance tissulaire, l’aide à l’avancement de la mise au point de vaccins, la recherche en toxicologie, l’étude du rôle des gènes dans les organismes sains et les modèles malades, et la production de lignées cellulaires hybrides ^2,3. Les lignées cellulaires peuvent également permettre la production de médicaments³. Des techniques d’asepsie appropriées sont nécessaires lorsque vous travaillez avec des lignées cellulaires; Les pratiques et techniques décrites dans ce manuscrit sont applicables aux laboratoires de recherche où des travaux de culture cellulaire sont effectués. Les autres laboratoires ne sont pas abordés.

La contamination est souvent la principale préoccupation lors de l’exécution de travaux de culture cellulaire. Dans le contexte du présent document, la contamination fait généralement référence aux champignons et aux bactéries. L’objectif global de la méthode décrite dans ce document est de décrire en détail les meilleures pratiques pour éviter la contamination. Tous les membres du laboratoire doivent adhérer à ces pratiques lorsqu’ils travaillent dans la salle de culture cellulaire d’un laboratoire de recherche. Les laboratoires devraient s’assurer que tous les travailleurs participent activement à l’utilisation de ces pratiques exemplaires pour prévenir la contamination. La connaissance des bonnes pratiques et techniques aidera à garantir que les cultures cellulaires restent viables, saines et exemptes de contamination. Le développement de cette technique est basé sur la recherche de la littérature, sept ans d’expérience de travail avec des cultures cellulaires et la nécessité d’une méthode à laquelle les novices et les travailleurs expérimentés en culture cellulaire peuvent se référer chaque année.

Il est nécessaire de mettre au point une technique claire et normalisée que tous les laboratoires de culture cellulaire de recherche devraient suivre. Une grande partie de la littérature sur la contamination par culture cellulaire traite de la détection des mycoplasmes, des techniques aseptiques, des sources de contamination, de l’élimination des contaminants et de la prévention par l’utilisation d’antibiotiques et des tests réguliers 4,5,6,7,8. Bien que cette information soit utile, il n’y a pas de vidéos présentes dans la littérature qui démontrent les techniques de culture cellulaire appropriées que l’on devrait suivre. L’avantage des pratiques présentées par rapport aux techniques alternatives est de mettre l’accent sur la prévention de la contamination avant qu’elle ne se produise, plutôt que de détecter et de corriger les erreurs plus tard. De plus, une démonstration approfondie des techniques d’asepsie, une discussion sur la prévention de la croissance des champignons et des bactéries et des informations sur la circulation de l’air des armoires de biosécurité sont précieuses pour les travailleurs novices et expérimentés en culture cellulaire.

Les bactéries et les champignons sont les deux types de contaminants les plus courants. Dans la catégorie des bactéries, les mycoplasmes sont une préoccupation majeure en raison de leur petite taille et de leur capacité à proliférer tout en restant inaperçus. Ce sont des organismes auto-réplicatifs sans paroi cellulaire rigide qui dépendent des cellules eucaryotes pour se développer. Ils ont des capacités métaboliques réduites et peuvent se multiplier considérablement tout en restant non reconnus dans l’inspection visuelle de routine des cultures cellulaires et l’analyse microscopique régulière, bien que la microscopie électronique à transmission puisse détecter les mycoplasmes ^9,10. De plus, ils peuvent passer à travers des filtres microbiologiques¹⁰. Le milieu de culture cellulaire fournit des nutriments aux mycoplasmes, bien que malheureusement la supplémentation en antibiotiques n’affecte pas les mycoplasmes¹⁰. Il convient de noter que, en général, il n’est pas nécessaire de compléter les milieux avec des antibiotiques; Des techniques appropriées devraient suffire à tenir la contamination à distance. L’infection par les mycoplasmes n’entraîne pas la mort cellulaire immédiate, mais elle préoccupe les chercheurs car elle affecte la reproductibilité et la qualité des données.

Tout le personnel de laboratoire doit adhérer strictement aux bonnes pratiques de culture cellulaire. Les cultures doivent être testées pour les mycoplasmes après leur nouvel achat, pendant leur culture, avant la cryoconservation et lorsqu’elles sont décongelées à partir d’azote liquide ^2,10. Différents tests sont disponibles sur le marché en utilisant la réaction en chaîne de la polymérase (PCR), le dosage immuno-enzymatique (ELISA) ou l’immunomarquage. ³ La littérature indique que « les isolats humains représentent un pourcentage élevé des contaminants mycoplasmiques trouvés dans les cultures cellulaires »⁵. Bien que plus de 200 espèces de mycoplasmes aient été décrites, environ six d’entre elles représentent la plupart des infections. Ces six espèces sont M. arginini, M. fermentans, M. hominis, M. hyorhinis, M. orale et Acholeplasma laidlawii¹⁰. Comme pour les autres types de contamination, l’air et les aérosols les introduisent dans les cultures cellulaires⁵. Cela se retrouve dans d’autres articles puisque « l’opérateur humain est potentiellement le plus grand danger en laboratoire »⁷. Bien que cela se fasse par erreur humaine, le risque peut être éliminé si une procédure standard est suivie. L’excrétion du personnel ne se limite pas à la contamination par les mycoplasmes; Les cultures cellulaires dans un laboratoire sont généralement infectées par les mêmes espèces de mycoplasmes, ce qui indique que la contamination se propage d’un flacon à l’autre en raison de techniques de culture cellulaire inappropriées¹⁰.

La prévention de la contamination croisée est également une autre raison pour laquelle les techniques de culture cellulaire appropriées doivent être suivies. Il est à noter qu’au moins 15 % à 18 % des lignées cellulaires dans le monde peuvent être contaminées ou mal identifiées^11,12. En plus de tester les lignées cellulaires pour la contamination par les mycoplasmes, elles devraient également être testées pour la contamination croisée¹⁰. Pour les lignées cellulaires humaines, l’authentification des lignées cellulaires par une technique peu coûteuse basée sur l’ADN appelée profilage à courte répétition en tandem (STR) est la norme de référence internationale actuelle, car c’est un moyen facile de confirmer l’identité de la lignée cellulaire 2,10,13,14. STR peut identifier les lignées cellulaires mal étiquetées ou contaminées par des croix, mais il ne peut pas détecter l’origine tissulaire incorrecte^10,13,14. La validité des données de recherche peut être compromise si les lignées cellulaires sont mal étiquetées, mal identifiées ou contaminées¹³. Comme pour d’autres types de contamination, la contamination croisée peut se produire en raison d’une mauvaise technique provoquant la propagation des aérosols, d’un contact erroné conduisant au mauvais type de cellule entrant dans un flacon ou de l’utilisation du même flacon de média et des mêmes réactifs avec des lignées cellulaires différentes¹⁰. Aucun partage de bouteilles multimédias ne devrait avoir lieu; Le partage d’une bouteille de média entre deux lignées cellulaires différentes peut permettre à ces populations cellulaires d’être mélangées, ce qui conduit le type cellulaire à croissance plus rapide à prendre complètement le contrôle du flacon. Ce remplacement n’est pas perceptible et entraîne des erreurs d’étiquetage et d’identification². Une lignée cellulaire peut également être confondue avec une autre si les cultures sont confondues lors de la manipulation ou de l’étiquetage¹⁰. Une attention particulière doit être accordée à garder les réactifs, les milieux et les flacons séparés les uns des autres. Chaque membre du laboratoire devrait avoir ses propres flacons médias; Aucun partage ne doit avoir lieu entre les membres du laboratoire. Les lignées cellulaires elles-mêmes doivent être achetées auprès d’une banque de cellules et d’un fournisseur qualifiés. Les laboratoires ne devraient pas partager de cellules. Des études montrent que, bien que les tests STR et mycoplasmes soient régulièrement utilisés, de nombreux articles de recherche dans la littérature ont déjà utilisé des lignées cellulaires mal identifiées ou contaminées¹⁵. Passer au crible la recherche pour trouver ces articles problématiques et informer rétroactivement les lecteurs à ce sujet est fastidieux. La prévention est le meilleur moyen de s’assurer que ce problème ne se produise pas en premier lieu.

La simple action de pulvériser des articles avec 70% d’EtOH peut tuer les organismes; 70% EtOH agit en dénaturant les protéines et en dissolvant les lipides dans les organismes les plus fréquemment contaminants, y compris les bactéries et les champignons¹⁶. Des études ont montré que 70% est la concentration la plus efficace; Les protéines de surface ne coagulent pas rapidement avec 70% d’EtOH afin qu’elles puissent pénétrer dans la cellule, tandis que l’eau qu’elle contient est nécessaire au processus de dénaturation des protéines. En raison de la différence de concentration d’eau et d’alcool de chaque côté de la paroi cellulaire, 70% d’EtOH pénètre dans la cellule pour dénaturer les protéines enzymatiques et structurelles. Si la croissance de moisissures est observée dans les flacons, l’ensemble de l’incubateur doit être décontaminé en le pulvérisant d’abord avec 70% d’EtOH et en l’essuyant, suivi d’une incubation nocturne de 16 heures à 60 °C¹⁷. Cela tue la plupart des moisissures et des bactéries.

Le principal avantage des pratiques de prévention par rapport aux techniques alternatives d’élimination de la contamination après qu’elle se soit produite est qu’en prévenant la contamination dès le début, les travailleurs de laboratoire peuvent être sûrs que leurs cultures cellulaires sont saines et qu’il n’y aura pas de coûts élevés associés à la décontamination des incubateurs ou à la mise au rebut des cultures cellulaires. L’élimination des contaminants mycoplasmiques après, par exemple, n’est pas efficace⁷. Prendre le temps dès le début de s’assurer que le personnel de laboratoire est correctement formé, que la salle de culture cellulaire est autonome et qu’une procédure standard est utilisée permettra d’économiser du temps et de l’argent.

Protocole

1. Préparatifs

1. Généralités
   1. Portez une blouse de laboratoire propre conçue pour être portée uniquement dans la salle de culture cellulaire et dans aucune autre partie du laboratoire.
      REMARQUE: La blouse de laboratoire n’a pas besoin d’être stérile.
   2. Portez des gants neufs qui n’ont touché aucune autre surface. Assurez-vous que les gants sont bien ajustés. Les gants en nitrile sans poudre sont les meilleurs.
      REMARQUE: Les gants n’ont pas besoin d’être stériles.
   3. Pour vous préparer au travail, vaporisez les gants, les manches de la blouse de laboratoire et l’intérieur de l’enceinte de sécurité biologique avec 70% d’EtOH. Essuyez la surface de travail et le panneau de verre à l’aide d’une serviette en papier non pelucheuse.
      REMARQUE: L’utilisation de 70% d’EtOH tue les bactéries avec la plus grande efficacité¹⁶. La serviette en papier n’a pas besoin d’être stérile.
   4. Conservez les bains d’eau à l’intérieur de la salle de culture cellulaire et ne les utilisez que pour réchauffer les milieux de culture ou décongeler les cellules. Vidangez et lavez les bains-marie une fois par semaine, en suivant les instructions de nettoyage du fabricant.
2. À l’intérieur de l’enceinte de sécurité biologique
   1. Limitez le nombre d’articles apportés dans l’armoire. N’interrompez pas le flux d’air à l’intérieur de l’enceinte de sécurité biologique en bloquant les grilles avant ou arrière.
      REMARQUE : Voir la figure 1 pour une explication de la façon dont l’air circule à l’intérieur d’une armoire.
   2. Vaporisez tous les articles placés à l’intérieur de l’armoire avec 70% d’EtOH et essuyez-les. Commencez par vaporiser le haut de la bouteille de média et travaillez vers le bas. De même, avec une serviette en papier propre, essuyez-la en la séchant progressivement jusqu’au fond. Ne remontez pas vers le bouchon.
   3. Si l’armoire est assez grande pour accueillir des pipettes sérologiques, elles peuvent être placées à l’intérieur, sinon elles peuvent être stockées dans un récipient monté à l’extérieur de l’armoire. Vérifiez de chaque côté de la pipette enveloppée s’il n’y a pas de trous, de déchirures ou de perforations dans l’emballage avant utilisation. N’arrachez pas l’emballage. Au lieu de cela, décollez doucement les extrémités de l’emballage, insérez la pipette sérologique dans un support de pipette et retirez l’emballage en un seul mouvement fluide.
   4. Ne survolez pas les bouteilles ou les flacons ouverts; tendre la main au-dessus de bouteilles ou de flacons ouverts, ou ouvrir des articles par-dessus des articles déjà ouverts dans l’enceinte de sécurité biologique.
      REMARQUE: Le flux d’air à l’intérieur de l’armoire pousse vers le bas sur la surface de travail, de sorte que toute contamination présente sur le manchon, par exemple, peut pénétrer dans les cultures cellulaires.
   5. Ne versez pas de liquides. Au lieu de cela, ajoutez-les à l’aide d’une pipette sérologique. Après avoir complété le média, mélangez soigneusement le contenu et parapez la bouteille. Assurez-vous également d’inclure une étiquette pour ce que le média a été complété.

2. Travailler avec des lignées cellulaires adhérentes

1. Si une fiole en plastique est nécessaire, vaporisez le sac entier et placez-le à l’intérieur de l’armoire.
2. Utilisez des pipettes en verre autoclavées ou des pipettes en plastique stériles jetables pour aspirer le média ou les solutions de lavage. Retirez délicatement le capuchon métallique du récipient de stockage. Isoler une pipette en verre en secouant doucement le récipient en biais. Lorsque vous entrez dans le récipient, évitez de toucher d’autres pipettes.
   REMARQUE: Manipulez la pipette choisie à partir d’une seule extrémité.
3. Replacez rapidement les bouchons des bouteilles dès que possible. Placez les capuchons sur la surface de travail à l’envers afin que la jante ne touche pas la surface de travail. Ne saisissez pas le capuchon par le haut ou le bas; Au lieu de cela, touchez les capuchons sur les côtés.
4. Lorsque vous aspirez des liquides, utilisez un ballon à piège à vide situé à l’extérieur de l’armoire dans un récipient secondaire sur le sol.
   REMARQUE: Ne jetez pas de déchets liquides dans des sacs à déchets biologiques car les sacs fuient. Les déchets seront créés en travaillant à l’intérieur de l’armoire. Déplacer les mains dans et hors de l’armoire trop souvent interrompra le flux d’air. Laissez temporairement les déchets à l’intérieur de l’armoire. Placez-le sur le côté pour qu’il n’interrompe pas le travail.
5. Vaporisez généreusement les gants avec 70% d’EtOH chaque fois qu’ils deviennent secs. Frottez les mains ensemble pour que les gants ne soient pas mouillés.
6. Si une pipette sérologique touche par erreur quelque chose dans l’armoire, n’hésitez pas à la jeter. Recommencez avec une pipette sérologique propre au lieu d’en utiliser une qui pourrait être contaminée.

4. Vérification et stockage des cellules

1. Avant de placer des cellules dans l’incubateur, vérifiez à quoi elles ressemblent au microscope. Si les cellules ont été complètement suspendues, des cellules individuelles doivent être observées.
2. Ne parlez pas, n’éternuez pas, ne toussez pas et ne respirez pas fortement dans les incubateurs. Ouvrez et fermez rapidement les portes de l’incubateur. Laisser les portes ouvertes plus longtemps que nécessaire peut permettre aux contaminants présents dans l’air de pénétrer dans les incubateurs.
   REMARQUE: Le port d’un masque lorsque vous travaillez dans la salle de culture cellulaire peut aider, car des mycoplasmes peuvent être présents dans la bouche humaine. Évitez d’utiliser des téléphones cellulaires dans la salle de culture cellulaire, car il n’est pas recommandé de parler.
3. Assurez-vous que les bouchons de toutes les bouteilles sont bien fermés avant de retirer les bouteilles de l’armoire.
4. Conserver les milieux de culture cellulaire dans l’obscurité à 4 °C lorsqu’ils ne sont pas utilisés, car ils sont sensibles à la lumière.
5. Vaporisez à nouveau l’intérieur de l’armoire avec 70% d’EtOH une fois le travail de culture cellulaire terminé et essuyez la surface avec une serviette en papier. Videz les sacs à déchets biologiques dangereux. Répétez ce processus et remplacez les gants lorsque vous passez à une autre lignée cellulaire.

5. Travailler avec des lignées cellulaires en suspension

1. Pour les cellules en suspension cultivées dans des flacons en verre, assurez-vous que les gants sont soigneusement pulvérisés avec 70% d’EtOH, puis touchez la feuille d’aluminium avec les gants humides et vaporisez uniquement le fond de la fiole avant de la placer à l’intérieur de l’armoire.
2. Lorsque vous prélevez un échantillon pour le comptage cellulaire, ne retirez qu’un seul tube de 1,5 mL de son contenant. Ne touchez pas d’autres tubes. Placez le capuchon à l’envers sur la surface de travail. Ne touchez pas la jante intérieure. Manipulez-le avec soin sur les côtés et remplacez-le une fois terminé.
3. Retirez délicatement le morceau de papier d’aluminium plié à double plié qui recouvre tout le col de la fiole. Manipulez le flacon en verre par le bas seulement – ne le touchez pas du cou – une fois que la feuille est enlevée. Utilisez une pipette sérologique de 1 mL pour prélever un échantillon pour le comptage cellulaire.
4. Ne laissez pas le média s’égoutter sur le côté des flacons; si c’est le cas, vaporisez une serviette en papier avec 70% d’EtOH et nettoyez-la immédiatement.
5. Assurez-vous que les bouchons et le papier d’aluminium sont serrés avant de retirer les bouteilles ou les flacons des enceintes de sécurité biologique.

6. Incubation cellulaire

1. Utilisez des incubateurs distincts pour différents types de cellules afin d’éviter la contamination croisée des différents types de cellules.

7. Collecte des déchets liquides

1. Recueillir les déchets liquides dans un ballon piège à vide situé à l’extérieur de l’armoire sur le sol dans un récipient secondaire étiqueté « Déchets ».
   REMARQUE: Le tuyau est connecté à un filtre à haute efficacité absorbant les particules (HEPA), qui est remplacé sur une base mensuelle.

8. Nettoyage

1. Retirez le sac à déchets contre les risques biologiques et lavez les flacons en verre dès que possible. Gardez un protocole de lavage des vitres près de l’évier. Voir le dossier supplémentaire 1 pour le protocole de lavage.
2. Autoclavez la verrerie de culture cellulaire au lieu de l’envoyer à une installation de lavage de verre. Gardez-le séparé de la verrerie dans la zone principale du laboratoire.
   REMARQUE: Les cellules SF-9 laissent un bord de cellules mortes sur le côté des flacons si le verre n’est pas bien nettoyé. Voir le fichier supplémentaire 1 pour le protocole d’autoclave.

9. Organisation

1. Organisez la salle de culture cellulaire de manière à ce que toutes les fournitures soient situées dans une seule zone, minimisant ainsi la nécessité pour les membres du laboratoire de quitter la salle à la recherche de fournitures.
2. Étiquetez toutes les bouteilles en plastique utilisées pour prélever des cellules et réutilisées en culture cellulaire par la suite comme « Pour culture cellulaire uniquement ». Utilisez les flacons de culture cellulaire désignés pour un type de cellule spécifique. Conservez les flacons dans la salle de culture cellulaire pour un accès facile.

10. Identification de la contamination par les bactéries, les champignons et les mycoplasmes

REMARQUE: Ne pas suivre le flux de travail ci-dessus peut entraîner une contamination bactérienne, fongique et mycoplasmique.

1. Toujours avant de commencer à travailler, observez les flacons pour une turbidité importante, une croissance supplémentaire sous forme de boules floues et des accumulations denses de cellules sur le côté, qui sont tous des indicateurs de contamination.
   REMARQUE: Un œil expérimenté peut faire la différence entre la turbidité causée par la contamination microbienne et les cellules réelles. Alors que les cellules font apparaître le milieu normalement clair trouble, la contamination bactérienne provoque une turbidité importante avec une couleur blanche.
   1. Identifiez visuellement la contamination par les moisissures en notant l’apparition de boules rondes et floues flottant dans le milieu (voir la figure 2).
   2. Identifiez visuellement la contamination bactérienne si le milieu est trouble, blanc ou turbulent (voir la figure 2).
   3. Identifier la contamination par les mycoplasmes en effectuant un test mensuel des mycoplasmes. Un test basé sur la PCR demande aux utilisateurs de prélever un échantillon de cellules de 1,5 mL, d’effectuer un comptage cellulaire en utilisant 10 μL, de diluer à 0,08 x 10⁶ cellules / mL, de faire tourner les cellules, de lyser les cellules à l’aide du tampon contenu dans le kit et de tourner vers le bas une dernière fois. Le surnageant est incubé avec des amorces qui amplifient une gamme d’espèces de mycoplasmes. Exécutez un gel d’ADN pour visualiser les bandes. L’absence de bandes signifie que le mycoplasme n’est pas identifié.
      REMARQUE: Ce contaminant majeur peut être présent dans la bouche humaine. Il est recommandé de tester la contamination des cellules par les mycoplasmes après les avoir décongelées et avant de les utiliser à des fins expérimentales. Ensuite, surveillez les cellules pour la contamination par les mycoplasmes une fois par mois. De nombreuses entreprises proposent des kits de test mycoplasmiques. Choisissez-en un qui convient.

Résultats

Si les techniques et les pratiques de culture cellulaire décrites dans le présent document ne sont pas suivies, la contamination par des champignons et des bactéries peut se produire dans le laboratoire de culture cellulaire de recherche. La figure 2 montre les flacons contaminés à la fois dans les cultures en suspension et adhérentes.

Lorsqu’il ne suit pas les techniques d’asepsie, la contamination par les moisissures peut survenir 2 à 3 jours plus tard. Les boules floues rondes flottant dans le milieu sont perceptibles dans les cellules en suspension, tandis que la croissance de moisissures dans les cellules attachées peut être observée sous forme de grandes taches irrégulières, blanches ou vertes.

Pour les bactéries, la contamination est observée le lendemain. Les médias sont turbulents, blancs et nuageux. La couleur blanche est typique des cellules bactériennes, qui se multiplient beaucoup plus rapidement que les lignées cellulaires. Un œil expérimenté est capable de faire la différence entre les milieux non contaminés et les milieux contaminés. Pour les cellules attachées, on peut comparer une bouteille de milieu non ouvert avec une fiole pour vérifier si des turbulences sont observées dans la fiole.

À l’intérieur de l’enceinte de sécurité biologique, le nombre d’articles doit être réduit au minimum. Évitez de placer des objets sur les grilles arrière et avant (voir la figure 3). Dans cette armoire, un ensemble de pipettes, des pointes, des pipettes en verre autoclavées, un support de pipette et des marqueurs sont à l’intérieur. La zone de travail au milieu est dégagée. Garder les armoires organisées de cette façon est une bonne idée. De plus, l’opérateur doit porter une blouse de laboratoire et des gants propres avant de commencer à travailler. Un flacon pulvérisateur contenant 70 % d’EtOH doit être conservé à proximité afin que l’opérateur puisse vaporiser ses gants souvent. La peau est recouverte de gants ou d’une blouse de laboratoire. L’opérateur doit ajuster sa chaise de manière à ce que ses bras soient à un angle de 90° lorsqu’il travaille à l’intérieur de l’armoire, et les objets doivent être facilement accessibles à l’intérieur de l’armoire (voir la figure 4).

De nombreuses espèces de mycoplasmes peuvent être identifiées de manière fiable à l’aide d’un test basé sur la PCR. La figure 5 montre les résultats d’un test de mycoplasme négatif. La bande de gauche montre les normes de poids moléculaire pour l’ADN. Les quatre bandes de droite sont des témoins positifs. Aucune bande n’apparaît sous les types de cellules testées car le mycoplasme n’a pas été détecté.

Si le milieu contient des indicateurs de pH, il sera rouge pour la valeur optimale du pH des cellules à 7,4. Une fois que les cellules se développent, le média changera de couleur du rouge au jaune³. Ce changement de couleur peut également se produire si les bactéries envahissent le flacon et prolifèrent (Figure 6). La couleur jaune indique que le pH est bas. L’observation d’une nouvelle bouteille de média non ouverte à côté d’une fiole est un moyen objectif d’observer la contamination dans les cellules attachées. Pour les cultures en suspension, l’utilisateur peut observer attentivement le flacon pour détecter toute excroissance flottant dans le milieu ou si un anneau épais de cellules bactériennes envahies par la végétation est présent à l’intérieur du flacon en verre. Pour les deux types de cellules, un petit échantillon peut être prélevé et observé au microscope. Si d’autres excroissances ou formes de cellules sont observées, en particulier si les cellules se déplacent, il s’agit d’un indicateur de contamination (Figure 7). Un nettoyage complet de l’hémocytomètre doit être effectué avant le comptage cellulaire, car ce type de débris peut être présent uniquement sur l’hémocytomètre et non dans les cultures cellulaires elles-mêmes.

L’odeur peut être un autre indicateur de contamination dans un incubateur. La prolifération bactérienne a une odeur typique qu’un utilisateur expérimenté de culture cellulaire remarquera. L’odeur coïncide toujours avec un flacon contaminé, bien qu’un flacon infecté ne provoque pas toujours une odeur de tout l’incubateur.

La contamination par les moisissures tend à être plus fréquente dans les cellules HEK 293 S cultivées en suspension. La contamination bactérienne est plus fréquente dans les cellules SF-9. Cela peut être dû au fait que les cellules RIC sont cultivées avec de l’humidité, ce qui entraîne une accumulation d’humidité dans les incubateurs. Les cellules SF-9 sont cultivées sans humidité, de sorte que l’environnement est plus sec. Le taux de contamination dans les cultures adhérentes est inférieur au taux de contamination dans les cultures en suspension. Cela peut être dû à la plus petite taille du flacon, à la nature non réutilisable du ballon ou au bouchon ventilé au lieu de l’utilisation de papier d’aluminium.

Les mycoplasmes ne peuvent pas être observés à l’œil nu ni avec un microscope optique ordinaire, bien que la microscopie électronique à transmission spécialisée puisse détecter les mycoplasmes. Un kit d’identification des mycoplasmes doit être utilisé pour tester les cultures cellulaires tous les mois. De nombreuses espèces de mycoplasmes peuvent être identifiées de manière fiable à l’aide d’un test basé sur la PCR. Une brève description de la façon dont ce test PCR est effectué peut être trouvée dans la section protocole, et plus d’informations sur les mycoplasmes peuvent être trouvées dans la section discussion.

Figure 1 : Circulation de l’air dans une enceinte de biosécurité. Les armoires de sécurité biologique extraient l’air contaminé de la pièce elle-même et de l’armoire par les grilles avant et arrière. Cet air passe sous la surface de travail métallique, vers l’arrière de l’armoire et jusqu’au sommet de l’unité où se trouve un filtre HEPA. Là, l’air passe à travers le filtre et est filtré. Cet air pur pousse vers le bas sur la surface de travail. En raison de la façon dont le flux d’air filtré est poussé vers le bas à l’intérieur de l’armoire, il est recommandé de ne pas planer. Par exemple, il n’est pas souhaitable d’avoir un manchon sur le dessus d’une bouteille ouverte et de risquer que des contaminants potentiels soient poussés dans le média. Le nombre d’articles apportés à l’intérieur de l’armoire doit être réduit au minimum et les articles ne doivent pas être placés sur les grilles avant ou arrière afin de ne pas interrompre le flux d’air. Déplacer les bras dans et hors de l’armoire trop rapidement peut également perturber le flux d’air. Créé pour NuAire, Inc., par Jeff Kaphingst, Jeff the Designer, LLC. Utilisé avec autorisation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Cellules en suspension et adhérentes non contaminées et cellules contaminées par des moisissures ou des bactéries. La première image à gauche contient des cellules d’insectes (cellules SF-9) qui ne sont pas contaminées. La deuxième image montre une autre fiole de ces cellules contaminées par des moisissures. Le troisième flacon a été contaminé par des bactéries, comme en témoigne son aspect épais, blanc et trouble. Les deuxième et troisième flacons ont été contaminés parce qu’aucune des techniques et pratiques de culture cellulaire appropriées n’a été suivie. Tous les flacons ont été préparés le même jour. La croissance a été observée le lendemain pour la contamination bactérienne et 2 jours plus tard pour la contamination par les moisissures. Les cellules adhérentes non contaminées sont montrées (cellules Hek293) ainsi que la moisissure et la contamination bactérienne dans les cultures adhérentes. La contamination par les moisissures est montrée dans la deuxième ligne dans une boîte de Petri ronde. La photo est prise du haut du plat. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Organisation de l’armoire de culture cellulaire. À l’intérieur de l’enceinte de sécurité biologique, la quantité d’articles doit être réduite au minimum. Il faut éviter de placer des articles sur les grilles arrière et avant. Dans cette armoire, un ensemble de pipettes, des pointes, des pipettes en verre autoclavées, un support de pipette et des marqueurs sont à l’intérieur. La zone de travail au milieu est dégagée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : La bonne façon pour un opérateur de travailler sous la hotte d’écoulement. Un opérateur doit porter une blouse de laboratoire et des gants propres avant de commencer à travailler. Un flacon pulvérisateur contenant 70 % d’EtOH doit être conservé à proximité afin que l’opérateur puisse vaporiser ses gants souvent. La peau est recouverte par les gants ou la blouse de laboratoire. L’opérateur doit ajuster sa chaise de manière à ce que ses bras soient à un angle de 90° lorsqu’il travaille à l’intérieur de l’armoire. Les articles doivent être facilement accessibles à l’intérieur de l’armoire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Résultat négatif du test de mycoplasmes. De nombreuses espèces de mycoplasmes peuvent être identifiées de manière fiable à l’aide d’un test basé sur la PCR. La bande de gauche montre les normes de poids moléculaire pour l’ADN. Les quatre bandes de droite sont des témoins positifs. Aucune bande n’apparaît sous les types de cellules testées car le mycoplasme n’a pas été détecté. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Changement normal de couleur du média du rouge au jaune. Le milieu de culture cellulaire change la couleur du rouge au jaune si des indicateurs de pH sont présents. La couleur jaune indique que le pH est bas et que le média doit être remplacé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Contaminants observés au microscope optique. Si d’autres excroissances ou formes de cellules sont observées au microscope optique lors du comptage cellulaire, cela peut indiquer une contamination. Il convient de noter qu’un nettoyage complet de l’hémocytomètre doit être effectué avant le comptage des cellules car ce type de débris peut être présent uniquement sur l’hémocytomètre et non dans les cultures cellulaires elles-mêmes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Dossier supplémentaire 1 : Annexe Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Bien que la contamination soit l’une des principales préoccupations lors de l’exécution de travaux de culture cellulaire, les pratiques et les techniques décrites dans ce manuscrit aideront à atténuer les risques. Les étapes critiques comprennent le port d’une blouse de laboratoire propre, qui n’est utilisée que dans la salle de culture cellulaire, l’utilisation de gants propres et sans poudre qui sont souvent pulvérisés avec 70% d’EtOH et qui sont changés lors du passage d’une lignée cellulaire à l’autre, encourager chaque individu à ne pas partager les flacons de médias, nettoyer soigneusement l’armoire avant et après la fin des travaux, Déballer soigneusement les pipettes sérologiques, éviter tout contact étroit prolongé avec des flacons ou des flacons ouverts, ne pas partager les flacons de média entre plusieurs lignées cellulaires et ouvrir et fermer rapidement les portes de l’incubateur. De plus, le lavage et l’autoclavage de sa propre verrerie assurent un contrôle de la qualité, réduisant ainsi la probabilité d’introduire des contaminants extérieurs. Les méthodes de contrôle de la qualité comprennent l’utilisation de ruban autoclave pour indiquer si le stérilisateur a atteint la température appropriée de 121 °C, l’entretien préventif régulier de l’équipement et l’inspection visuelle du ballon pour s’assurer qu’il a été nettoyé correctement¹⁸. Un autre point important est d’utiliser des incubateurs séparés pour différents types de cellules afin de s’assurer que la contamination d’un type de cellule n’est pas transférée à d’autres et d’éviter toute contamination croisée avec les cellules.

Les infections bactériennes et fongiques sont les deux intrus les plus courants dans les cultures cellulaires. L’un des principaux contaminants, M. orale, est l’espèce de mycoplasme la plus commune dans la bouche humaine et « représente également l’isolat le plus commun, représentant 20 % à 40 % de toutes les infections à mycoplasmes dans les cultures cellulaires »⁴. En d’autres termes, le personnel de laboratoire est la principale source de cette contamination. C’est toujours une préoccupation dans la salle de culture cellulaire car le mycoplasme est un petit micro-organisme à croissance lente dépourvu d’une paroi cellulaire rigide qui peut passer à travers des filtres de 0,45 μm⁴. Des études montrent que l’incidence de la contamination par les mycoplasmes est de 15 % à 35 % des lignées cellulaires humaines ou animales^{continues 4}. En outre, les statistiques indiquent qu’environ 5% à 30% des lignées cellulaires mondiales sont contaminées par des mycoplasmes⁶. Malheureusement, les mycoplasmes sont résistants à la plupart des antibiotiques utilisés pour la culture cellulaire, et l’infection peut affecter la physiologie cellulaire et le métabolisme ^4,6. Bien que la contamination ne ralentisse pas le métabolisme cellulaire, elle peut contaminer le produit final⁶. Les infections peuvent persister sans que les membres du laboratoire ne remarquent les dommages cellulaires. Si la contamination se produit, le coût de la décongélation de nouvelles cellules, le temps passé à propager les nouvelles cultures, les milieux coûteux qui ont été gaspillés, la décontamination des incubateurs et le temps que les collègues passent à attendre pour recommencer leurs expériences sont énormes. Notre laboratoire estime que le temps perdu total représente 2 semaines et le coût total associé à la contamination d’une expression typique de protéines de cellules de mammifères humains de 8 L est de 1 400 $. Les pratiques et les techniques décrites dans ce manuscrit offrent de bonnes mesures préventives pour atténuer les coûts supplémentaires, les cellules perdues et les temps d’arrêt.

Les modifications de ces pratiques ne sont pas recommandées. Tous les membres du laboratoire devraient être formés avant de travailler dans la salle de culture cellulaire, puis recevoir une formation de recyclage chaque année⁷. Les membres du laboratoire devraient également organiser la salle de culture cellulaire de manière à ce que toutes les fournitures nécessaires soient dans une seule zone, minimisant ainsi la nécessité pour les membres du laboratoire de quitter la salle de culture cellulaire à la recherche de fournitures.

Les limites des techniques présentées sont observées si la contamination provient de sources externes telles que le sérum, les incubateurs, les autoclaves défectueux, les blouses de laboratoire sales ou la source des cellules. Le dépannage de la technique peut être nécessaire si la contamination se produit malgré le strict respect de ce protocole. De nombreux facteurs externes peuvent contribuer à ce type de contamination. Les membres du laboratoire doivent être prudents et vérifier les sources externes. Par exemple, le lot de sérum fœtal bovin (FBS) acheté auprès du fournisseur peut avoir été contaminé par des mycoplasmes. Par rapport aux années 1950, c’est maintenant un événement rare, mais cela peut encore arriver⁶. Toutes les bouteilles de média doivent être jetées si une contamination est remarquée, et le protocole doit être redémarré en décongelant de nouvelles cellules et en utilisant de nouveaux médias. La contamination peut déjà avoir été présente à l’intérieur de l’incubateur s’il s’agit de moisissures ou de bactéries; Les autres flacons à l’intérieur du même incubateur doivent être vérifiés pour voir si une croissance bactérienne ou de moisissure est observée. Tous les flacons contaminés doivent être jetés et l’incubateur décontaminé. Si aucune contamination n’est trouvée, l’autoclave doit être vérifié pour détecter les erreurs de dysfonctionnement; La verrerie n’a peut-être pas été autoclavée correctement en premier lieu. Le ruban de l’autoclave peut changer de couleur même si l’autoclave n’atteint pas 121 °C. Par la suite, les dates de péremption des solutions antibiotiques utilisées doivent être vérifiées; Il peut être nécessaire d’acheter de nouvelles solutions. Enfin, la source des cellules doit être prise en compte; Provenaient-ils d’un fournisseur de laboratoire de confiance ou empruntaient-ils à un autre laboratoire? Les cellules doivent toujours être achetées auprès d’un fournisseur de laboratoire de confiance et ne doivent jamais être empruntées auprès d’un autre laboratoire. Enfin, les sarraus de laboratoire doivent être lavés pour assurer leur propreté¹⁹. La décontamination des incubateurs doit être envisagée chaque fois qu’un ballon a été contaminé. Les cellules bactériennes ou les spores de moisissures ne doivent pas se multiplier et continuer à propager la contamination.

Les méthodes existantes reflètent l’élimination de la contamination. Les méthodes décrites dans ce manuscrit sont axées sur la prévention plutôt que sur l’élimination de la contamination. Plusieurs procédures existent concernant l’utilisation d’antibiotiques pour éliminer les mycoplasmes²⁰. Cependant, l’utilisation d’antibiotiques est risquée car ils peuvent ne pas éliminer complètement l’infection et « peuvent permettre à des organismes résistants de se développer »¹². En fait, « 72 % des cultures cultivées en continu dans des antibiotiques se sont révélées positives pour les mycoplasmes, tandis que seulement 7 % cultivées en l’absence d’antibiotiques ont été infectées »¹². Ces données soulignent l’idée que, bien que l’utilisation d’antibiotiques soit recommandée et puisse être utile, la surutilisation ou la dépendance totale aux antibiotiques n’est pas bénéfique. De plus, l’utilisation d’antibiotiques pour éliminer la contamination ne peut que permettre au problème de persister. Les solutions antibiotiques ne sont pas nécessaires; Si les techniques décrites dans le présent document sont suivies, la contamination devrait être évitée avec succès.

Les pratiques et techniques décrites dans ce manuscrit peuvent être utilisées à l’avenir pour maintenir un environnement aseptique lors de l’exécution du test mensuel des mycoplasmes et lors de la fabrication de cellules bactériennes compétentes faites maison. Les deux protocoles nécessitent un environnement propre, similaire au travail de culture cellulaire, afin que le produit final ne soit pas contaminé.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DPBS	Gibco	14-190-144
DMEM F-12 Media	ATCC	30-2006
Fiole à chicanes en verre	Pyrex  ;	09-552-40
Pipettes en verre	Fisher  ;	13-678-6B
Aide à la pipette	Drummond	13-681-15A  ;
Pipette sérologique	Corning	07-200-573
Fiole T75	Corning	07-202-004
Trypsine	Gibco	25-300-054
*Les articles peuvent varier car cette vidéo traite des techniques

générales de culture cellulaire