Un protocole est présenté pour l’isolement et l’enrichissement pratiques et à haut débit des trichomes glandulaires et sessiles de Cannabis sativa. Le protocole est basé sur une extraction sèche et non tampon des trichomes en utilisant uniquement de l’azote liquide, de la glace sèche et des tamis en nylon et convient à l’extraction d’ARN et à l’analyse transcriptomique.
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Article de méthode
Isolement non aqueux et enrichissement des trichomes glandulaires et sessiles de Cannabis sativa
Dans cet article
Résumé
Résumé
Cet article présente un protocole pour l’isolement et l’enrichissement pratiques et à haut débit des trichomes glandulaires et sessiles de Cannabis sativa. Les voies de biosynthèse pour le métabolisme des cannabinoïdes et des terpènes volatils sont localisées principalement dans les trichomes de cannabis , et les trichomes isolés sont bénéfiques pour l’analyse du transcriptome. Les protocoles existants pour isoler les trichomes glandulaires pour la caractérisation transcriptomique sont peu pratiques et fournissent des têtes de trichomes compromises et une quantité relativement faible de trichomes isolés. De plus, ils s’appuient sur des appareils coûteux et des milieux d’isolement contenant des inhibiteurs de protéines pour éviter la dégradation de l’ARN. Le protocole actuel suggère de combiner trois modifications individuelles pour obtenir une grande quantité de trichomes glandulaires et de trichomes sessiles isolés à partir d’inflorescences femelles matures et de feuilles en éventail, respectivement. La première modification consiste à substituer l’azote liquide au milieu isolant conventionnel pour faciliter le passage des trichomes à travers les micro-tamis. La deuxième modification consiste à utiliser de la glace sèche pour détacher les trichomes de la source végétale. La troisième modification consiste à faire passer le matériel végétal consécutivement à travers cinq micro-tamis de taille décroissante des pores. L’imagerie microscopique a démontré l’efficacité de la technique d’isolement pour les deux types de trichomes. De plus, la qualité de l’ARN extrait des trichomes isolés était appropriée pour l’analyse transcriptomique en aval.
Introduction
Les trichomes glandulaires sont des structures ressemblant à des cheveux présentes dans les plantes qui contiennent de nombreux métabolites secondaires1 et représentent une banque précieuse de nouveaux gènes et enzymes biosynthétiques2. Dans le cannabis, la biosynthèse des métabolites secondaires importants, cannabinoïdes3 et terpènes4, est localisée dans les trichomes. Compte tenu du rôle des trichomes dans la détermination de la qualité du cannabis à des fins médicinales et récréatives, l’étude de l’expression des gènes des trichomes est intéressante. Pour caractériser l’expression des gènes spécifiques aux trichomes, les trichomes d’intérêt doivent d’abord être isolés. Les protocoles d’isolement des trichomes ont été décrits pour la première fois dès 19925, et leurs derniers développements ont été récemment examinés2. En général, les protocoles d’extraction des trichomes glandulaires pour la caractérisation transcriptomique peuvent être divisés en deux étapes séquentielles distinctes. La première étape implique une séparation physique complète des trichomes du tissu végétal. Cette étape peut être réalisée en utilisant de la glace sèche5, des billes de verre avec un appareil commercial6,7, en broyant le matériel végétal contre un tamis à mailles8, ou en tourbillonnant le tissu végétal dans un tampon d’isolement9. La deuxième étape consiste à séparer plus finement les trichomes d’intérêt des résidus de plantes microscopiques et/ou d’autres types de trichomes. Cette étape peut être exécutée en utilisant la centrifugation à gradient de densité 8,10 ou des tamis de différentes tailles 7,9. En raison de l’extrême sensibilité de l’ARN dans les tissus traités aux agents dégradants, ces deux étapes séquentielles sont généralement conduites dans le milieu d’isolement glacé, souvent en présence d’inhibiteurs de protéines4.
Les protocoles conventionnels d’isolement des trichomes nécessitent, en plus des températures glaciales, de grandes quantités de milieu d’isolement pour assurer une procédure d’extraction efficace. La combinaison de ces composants entraîne un processus d’isolation long et fastidieux qui entrave un débit élevé. La présentation d’un protocole alternatif simple et convivial d’isolement des trichomes est donc susceptible d’être bénéfique pour divers aspects associés à la caractérisation des trichomes. Le présent article vise à offrir un protocole alternatif pour isoler les trichomes de tête glandulaires pédonculés et sessiles de Cannabis sativa en combinant et en intégrant plusieurs éléments des protocoles conventionnels. Ces éléments comprennent la glace carbonique5, le passage des trichomes à travers plusieurs micro-tamis avec des pores de taille décroissante7,9, et la substitution de l’azote liquide (LN) au milieu isolant8.
La nouveauté du protocole actuel d’isolement des trichomes, par rapport aux protocoles conventionnels, se présente de plusieurs façons. Ce protocole est pratique, car il ne nécessite pas de composants dangereux. La procédure peut être effectuée en laboratoire avec un minimum de précautions et facilite un débit élevé. La substitution du LN au milieu d’isolation liquide standard garantit l’intégrité des trichomes tout au long du processus d’isolement, ce qui permet une analyse transcriptomique ultérieure. Lors de la sublimation du LN et de la glace sèche, les trichomes isolés sont laissés exempts de résidus nocifs. De plus, la propension du LN à se sublimer à température ambiante permet son utilisation généreuse tout au long du protocole. En revanche, l’utilisation de grands volumes de milieu isolant conventionnel génère des difficultés pratiques dans sa manipulation. Enfin, le protocole diminue la séparation de la cellule discale de la structure de tête fragile restante du trichome glandulaire, permettant la rétention du contenu de l’espace de tête.
Ce protocole est présenté étape par étape détaillée pour faciliter la pratique technique d’isolement des trichomes à tête glandulaire de C. sativa. Le protocole fournit un flux de travail gérable qui se traduit par des trichomes isolés avec une concentration et une pureté élevées qui sont appropriés pour l’analyse moléculaire en aval.
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Protocole
NOTE: Le matériel végétal utilisé dans cette étude consistait en quatre souches de C. sativa ARO-Volcani (CS-11, CS-12, CS-13 et CS-14) qui ont été cultivées dans le Volcani Center, Israël, comme décrit ailleurs11. Les trichomes à tige de capitate glandulaire ont été isolés à partir d’inflorescences à fleurs matures, et les trichomes sessiles glandulaires capitates ont été isolés à partir de grandes feuilles en éventail de plantes mères matures non florifères. Tout le matériel végétal a été fraîchement cueilli et immédiatement stocké à −80 °C.
ATTENTION : La glace sèche et le LN sont utilisés tout au long du protocole. Ces substances sont extrêmement dangereuses. Les trichomes isolés peuvent contenir des particules de glace sèche qui peuvent créer une pression de gaz dangereuse lorsqu’elles sont insérées dans des tubes scellés; Par conséquent, tous les capuchons doivent être perforés à l’aiguille. L’utilisation de lunettes de protection, de vêtements de laboratoire appropriés et de gants pour la manipulation à des températures extrêmement basses est fortement conseillée.
1. Configuration pour la séparation initiale des trichomes du matériel végétal
- Écraser un bloc de glace carbonique en petits flocons fins à l’aide d’un marteau et d’un objet plat dur dans un récipient en plastique de 5 L.
- Tamiser les fines lamelles de glace carbonique (inférieures à 5 mm) de la glace sèche non broyée avec une grande passoire (via des pores inférieurs à 5 mm) dans un autre récipient en plastique de 5 L. Verser environ 200 cm3 (marque de 200 ml) des flocons de glace carbonique dans un bécher en verre vertical de 1 L.
- Ajouter jusqu’à 10 g d’inflorescences congelées de C. sativa (désormais appelées matières végétales) sur la première couche de glace sèche broyée et couvrir d’une couche supplémentaire de 200cm3 de glace sèche finement broyée.
- Couvrir l’ouverture du bécher en verre de 1 L avec deux à trois couches de moustiquaire de porte moustiquaire de 1 mm et la fixer sur les côtés extérieurs de la tasse en verre à l’aide d’élastiques (Figure 1).
- Versez le LN dans un grand récipient en acier inoxydable à fond rond (voir le tableau des matériaux), où les trichomes isolés seront recueillis.
- Insérez une maille de 350 μm dans une passoire à tamis à farine pour couvrir la maille du tamis de farine par le bas (figure 2). Si un tamis à farine muni d’un anneau en plastique amovible est disponible, insérer le treillis de 350 μm de manière à ce qu’il soit fixé sous le filet du tamis à farine. Sinon, fixez la maille de 350 μm à la circonférence du tamis à farine avec des élastiques.
- Placez le tamis à farine au-dessus du grand récipient en acier inoxydable à fond rond rempli de LN (figure 3). Assurez-vous que la largeur du contenant dépasse celle du tamis à farine afin de minimiser la perte de la masse tamisée à l’extérieur du récipient en acier inoxydable à fond rond.
2. Séparation des trichomes du matériel végétal
- Secouez le verre de 1 L avec son ouverture dirigée vers le bas vers le tamis à farine comme si vous utilisiez une grande salière (figure 4).
- Mettez de côté le bécher en verre de 1 L toutes les 2-3 minutes pour permettre le tamisage de la glace sèche broyée et de la matière végétale accumulée sur le tamis de farine.
- Tamiser le tamis à farine horizontalement pour faciliter le passage de la matière végétale dans le LN dans le récipient en acier inoxydable à fond rond situé en dessous.
- Ajouter du LN au récipient en acier inoxydable et de la glace sèche pilée au bécher en verre de 1 L lorsque leurs niveaux sont faibles. Reconstituer le matériel végétal usagé dans le bécher en verre avec 10 g supplémentaires de matériel végétal frais lorsque le matériel végétal sur le tamis à farine est épuisé. Le réapprovisionnement ne doit généralement pas être répété plus de deux fois.
- Répéter les étapes 2.1-2.4 jusqu’à ce qu’une quantité suffisante de trichomes enrichis ait été recueillie dans le récipient en acier inoxydable à fond rond. En général, 20 g de matériel végétal frais suffisent pour l’extraction de l’ARN et l’analyse du transcriptome.
- Vérifiez qu’il y a une substance blanche semblable à de la poudre (composée de débris végétaux, de trichomes glandulaires et de glace sèche pilée) au fond du récipient en acier inoxydable immergé dans le LN. Une observation microscopique aidera à déterminer si une quantité suffisante de trichomes a été recueillie; Cependant, cette étape peut entraver le flux du protocole. Habituellement, 10 à 20 g de matériel végétal initial suffisent pour la plupart des isolements; Cependant, il peut y avoir des différences dans la densité des trichomes des plantes.
REMARQUE: À partir de ce point, l’expérience peut être interrompue et redémarrée ultérieurement. En cas de pause pendant une courte période, des quantités adéquates de LN doivent être ajoutées afin que les trichomes restent submergés. Alternativement, les trichomes peuvent être collectés et stockés à -80 ° C jusqu’à 3 mois pour une utilisation ultérieure, comme décrit à l’étape 5.
3. Séparation des trichomes glandulaires (tiges et sessiles) des autres types de trichomes, tels que les trichomes bulbeux et cystolithiques, et les débris
- Ajouter une petite quantité de LN dans un petit récipient en acier inoxydable propre à fond rond.
- Pliez deux fois un micro-tamis de 40 cm x 40 cm avec un maillage de 150 μm pour obtenir un pli de 20 cm x 20 cm et ouvrez-le. Assurez-vous qu’il ressemble à une forme de cône (Figure 5).
- Fixez le cône en maille au bord du récipient en acier inoxydable à fond rond avec une ou deux épingles à linge de sorte que la partie ouverte du cône soit verticale et que sa partie pointue soit partiellement immergée dans le LN.
- Verser doucement le LN et la substance blanche semblable à de la poudre de l’étape 2.6 dans le cône de micro-tamis.
- Appliquez délicatement une brosse large pour rassembler et transférer tout matériel végétal restant du premier récipient dans le cône de maille de 150 μm.
- Ajouter plus de LN au premier récipient et répéter le mouvement de brossage jusqu’à ce que tout le matériel végétal soit transféré dans le cône de micro-tamis.
- Détachez soigneusement la pince à linge du couvercle du récipient et ouvrez le cône de micro-tamis de sorte que les trichomes soient situés au milieu du micro-tamis ouvert. Maintenez les quatre coins du microtamis ensemble de manière à ce que la partie centrale contenant les trichomes reste immergée dans le LN (Figure 6).
- Tout en tenant les quatre coins du micro-tamis, trempez et secouez doucement le micro-tamis dans le LN dans le récipient en acier comme si vous infuseriez un sachet de thé. Continuez ce mouvement de trempage/agitation (verticale et horizontale) pendant 1 min. Il y a un compromis entre la qualité de l’isolation et la quantité. Des mouvements de trempage plus longs peuvent entraîner de plus grandes quantités de trichomes, mais leur degré d’isolement peut être plus faible. Dans l’ensemble, 1 min est recommandé comme suffisant pour la qualité et la quantité.
REMARQUE: Ce mouvement de tamisage est la partie la plus critique du protocole et doit être exécuté en conséquence. - Facultatif : Prélever les débris végétaux non tamisés et les trichomes plus gros (encore immergés dans le LN) qui sont enveloppés au centre du microtamis dans un tube à essai de 13 ml ou 50 ml, et conserver à −80 °C pour une utilisation ultérieure.
ATTENTION : Pour éviter l’accumulation de gaz sous pression (provenant de la glace sèche et des résidus de LN), percez un trou dans le bouchon du tube à essai à l’aide d’une aiguille stérilisée. Le bouchon peut être remplacé une fois que la pression a diminué, ce qui est généralement après 24 h.
4. Passage des trichomes à travers des micro-tamis de taille de pores décroissante
- Transférer séquentiellement les trichomes tamisés immergés dans le LN au fond du petit récipient en acier inoxydable à fond rond à travers des micro-tamis dont la taille des pores est décroissante (105 μm, 80 μm, 65 μm et 50 μm), de la même manière que celle présentée à l’étape 3.
5. Collecte des trichomes souhaités
- Retirez les trichomes désirés immergés dans le LN et enveloppez-les dans le micro-tamis de 50 μm à l’aide d’une cuillère pré-refroidie (dans LN). Placez-les sur une assiette propre.
REMARQUE: Dans cette dernière étape d’isolement, les trichomes souhaités sont collectés à partir du tamis. - Transférer rapidement les trichomes en poudre dans un tube pré-refroidi étiqueté de 1,5 ml à l’aide d’une spatule prérefroidie ou d’une cuillère insérée dans le tube (Figure 7). Conserver immédiatement les tubes à −80 °C pour d’autres études.
Remarque : Un diagramme de flux de travail schématique illustrant l’ensemble du protocole d’isolation est donné à la figure 8.
6. Observation et analyse des trichomes purifiés
- Placez une petite quantité (10 mg) de trichomes isolés sur une lame de microscope à l’aide d’une spatule pré-refroidie (via LN). Ajoutez une goutte d’eau et observez directement au microscope optique sans tacher. Évaluer le degré global d’isolement et de contamination à l’aide d’un grossissement faible (10x) et élevé (40x). L’enrichissement est estimé visuellement par la quantité relative de trichomes par rapport aux tissus non trichomes, comme le montre la figure 9.
- Effectuer l’extraction de l’ARN et l’analyse de la qualité à partir de 50 mg de trichomes isolés à tige glandulaire et de trichomes sessiles de C. sativa.
REMARQUE : Une trousse d’extraction commerciale (voir le tableau des matériaux) utilisant une stratégie de purification de l’ARNm basée sur le poly-A a été utilisée pour l’extraction de l’ARN.- Resuspendre 50 mg des trichomes isolés dans la solution de lyse, vortex pendant 30 s, soniquer dans une unité de nettoyage à ultrasons glacé à 35 kHz pendant 5 minutes et extraire l’ARNm des échantillons selon le protocole du fabricant (voir le tableau des matériaux).
- Pour estimer l’intégrité de l’ARN extrait des trichomes, déterminez la concentration d’ARN, la quantité totale et les valeurs du nombre d’intégrité de l’ARN (RIN) à l’aide d’un système de laboratoire sur puce (voir le tableau des matériaux).
- Effectuer une analyse RNAseq des fractions de trichomes (facultatif). L’analyse RNAseq et les analyses bioinformatiques des lectures séquencées peuvent être effectuées par des services d’externalisation standard
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Résultats
La principale modification incluse dans ce protocole par rapport aux protocoles conventionnels d’isolement de trichomes est de remplacer le milieu d’isolement standard par LN. L’utilisation du LN comme milieu d’isolement permet un flux de travail détendu, car tant que les échantillons sont immergés dans le LN, il est peu probable qu’une dégradation métabolique se produise. De plus, comme le protocole évite les composants dangereux (c.-à-d. l’acide aurintricarboxylique et le β-mercaptoéthanol) utilisés dans les milieux d’...
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Discussion
Par rapport aux protocoles d’isolement des trichomes actuellement disponibles, deux modifications principales sont décrites dans le présent protocole. Il s’agit notamment du détachement des trichomes du matériel végétal à l’aide de glace sèche à l’étape initiale et de la substitution du LN au milieu tampon liquide couramment utilisé. La première modification pour la purification des trichomes de C. sativa est basée sur un protocole antérieur qui a introduit l’utilisation de glace sèche pilée pour détacher les tr...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Les auteurs reconnaissent le soutien financier de CannabiVar Ltd. Tout le matériel végétal a été généreusement fourni par le professeur Hinanit Koltai du Volcani Center, en Israël.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Bioanalyseur ARN Pico 6000 puce | Agilent, Allemagne | Réapprovisionnement numéro 5067-1513 | Système de laboratoire sur puce ; |
| Transsonic-310 | Elma, Allemagne | D-78224 | Unité de nettoyage par ultrasons ; |
| TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 | Illumina, USA | RS-122-2001 | Préparation d’échantillons pour la bibliothèque de séquençage d’ARN |
| Spectrum Plant Total RNA Kit ; | SIGMA-ALDRICH, ÉTATS-UNIS | STRN50-1KT | Kit d’ARN total pour plantes ; |
| Micro-tamis en nylon avec une taille de maille de 350 & micro ; m (40 x 40 cm ou plus grand que la circonférence du tamis à farine) | Sinun Tech, Israël | r0350n350210 | Nylon ; ouverture de l’écran |
| Micro-tamis en nylon avec maille de 150 & micro ; m (taille de 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israël | r0150n360465 | Nylon ; ouverture de l’écran |
| Micro-tamis en nylon avec maille o 105 & micro ; m (taille de 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israël | r0105n320718 | Nylon ; ouverture de l’écran |
| Micro-tamis en nylon avec taille de maille o 80 & micro ; m (taille de 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israël | r0080n370465 | Nylon ; ouverture de l’écran |
| Micro-tamis en nylon avec taille de maille o 65 & micro ; m (taille de 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israël | r0065n340715 | Nylon ; ouverture de l’écran |
| Micro-tamis en nylon avec taille de maille o 50 & micro ; m (taille de 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israël | r0080n370465 | Nylon ; Ouverture |
| de l’écran Jusqu’à 10 g de matière végétale congelée (stockée dans -80 oC ou azote liquide) | |||
| Gants adaptés à la manipulation de basses températures | |||
| Lunettes | |||
| Porte moustiquaire de 1 mm (moustiquaire) maille (bande de 30 x 100 cm) | |||
| Grande passoire (passoire) avec trous d’environ 5 mm | |||
| 1 L de bécher | |||
| en verre 1 bloc de glace sèche (0,5-1 kg) | |||
| Marteau et objet dur et plat | |||
| Deux récipients | |||
| Élastiques | |||
| Grand tamis à farine ou passoire - de préférence un avec un anneau en plastique amovible sur la circonférence | |||
| Plusieurs grands et petits récipients à fond rond en acier inoxydable. L’un d’eux doit être plus grand que la circonférence du tamis à farine (environ 40 cm de diamètre), afin de minimiser la perte de masse tamisée à l’extérieur du récipient | |||
| Cuiller, spatule et pelle en acier inoxydable pré-refroidi (via de l’azote liquide), spatule | |||
| Assiette | |||
| Plusieurs pinces | |||
| à lingeTubes de 1,5 mL étiquetés pré-refroidis (via de l’azote liquide) avec trous percés sur le couvercle avec une aiguille | |||
| Deux récipients d’azote | |||
| Pinceau |
Références
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Réimpressions et autorisations
