Un protocole est présenté pour l’isolement et l’enrichissement pratiques et à haut débit des trichomes glandulaires et sessiles de Cannabis sativa. Le protocole est basé sur une extraction sèche et non tampon des trichomes en utilisant uniquement de l’azote liquide, de la glace sèche et des tamis en nylon et convient à l’extraction d’ARN et à l’analyse transcriptomique.
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Article de méthode
Isolement non aqueux et enrichissement des trichomes glandulaires et sessiles de Cannabis sativa
Dans cet article
Résumé
Résumé
Cet article présente un protocole pour l’isolement et l’enrichissement pratiques et à haut débit des trichomes glandulaires et sessiles de Cannabis sativa. Les voies de biosynthèse pour le métabolisme des cannabinoïdes et des terpènes volatils sont localisées principalement dans les trichomes de cannabis , et les trichomes isolés sont bénéfiques pour l’analyse du transcriptome. Les protocoles existants pour isoler les trichomes glandulaires pour la caractérisation transcriptomique sont peu pratiques et fournissent des têtes de trichomes compromises et une quantité relativement faible de trichomes isolés. De plus, ils s’appuient sur des appareils coûteux et des milieux d’isolement contenant des inhibiteurs de protéines pour éviter la dégradation de l’ARN. Le protocole actuel suggère de combiner trois modifications individuelles pour obtenir une grande quantité de trichomes glandulaires et de trichomes sessiles isolés à partir d’inflorescences femelles matures et de feuilles en éventail, respectivement. La première modification consiste à substituer l’azote liquide au milieu isolant conventionnel pour faciliter le passage des trichomes à travers les micro-tamis. La deuxième modification consiste à utiliser de la glace sèche pour détacher les trichomes de la source végétale. La troisième modification consiste à faire passer le matériel végétal consécutivement à travers cinq micro-tamis de taille décroissante des pores. L’imagerie microscopique a démontré l’efficacité de la technique d’isolement pour les deux types de trichomes. De plus, la qualité de l’ARN extrait des trichomes isolés était appropriée pour l’analyse transcriptomique en aval.
Introduction
Les trichomes glandulaires sont des structures ressemblant à des cheveux présentes dans les plantes qui contiennent de nombreux métabolites secondaires1 et représentent une banque précieuse de nouveaux gènes et enzymes biosynthétiques2. Dans le cannabis, la biosynthèse des métabolites secondaires importants, cannabinoïdes3 et terpènes4, est localisée dans les trichomes. Compte tenu du rôle des trichomes dans la détermination de la qualité du cannabis à des fins médicinales et récréatives, l’étude de l’expression des gènes des trichomes est intéressante. Po....
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Protocole
NOTE: Le matériel végétal utilisé dans cette étude consistait en quatre souches de C. sativa ARO-Volcani (CS-11, CS-12, CS-13 et CS-14) qui ont été cultivées dans le Volcani Center, Israël, comme décrit ailleurs11. Les trichomes à tige de capitate glandulaire ont été isolés à partir d’inflorescences à fleurs matures, et les trichomes sessiles glandulaires capitates ont été isolés à partir de grandes feuilles en éventail de plantes mères matures non florifères. Tout le matériel végétal a été fraîchement cueilli et immédiatement stocké à −80 °C.
ATTENTION : La glace sèche et le LN sont utilisés tout au long du....
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Résultats
La principale modification incluse dans ce protocole par rapport aux protocoles conventionnels d’isolement de trichomes est de remplacer le milieu d’isolement standard par LN. L’utilisation du LN comme milieu d’isolement permet un flux de travail détendu, car tant que les échantillons sont immergés dans le LN, il est peu probable qu’une dégradation métabolique se produise. De plus, comme le protocole évite les composants dangereux (c.-à-d. l’acide aurintricarboxylique et le β-mercaptoéthanol) utilisés dans les milieux d’.......
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Discussion
Par rapport aux protocoles d’isolement des trichomes actuellement disponibles, deux modifications principales sont décrites dans le présent protocole. Il s’agit notamment du détachement des trichomes du matériel végétal à l’aide de glace sèche à l’étape initiale et de la substitution du LN au milieu tampon liquide couramment utilisé. La première modification pour la purification des trichomes de C. sativa est basée sur un protocole antérieur qui a introduit l’utilisation de glace sèche pilée pour détacher les tr.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Les auteurs reconnaissent le soutien financier de CannabiVar Ltd. Tout le matériel végétal a été généreusement fourni par le professeur Hinanit Koltai du Volcani Center, en Israël.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Bioanalyseur ARN Pico 6000 puce | Agilent, Allemagne | Réapprovisionnement numéro 5067-1513 | Système de laboratoire sur puce ; |
| Transsonic-310 | Elma, Allemagne | D-78224 | Unité de nettoyage par ultrasons ; |
| TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 | Illumina, USA | RS-122-2001 | Préparation d’échantillons pour la bibliothèque de séquençage d’ARN |
| Spectrum Plant Total RNA Kit ; | SIGMA-ALDRICH, ÉTATS-UNIS | STRN50-1KT | Kit d’ARN total pour plantes ; |
| Micro-tamis en nylon avec une taille de maille de 350 & micro ; m (40 x 40 cm ou plus grand que la circonférence du tamis à farine) | Sinun Tech, Israël | r0350n350210 | Nylon ; ouverture de l’écran |
| Micro-tamis en nylon avec maille de 150 & micro ; m (taille de 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israël | r0150n360465 | Nylon ; ouverture de l’écran |
| Micro-tamis en nylon avec maille o 105 & micro ; m (taille de 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israël | r0105n320718 | Nylon ; ouverture de l’écran |
| Micro-tamis en nylon avec taille de maille o 80 & micro ; m (taille de 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israël | r0080n370465 | Nylon ; ouverture de l’écran |
| Micro-tamis en nylon avec taille de maille o 65 & micro ; m (taille de 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israël | r0065n340715 | Nylon ; ouverture de l’écran |
| Micro-tamis en nylon avec taille de maille o 50 & micro ; m (taille de 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israël | r0080n370465 | Nylon ; Ouverture |
| de l’écran Jusqu’à 10 g de matière végétale congelée (stockée dans -80 oC ou azote liquide) | |||
| Gants adaptés à la manipulation de basses températures | |||
| Lunettes | |||
| Porte moustiquaire de 1 mm (moustiquaire) maille (bande de 30 x 100 cm) | |||
| Grande passoire (passoire) avec trous d’environ 5 mm | |||
| 1 L de bécher | |||
| en verre 1 bloc de glace sèche (0,5-1 kg) | |||
| Marteau et objet dur et plat | |||
| Deux récipients | |||
| Élastiques | |||
| Grand tamis à farine ou passoire - de préférence un avec un anneau en plastique amovible sur la circonférence | |||
| Plusieurs grands et petits récipients à fond rond en acier inoxydable. L’un d’eux doit être plus grand que la circonférence du tamis à farine (environ 40 cm de diamètre), afin de minimiser la perte de masse tamisée à l’extérieur du récipient | |||
| Cuiller, spatule et pelle en acier inoxydable pré-refroidi (via de l’azote liquide), spatule | |||
| Assiette | |||
| Plusieurs pinces | |||
| à lingeTubes de 1,5 mL étiquetés pré-refroidis (via de l’azote liquide) avec trous percés sur le couvercle avec une aiguille | |||
| Deux récipients d’azote | |||
| Pinceau |
Références
- Schilmiller, A. L., Last, R. L., Pichersky, E. Harnessing plant trichome biochemistry for the production of useful compounds. Plant Journal for Cell & Molecular Biology. 54 (4), 702-709 (2008).
- Liu, Y., Jing, S. X., Luo, S. H., Li, S. H.
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Réimpressions et autorisations
