Article de méthode

Étude de la méthylation des protéines arginine : approches et méthodes

DOI :

10.3791/64821

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20 janvier 2023

1Pharmacology and Toxicology and Structural Genomics Consortium, University of Toronto

Dans cet article

Résumé

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ARTICLES DISCUTÉS :

Hutchinson, A., Seitova, A. Production de protéines PRMT recombinantes à l’aide du système de vecteurs d’expression du baculovirus. Journal des expériences visualisées. (173), DOI : 10.3791/62510 (2021).

Maniaci, M., Marini, F., Massignani, E., Bonaldi, T. Une approche protéomique basée sur la spectrométrie de masse pour l’analyse globale et à haut niveau de confiance de la R-méthylation des protéines. Journal des expériences visualisées. (182), DOI : 10.3791/62409 (2022).

Habisch, H., Zhang, F., Zhou, Q., Madl, T. Exploration du méthylome d’arginine par spectroscopie par résonance magnétique nucléaire. Journal des expériences visualisées. (178), DOI : 10.3791/63245 (2021).

Szewczyk, M. M., Vu, V., Barsyte-Lovejoy, D. Méthodes quantitatives pour étudier l’activité de la protéine arginine méthyltransférase 1-9 dans les cellules. Journal des expériences visualisées. (174), DOI : 10.3791/62418 (2021).

Poulard, C., Jacquemetton, J., Valantin, J., Treilleux, I., Le Romancer, M. Le test de ligature de proximité permet la détection, la localisation et la quantification de la méthylation de la protéine arginine dans les tissus fixés. Journal des expériences visualisées. (185), DOI : 10.3791/64294 (2022).

Éditorial

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La méthylation de la protéine arginine est une modification post-traductionnelle qui est impliquée dans la régulation d’un large spectre de processus biologiques 1,2,3. Les neuf membres de la famille des protéines arginine méthyltransférases (PRMT) peuvent méthyler les arginines de manière monométhylique et diméthylique symétrique ou asymétrique. La compréhension des conséquences fonctionnelles et le catalogage des substrats méthylés des PRMT ont considérablement fait progresser la compréhension des enzymes PRMT et facilité leur lien avec la maladie2. De plus, le développement d’inhibiteurs puissants et sélectifs a permis des approches basées sur la biologie chimique pour étudier les PRMT et a accéléré le développement clinique des agents ciblant les PRMT3. Au fur et à mesure que le domaine des PRMT progresse, de nouvelles méthodes et leurs applications permettront d’élucider davantage la régulation et la biologie de ces enzymes.

Dans cette collection de méthodes, un article sur la production recombinante des protéines PRMT fournit un compte rendu détaillé d’un système d’expression basé sur un baculovirus4. Plusieurs PRMT peuvent être générés en utilisant l’expression bactérienne ; cependant, les PRMTs dépendants plus grands ou complexes tels que PRMT7 ou PRMT5 nécessitent un système d’expression cellulaire d’insecte. Cette méthode a déjà bénéficié de nombreux efforts in vitro pour déterminer les substrats des PRMT.

L’étude des substrats PRMT dans l’environnement cellulaire nécessite des approches de détection sophistiquées. Deux articles de cette collection présentent des méthodologies distinctes qui reposent sur l’enrichissement en anticorps des arginines méthylées suivi d’une quantification par spectrométrie de masse ou d’une quantification indépendante des anticorps à l’aide de la résonance magnétique nucléaire (RMN). Plusieurs anticorps reconnaissant des états de méthylation distincts ont été développés et ont été utilisés dans des études identifiant les substrats PRMT5. La méthode de spectrométrie de masse permet l’évaluation quantitative de la méthylation de l’arginine des protéines cellulaires en utilisant le marquage métabolique, des techniques de séparation sophistiquées ultérieures et l’enrichissement en anticorps6. Plusieurs membres de la famille PRMT préfèrent les arginines méthylantes que l’on trouve dans les motifs RGG répétitifs résidant dans les régions intrinsèquement désordonnées des protéines7. La méthode basée sur la spectroscopie RMN permet de déterminer l’état et la position de méthylation de tous les dérivés de l’arginine (mono et di, symétriques et asymétriques) où ils peuvent être quantifiés de manière fiable dans des échantillons biologiques complexes8.

Enfin, pour identifier les résidus d’arginine méthylée dans des protéines spécifiques, deux articles proposent des approches basées sur le western blot et le test de ligature de proximité (PLA). Ces deux méthodes utilisent la détection basée sur les anticorps, mais diffèrent par la méthode de détection et les informations fournies. La méthode du western blot est quantitative et a été précieuse pour caractériser les sondes chimiques9. Le PLA fournit des informations sur l’emplacement spatial de l’arginine méthylée puisqu’il utilise l’anticorps protéique cible et l’anticorps générique pour la mono ou diméthyl arginine, contournant ainsi la nécessité de générer des anticorps spécifiques et peut être remarquablement utilisé sur les tissus fixés10.

Ensemble, ces diverses méthodologies permettront de découvrir des arginines méthylées dans divers systèmes cellulaires et états pathologiques, et feront progresser les connaissances fondamentales sur la fonction biologique des enzymes PRMT.

Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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D.B.L. est soutenu par le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG). Le Consortium de génomique structurelle est un organisme de bienfaisance enregistré (n° : 1097737) qui reçoit des fonds de Bayer AG, de Boehringer Ingelheim, de Bristol Myers Squibb, de Genentech, de Génome Canada par l’intermédiaire de l’Institut de génomique de l’Ontario [OGI-196], de l’entreprise conjointe EU/EFPIA/OICR/McGill/KTH/Diamond Innovative Medicines Initiative 2 [subvention EUbOPEN 875510], de Janssen, de Merck KGaA (aussi connue sous le nom de DME au Canada et aux États-Unis), de Pfizer et de Takeda.

Références

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  1. Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).
  2. Blanc, R. S., Richard, S. Arginine methylation: The coming of age. Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).
  3. Wu, Q., Schapira, M., Arrowsmith, C. H., Barsyte-Lovejoy, D. Protein arginine methylation: from enigmatic functions to therapeutic targeting. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (7), 509-530 (2021).
  4. Hutchinson, A., Seitova, A. Production of recombinant PRMT proteins using the baculovirus expression vector system. Journal of Visualized Experiments. (173), e62510(2021).
  5. Dhar, S., et al. Loss of the major Type I arginine methyltransferase PRMT1 causes substrate scavenging by other PRMTs. Scientific Reports. 3, 1311(2013).
  6. Maniaci, M., Marini, F., Massignani, E., Bonaldi, T. A mass spectrometry-based proteomics approach for global and high-confidence protein R-methylation analysis. Journal of Visualized Experiments. (182), e62409(2022).
  7. Thandapani, P., O'Connor, T. R., Bailey, T. L., Richard, S. Defining the RGG/RG motif. Molecular Cell. 50 (5), 613-623 (2013).
  8. Habisch, H., Zhang, F., Zhou, Q., Madl, T. Exploring the arginine methylome by nuclear magnetic resonance spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (178), e63245(2021).
  9. Szewczyk, M. M., Vu, V., Barsyte-Lovejoy, D. Quantitative methods to study protein arginine methyltransferase 1-9 activity in cells. Journal of Visualized Experiments. (174), e62418(2021).
  10. Poulard, C., Jacquemetton, J., Valantin, J., Treilleux, I., Le Romancer, M. Proximity ligation assay allows the detection, localization, and quantification of protein arginine methylation in fixed tissue. Journal of Visualized Experiments. (185), e64294(2022).

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Mots-clés

Recombinant PRMT ProteinsBaculovirus Expression VectorMass SpectrometryProteomics ApproachProtein R methylation AnalysisArginine MethylomeNuclear Magnetic Resonance SpectroscopyProtein Arginine Methyltransferase ActivityProximity Ligation AssayProtein DetectionTissue Quantification

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