Échafaudages d’hydrogel granulaire méthacryloyl de gélatine : fabrication de microgel à haut débit, lyophilisation, assemblage chimique et bio-impression 3D

Résumé

Cet article décrit les protocoles de fabrication de microgel méthacryloyl à haut débit à l’aide de dispositifs microfluidiques, la conversion de microgels en poudre resuspension (micro-aérogels), l’assemblage chimique de microgels pour former des échafaudages d’hydrogel granulaires et le développement de bio-encres d’hydrogel granulaires avec microporosité préservée pour la bio-impression 3D.

Résumé

L’émergence d’échafaudages d’hydrogel granulaires (SGH), fabriqués par assemblage de microparticules d’hydrogel (HMP), a permis la formation d’échafaudages microporeux in situ. Contrairement aux hydrogels en vrac conventionnels, les pores interconnectés à l’échelle microscopique du SGH facilitent l’infiltration cellulaire indépendante de la dégradation ainsi que le transfert d’oxygène, de nutriments et de sous-produits cellulaires. La gélatine modifiée par le méthacryloyl (GelMA), un biopolymère à base de protéines (photo)chimiquement réticulable contenant de l’adhésif cellulaire et des fractions biodégradables, a été largement utilisé comme biomatériau réactif aux cellules/instructif. La conversion de GelMA en vrac en GHS peut ouvrir une pléthore de possibilités pour l’ingénierie tissulaire et la régénération. Dans cet article, nous démontrons les procédures de fabrication de microgel GelMA à haut débit, de conversion en microgels secs resuspendables (micro-aérogels), de formation de SGH via l’assemblage chimique de microgels et de fabrication de bio-encre granulaire pour la bio-impression par extrusion. Nous montrons comment un traitement physico-chimique séquentiel par refroidissement et photoréticulation permet la formation d’un SGH mécaniquement robuste. Lorsque la lumière est inaccessible (par exemple, lors d’une injection de tissus profonds), les HMP GelMA réticulés individuellement peuvent être assemblés bioorthogonalement par réticulation enzymatique à l’aide de transglutaminases. Enfin, la bioimpression tridimensionnelle (3D) du SGH microporeux à faible densité de tassement HMP est démontrée par l’auto-assemblage interfacial de nanoparticules chargées hétérogènes.

Introduction

L’assemblage de blocs de construction HMP pour former des échafaudages d’ingénierie tissulaire a suscité une attention considérable au cours des dernières années¹. Les SGH, fabriqués par assemblage HMP, ont des propriétés uniques par rapport à leurs homologues en vrac, y compris la microporosité à l’échelle de la cellule provenant des espaces vides entre les blocs de construction discrets. Des propriétés supplémentaires, telles que l’injectabilité, la modularité et la rigidité découplée de la porosité, font de GHS une plate-forme prometteuse pour améliorer la réparation et la régénération^{des tissus 2}. Différents....

Protocole

REMARQUE : Consultez le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, instruments et réactifs utilisés dans ce protocole.

1. Synthèse de GelMA

REMARQUE: La synthèse de GelMA doit être effectuée dans une hotte chimique et un équipement de protection individuelle (EPI) approprié doit être utilisé tout le temps.

1. Ajouter 200 mL de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS, 1x) dans une fiole d’erlenmeyer et chauffer la solution jusqu’à ce qu’elle atteigne 50 °C. Couvrir le ballon de papier d’aluminium pour éviter l’évaporation.

Résultats

GelMA a été synthétisé par la réaction de la gélatine avec l’AM, comme présenté à la figure 1A. En adaptant les conditions de réaction, telles que la concentration d’AM, différents degrés de substitution de MA ont été obtenus. Pour quantifier le degré de substitution de l’AM, GelMA a été évalué par spectroscopie RMN ¹H (Figure 1B). Les groupes fonctionnels vinyliques avec des pics représentatifs aux changements chimiques de ~5-6 ppm ont conf.......

Discussion

La gélatine et ses dérivés sont les biomatériaux à base de protéines les plus couramment utilisés pour la fabrication de HMP. Le défi du compromis entre le débit et la monodispersité granulométrique peut être surmonté à l’aide de dispositifs microfluidiques à émulsification par étapes. Ces appareils sont capables de former plus de 40 millions de gouttelettes par heure, avec un coefficient de variation inférieur à 5%²⁷. Dans cet article, nous avons discuté de la microfabrication de gouttelettes con.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1H,1H-perfluoro-1-octanol	Alfa Aesar, MA, USA	B20156-18	Pureté de 98
Poinçon de biopsie	Integra Miltex, NY, USA	33-31A-P/25	1,5 mm Poinçon de biopsie avec système de piston
Aiguille émoussée	SANANTS	30-002-25	25 G
Bruker Avance NEO 400 MHz	400 MHz Bruker NEO, MA, USA		APPAREIL RMN Centrifugeuse
	Eppendorf, Allemagne	5415 C
Tube à centrifuger	Celltreat, MA ,USA	229423
Filtres à café	BUNN, IL, USA	20104.0006	BUNN 8-12 Filtres à café de chaque tasse, 6 chacun, 100 ct
Dessiccateur	Thermo Scientific	5311-0250	Dessiccateur sous vide Nalgene, couvercle et corps PC, 280 mm OD
Oxyde de deutérium	Sigma, MA, USA	151882
Membrane de dialyse (12-14 kDa)	Spectrum Laboratories, NJ, USA	08-667E
Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS, 1x)	Sigma, MA, USA	56064C-10L	poudre sèche, sans calcium, sans magnésium, adaptée à la culture cellulaire
Erlenmeyer flask	Corning, NY, USA	4980	Corning PYREX  ;
Ethanol	VWR, PA,	USA 89125-188	Koptec 200 proof
Flacons cryogéniques à filetage externe (cryovials)	Corning, NY, USA	430659
Lyophilisateur	Labconco, MO, USA	71042000	Équipé d’une pompe à vide (Catalog# 7587000)
Poudre de gélatine	Sigma, MA, USA	G1890-5100G	Type A de peau de porc, force du gel ~ 300 g Bloom
Glass lames de microscope	VWR, PA, USA	82027-788
Plaque chauffante	FOUR E’S SCIENTIFIC		5 pouces Agitateur magnétique à plaque chauffante Max Temp 280 ° ; C/536 ° ; F  ;
Kimwipes	Fischer scientific, MA, États-Unis	06-666
KMPR 1000 série de photorésines négatives	Kayaku Advanced Materials, MA, États-Unis		121619 KMPR1025 et KMP1035 sont inclus
LAPONITE XLG	BYK USA Inc., CT, États-Unis	2344265
Lithium phényl-2,4,6-triméthylbenzoylphosphinate (LAP)	Sigma, MA, États-Unis	900889-1G	>95 %
Luer-Lok connecteur	BD, NJ, USA	BD 302995  ;
MA/BA Gen4-Serie Mask- und Bond-Aligner	SÜ ; SS MicroTeck, Dispositif allemand		de nanofabrication
Méthacylate anhydride	Sigma, MA, USA	276685-100ML	contient 2 000  ; ppm de topanol A comme inhibiteur, 94 %
Milli-Q eau Millipore	Corporation, MA, USA	ZRQSVR5WW	résistivité électrique &asymp ; 18 M&Omega ; à 25 ° ; C, Direct-Q 5 Système de purification d’eau à distance
UV Novec 7500 fluide d’ingénierie	3M, MN, USA		3M ID  ; 7100003723
Four	VWR, PA, USA	VWR-1410	1410 Four sous vide
Parafilm	Fischer scientific, MA, USA	HS234526C
Pipette Pasteur	VWR, PA, USA	14673-010
Boîte de Pétri	VWR, PA,	USA 25384-092	polystyrène
Pico-Surf	Sphere Fluidics, UK	C022	(5 % (p/p) dans Novec 7500)
Pipette	VWR, PA, USA	89079-970
Pointes de pipette	VWR, PA, USA	87006-060
Chambre de nettoyage plasma	Harrick Plasma, NY, USA	PDC-001-HP  ;
Polydiméthylsiloxane	Dow Corning, MI, États-Unis	; 2065623	SYLGARD 184 Kit d’élastomère de silicone
Pipette à déplacement positif	Microman E M100E, Gilson, OH, USA	M100E
Plaquettes de silicium	UniversityWafer, MA, USA	452/1196	de qualité mécanique de 4 pouces
	VWR, PA, USA	231-0104	Jetable
SU-8  ;	Kayaku Advanced Materials, MA, USA
Pompe à seringue	Harvard Apparatus, MA, USA	70-2001	PHD 2000
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane	Millipore Sigma, MA, USA	448931-10G	97 %
Tubes Tygon	Saint-globain, PA, USA	AAD04103  ;
Lumière UV  ;	QUANS		Tension : 85 V-265 V AC / Puissance : 20 W
Unité de filtration sous vide	VWR, PA, USA	10040-460	0.20 µ ; m
Vortex	Fischer scientific, États-Unis	14-955-151	Mini Vortex Mixer

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