Ici, nous décrivons un protocole pour le développement d’un modèle de xénogreffe de membrane chorioallantoïde (CAM) de poussin pour le tissu ovarien humain et démontrons l’efficacité de la technique, le délai de revascularisation du greffon et la viabilité du tissu sur une période de greffe de 6 jours.
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Article de méthode
Le modèle de membrane chorioallantoïde (CAM) du poussin comme outil d’étude de la transplantation de tissu ovarien
Dans cet article
Résumé
Résumé
La cryoconservation et la transplantation de tissus ovariens sont une stratégie efficace pour préserver la fertilité, mais présentent un inconvénient majeur, à savoir une perte massive de follicules survenant peu de temps après la réimplantation en raison d’une activation folliculaire anormale et de la mort. Les rongeurs sont des modèles de référence pour l’étude de l’activation folliculaire, mais le coût, le temps et les considérations éthiques deviennent de plus en plus prohibitifs, ce qui conduit au développement d’alternatives. Le modèle de la membrane chorioallantoïde (CAM) du poussin est particulièrement attrayant, car il est peu coûteux et maintient l’immunodéficience naturelle jusqu’au 17e jour après la fécondation, ce qui le rend idéal pour étudier la xénogreffe à court terme de tissu ovarien humain. Le CAM est également très vascularisé et a été largement utilisé comme modèle pour explorer l’angiogenèse. Cela lui confère un avantage remarquable par rapport aux modèles in vitro et permet d’étudier les mécanismes affectant le processus précoce de perte de follicules post-greffe. Le protocole décrit ici vise à décrire le développement d’un modèle de xénogreffe CAM pour le tissu ovarien humain, avec des informations spécifiques sur l’efficacité de la technique, le délai de revascularisation du greffon et la viabilité du tissu sur une période de greffe de 6 jours.
Introduction
La demande de préservation de la fertilité pour des indications oncologiques et bénignes, ainsi que pour des raisons sociales, a considérablement augmenté au cours des dernières décennies. Cependant, divers traitements utilisés pour guérir les maladies malignes et non malignes sont hautement toxiques pour les gonades et peuvent entraîner une insuffisance ovarienne prématurée iatrogène, conduisant finalement à l’infertilité1. Les techniques établies pour la préservation de la fertilité comprennent la cryoconservation des embryons, la vitrification des ovocytes immatures ou matures et la cryoconservat....
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Protocole
L’utilisation de tissus humains a été approuvée par le Comité d’examen institutionnel de l’Université catholique de Louvain. Les patientes ont donné leur consentement éclairé écrit pour l’utilisation de leur tissu ovarien à des fins de recherche.
1. Commander des ovules du jour 0 qui sont très susceptibles d’être embryonnés
- Trouvez un fournisseur d’œufs blancs de Leghorn certifié et sélectionné par Lohman en laboratoire qui signale des taux élevés d’œufs embryonnés, ce qui dépend principalement de l’âge des poussins.
2. Préparation des œufs pour l’incubation
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Résultats
Taux de survie des embryons de poussins
Le taux de survie des embryons entre la fenêtrage (jour 3 de la dysfonction érectile) et la greffe de tissu ovarien (jour 7 de la dysfonction érectile) était de 79 % (33/42). Étant donné que le pourcentage d’œufs embryonnés au jour 0 est inconnu, des œufs surnuméraires au jour 0 provenant de poules blanches Leghorn sélectionnées par Lohman ont été commandés pour s’assurer qu’il y aurait suffisamment d’œufs embryonnés disponibles pour la greffe. Au total, 23 ovul.......
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Discussion
La partie la plus difficile du protocole décrit ici est de faire le petit trou nécessaire pour aspirer l’albumen afin de détacher le CAM de la coquille de l’œuf avant de créer une fenêtre. L’application d’une pression trop forte peut entraîner une pénétration excessive ou même fissurer et détruire l’œuf, causant des dommages irrévocables à la CAM et à son système vasculaire. Pour réduire au minimum les erreurs lors des premières tentatives de séparation de la CAM, il est fortement conseillé de s’entraîner à faire de peti.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les auteurs remercient Mira Hryniuk, B.A., d’avoir révisé la langue anglaise de l’article.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Aiguille hypodermique Agani, 19 G | Terumo Europe | AN*1950R1 | Aiguille 19 G pour aspirer l’albumen |
| Seringue Terumo, 5 mL Luer lock concentrique | Terumo Europe | SS*05LE1 | Seringue stérile de 5 mL |
| Caseviewer v2.2 | 3DHISTECH | Logiciel d’analyse d’images | |
| Éther diéthylique | Merck Chemicals | 603-022-00-4 | Éther stérile pour traumatiser le CAM |
| Eosin Y solution aqueuse 0,5 % | Merck | 1098441000 | Solution colorante |
| Formaldéhyde 4 % solution aqueuse tamponnée (Formalin 10 %) | VWR | 97139010 | Formaldéhyde utilisé pour la fixation des tissus |
| Réfrigérateur | Liebherr | 7081260 | Réfrigérateur à 4 ° ; C utilisé pour l’enrobage en paraffine |
| Plaque chauffante | Schott | SLK2 | Plaque chauffante utilisée pour sécher les lames |
| Incubateur | Thermo Forma Scientific 3111 | 10365156 | Four utilisé pour l’incubation des lames |
| Leica CLS 150 XE microscope Source de lumière froide | Leica | CLS 150 XE | Source de lumière froide focale pour bougie les œufs |
| Chiffon de nettoyage des lentilles, grade 541 | VWR | 111-5003 | Tissu à tremper dans de l’éther stérile pour traumatiser |
| l’hématoxyline de | Mayer MERCK | 1092491000 | Solution de coloration |
| Méthanol | VWR | 20847307 | Méthanol |
| Microtome | ThermoScientific-MICROM | HM325-2 | Microtome |
| Pannoramic P250 Flash III | 3DHISTECH | / | Scanner de lames à grossissement 20x |
| Paraformaldéhyde ; | Merck | 1,04,00,51,000 | Solution d’enrobage de paraffine |
| Paraplast Plus R | Sigma | P3683-1KG | paraffine |
| , 60x15 mm, stérile | Greiner | 628161 | Boîte de Pétri stérile |
| Porte-goupille | Fine Science Tools | 26016-12 | Porte-goupille |
| Polyhatch | Brinsea CP01F | Incubateur d’œufs avec rotateur automatique | |
| Lame de scie à chantourner, 132 mm | Sencys | / | Lame de scie pour créer une fenêtre dans la coquille d’œuf |
| Goupilles d’insertion en acier inoxydable | Fine Science Tools | 26007-02 | Goupille droite pour faire un trou dans la coquille d’œuf |
| Steril-Helios ; | Angelantoni Industrie | ST-00275400000 | Hotte à flux laminaire |
| Superfrost Plus bords rodé ; s 90° ; | VWR | 631-9483 | Diapositives en verre ; |
| Tissue-Tek VIP 6Al | Sakura | 60320417-0711 VID6E3-1 Dispositif | d’enrobage automatique |
| Pince en titane | Outils de science fine 11602-16 | Pince pour l’ablation de la coquille d’œuf et la manipulation du tissu ovarien | |
| Toluene, pa | VWR | 28701364 | Solution d’enrobage de paraffine |
Références
- Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian tissue and oocyte cryopreservation prior to iatrogenic premature ovarian insufficiency. Best Practice & Research Clinical Obstetrics & Gynaecology. 81, 119-133 (2022).
- Dolmans, M. -M., Hossay, C., Nguyen, T. Y. T., Poirot, C.
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Réimpressions et autorisations
