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Article de méthode

Visualisation des protéines de réparation des dommages à l’ADN dans les organoïdes du cancer de l’ovaire dérivés de patients par des tests d’immunofluorescence

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DOI :

10.3791/64881

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24 février 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Washington University in St. Louis, 2University of California San Francisco

Dans cet article

Résumé

Le présent protocole décrit des méthodes d’évaluation des protéines de réparation des dommages à l’ADN dans les organoïdes du cancer de l’ovaire dérivés de patientes. Vous trouverez ici des méthodes complètes de placage et de coloration, ainsi que des procédures de quantification détaillées et objectives.

Résumé

L’immunofluorescence est l’une des techniques les plus largement utilisées pour visualiser les antigènes cibles avec une sensibilité et une spécificité élevées, permettant l’identification et la localisation précises des protéines, des glycanes et des petites molécules. Bien que cette technique soit bien établie dans la culture cellulaire bidimensionnelle (2D), on en sait moins sur son utilisation dans les modèles cellulaires tridimensionnels (3D). Les organoïdes du cancer de l’ovaire sont des modèles tumoraux 3D qui récapitulent l’hétérogénéité clonale des cellules tumorales, le microenvironnement tumoral et les interactions cellule-cellule et cellule-matrice. Ainsi, ils sont supérieurs aux lignées cellulaires pour l’évaluation de la sensibilité aux médicaments et des biomarqueurs fonctionnels. Par conséquent, la capacité d’utiliser l’immunofluorescence sur les organoïdes primaires du cancer de l’ovaire est extrêmement bénéfique pour comprendre la biologie de ce cancer. La présente étude décrit la technique d’immunofluorescence pour détecter les protéines de réparation des dommages à l’ADN dans les organoïdes du cancer de l’ovaire (AOP) séreux dérivés de patients de haut grade. Après avoir exposé les PDO à des rayonnements ionisants, l’immunofluorescence est réalisée sur des organoïdes intacts pour évaluer les protéines nucléaires en tant que foyers. Les images sont collectées à l’aide de l’imagerie z-stack sur microscopie confocale et analysées à l’aide d’un logiciel automatisé de comptage des foyers. Les méthodes décrites permettent l’analyse du recrutement temporel et spécial des protéines de réparation des dommages à l’ADN et la colocalisation de ces protéines avec des marqueurs du cycle cellulaire.

Introduction

Le cancer de l’ovaire est la principale cause de décès dû à une malignité gynécologique. La majorité des patients sont traités avec des médicaments endommageant l’ADN tels que le carboplatine, et ceux qui ont des tumeurs déficientes en réparation de recombinaison homologue (HRR) peuvent recevoir des inhibiteurs de la poly(ADP-ribose) polymérase (PARP) 1,2. Cependant, la plupart des patients développent une résistance à ces thérapies et meurent dans les 5 ans suivant le diagnostic. La dysrégulation de la réponse aux dommages à l’ADN (DDR) a été associée au développement du cancer de l’ovaire et à la chimiothérapie et à la résistance aux inhibiteurs de PARP3. Ainsi, l’étude du DDR est impérative pour comprendre la physiopathologie du cancer de l’ovaire, les biomarqueurs potentiels et les nouvelles thérapies ciblées.

Les méthodes actuelles d’évaluation du DDR utilisent l’immunofluorescence (IF), car cela permet l’identification et la localisation précises des protéines de dommages à l’ADN et des analogues nucléotidiques. Une fois qu’il y a une cassure double brin (DSB) dans l’ADN, la protéine histones H2AX est rapidement phosphorylée, formant un foyer où les protéines de réparation des dommages à l’ADN se rassemblent4. Cette phosphorylation peut être facilement identifiée à l’aide de l’IF; en fait, le test ɣ-H2AX a été couramment utilisé pour confirmer l’induction d’un DSB 5,6,7,8,9. Une augmentation des dommages à l’ADN a été associée à la sensibilité au platine et à l’efficacité des agents endommageant l’ADN 10,11,12, et ɣ-H2AX a été proposé comme biomarqueur associé à la réponse à la chimiothérapie dans d’autres traitements contre le cancer 13. Lors d’un DSB, une cellule compétente en HRR effectue une série d’événements qui conduisent BRCA1 et BRCA2 à recruter RAD51 pour remplacer la protéine de réplication A (RPA) et se lier à l’ADN. La réparation HRR utilise un modèle d’ADN pour réparer fidèlement le DSB. Cependant, lorsque les tumeurs sont déficientes en HRR, elles s’appuient sur des voies de réparation alternatives telles que la jonction d’extrémité non homologue (NHEJ). NHEJ est connu pour être sujet aux erreurs et crée une charge mutationnelle élevée sur la cellule, qui utilise 53BP1 comme régulateur positif14. Ces protéines de dommages à l’ADN peuvent toutes être identifiées avec précision comme foyers à l’aide de l’IF. En plus de la coloration des protéines, l’IF peut être utilisé pour étudier la protection de la fourchette et la formation de lacunes d’ADN simple brin. La capacité d’avoir des fourches stables a été corrélée avec la réponse du platine, et récemment, des tests d’écart ont montré le potentiel de prédire la réponse aux inhibiteurs de PARP 6,15,16,17. Par conséquent, la coloration des analogues nucléotidiques après introduction dans le génome est une autre façon d’étudier le DDR.

À ce jour, l’évaluation du DDR dans le cancer de l’ovaire a été largement limitée à des lignées cellulaires 2D homogènes qui ne récapitulent pas l’hétérogénéité clonale, le microenvironnement ou l’architecture des tumeurs in vivo 18,19. Des recherches récentes suggèrent que les organoïdes sont supérieurs aux lignées cellulaires 2D dans l’étude de processus biologiques complexes tels que les mécanismes DDR6. La présente méthodologie évalue RAD51, ɣ-H2AX, 53BP1, RPA et geminin dans les AOP. Ces méthodes évaluent l’organoïde intact et permettent d’étudier les mécanismes de DDR dans un cadre plus proche du microenvironnement tumoral in vivo. Avec la microscopie confocale et le comptage automatisé des foyers, cette méthodologie peut aider à comprendre la voie DDR dans le cancer de l’ovaire et à personnaliser les plans de traitement pour les patientes.

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Protocole

Le tissu tumoral et l’ascite ont été obtenus après avoir obtenu le consentement du patient dans le cadre d’un bioréférentiel d’oncologie gynécologique approuvé par le Washington University in St. Louis Institutional Review Board (IRB). Les patientes ont été incluses si elles avaient un cancer séreux de l’ovaire de haut grade à un stade avancé (HGSOC). Toutes les procédures ont été effectuées à température ambiante sur le banc, sauf indication contraire. Tous les réactifs ont été préparés à température ambiante (sauf indication contraire) et conservés à 4 °C.

1. Génération d’organoïdes

  1. Générer les organoïdes en suivant le rapport précédemment publié20.

2. Placage et irradiation des organoïdes

  1. À l’aide d’organoïdes en culture, délogez les languettes des organoïdes de la boîte de culture par manipulation manuelle d’un embout de pipette. Recueillir les organoïdes dans un tube conique de 15 mL.
  2. Centrifuger le tube conique à 1 650 x g pendant 5 min à 4 °C. À l’aide d’une pipette, aspirer soigneusement le surnageant.
  3. Ajouter 1 000 μL d’une enzyme recombinante d’origine animale à la pastille (voir le tableau des matériaux). Mélanger la solution et incuber pendant 15 min à 37 °C.
  4. Centrifuger la solution à 1 650 x g pendant 5 min à 4 °C. À l’aide d’une pipette, aspirer soigneusement le surnageant.
  5. Après centrifugation et aspiration, remettre la pastille en suspension dans 1 000 μL de solution saline tamponnée au phosphate.
  6. Transférer 10 μL de la solution dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL et mélanger avec 10 μL de bleu de trypan.
  7. Prélever 10 μL de la solution de cellules bleues de trypan dans une lame de chambre de comptage de cellules et l’insérer dans la machine de comptage de cellules (voir Tableau des matériaux).
  8. Plaquer 40 000 cellules par 20 μL d’extrait de membrane basale (EMB) dans une lame de chambre en verre à 8 puits (voir Tableau des matériaux). Cela maintient les organoïdes pendant 3-5 jours pour permettre aux cellules de former des organoïdes et de croître à une taille appropriée.
  9. Pour induire des cassures d’ADN double brin, rayonnez les organoïdes plaqués avec 10 gris (Gy) d’irradiation ɣ (voir le tableau des matériaux pour les détails de l’irradiateur).
    REMARQUE: Cela peut prendre jusqu’à 5-10 min.
  10. Incuber les organoïdes dans leurs milieux de culture dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5% de CO2 pendant 4 h.

3. Coloration par immunofluorescence

REMARQUE : Les volumes font référence à la quantité par puits de la glissière de la chambre à 8 puits (~300 μL).

  1. Après l’irradiation et l’incubation des organoïdes, aspirer le média avec une pipette, avec précaution afin de ne pas perturber la matrice 3D. Laver avec 300 μL de PBS.
  2. Fixer les organoïdes dans 300 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 2% pendant 10 min.
    NOTES: Ne pas laisser trop longtemps, car le BME se dépolymérisera et pourrait être aspiré.
  3. Laver les organoïdes avec 300 μL de tampon de coloration (voir le tableau des matières). Placer sur un shaker pendant 5 min.
  4. Pour la perméabilisation, ajouter doucement 300 μL de tampon de perméabilisation (voir Tableau des matières) et incuber pendant 20 min. Laver avec 300 μL de tampon de coloration. Placer sur un shaker pendant 5 min.
  5. Ajouter 300 μL de tampon de coloration pour bloquer l’étape de perméabilisation. Placer sur un shaker pendant 30 min. Aspirer le tampon de coloration à l’aide d’une pipette.
  6. Ajouter 300 μL d’anticorps primaires (anti-RAD51 chez le lapin, anti-Géminine chez la souris, anti-RPA chez le lapin, anti-ɣH2AX chez la souris, anti-Géminine chez le lapin, anti-53BP1 chez la souris; voir le tableau des matériaux) dilués dans un tampon de coloration. Incuber à 4 °C pendant 16 h.
    REMARQUE : Évitez de co-colorer avec le même animal hôte. Laissez le couvercle éteint pour éviter que les anticorps ne se mélangent dans les puits voisins.
  7. Retirez la solution d’anticorps primaire. Effectuer trois lavages avec 300 μL de tampon de coloration pendant 5 min chacun sur le shaker.
  8. Ajouter 300 μL d’anticorps secondaire (chèvre anti-souris Alexa fluor 488 et chèvre anti-lapin Alexa fluor 647; voir tableau des matériaux) solution diluée dans un tampon de coloration et incuber pendant 1 h dans l’obscurité.
    REMARQUE: Toutes les étapes suivantes doivent être effectuées dans l’obscurité.
  9. Aspirer la solution d’anticorps secondaire. Ajouter 300 μL de DAPI dilué. Placer sur un shaker pendant 5 min.
  10. Effectuer trois lavages avec 300 μL de tampon de coloration pendant 5 min chacun sur le shaker. Retirez le tampon de coloration et détachez les chambres à l’aide de la trousse de retrait fournie avec les lames de la chambre (voir le tableau des matériaux).
    REMARQUE: Assurez-vous de ne pas pousser trop loin vers l’avant afin de perturber la matrice 3D.
  11. À l’aide d’une pointe de pipette p200 dont l’embout est coupé, ajouter un support de montage (voir le tableau des matériaux) pour recouvrir chaque puits d’une languette organoïde (p. ex., 20 à 30 μL pour chaque languette organoïde).
  12. Placez un couvercle sur le spécimen, en évitant les bulles.
  13. Prenez du vernis à ongles transparent et peignez-le sur les côtés du verre de couverture pour sceller la lame. Laisser durcir pendant 1 h et le placer à -20 °C.
    REMARQUE: Après l’imagerie, la lame peut être stockée pendant au moins 6 mois avec une perte minimale de fluorescence.

4. Imagerie

  1. Acquérir des images à l’aide d’un microscope confocal (voir Tableau des matériaux) à 63x l’objectif avec de l’huile d’immersion.
    REMARQUE: Si l’imagerie des protéines nucléaires, 63x est avantageux, mais 40x est également acceptable.
  2. Utilisez DAPI pour localiser les organoïdes à travers l’oculaire. Sélectionnez les filtres appropriés pour la microscopie en fonction des fluorophores utilisés. Définissez les paramètres de capture des images z-stack.
    REMARQUE : Les fluorophores utilisés dans l’étude étaient DAPI, 488 et 647. Les lasers 405, 488 et 638 ont été allumés pour visualiser la coloration.
    REMARQUE: La pile z recommandée dépend de la puissance de résolution de l’objectif.
  3. Ajustez l’image en direct: réglage de la mise au point, intensité laser, etc.
    REMARQUE: Plus l’intensité du laser est élevée, plus l’échantillon est susceptible de photoblanchir. Par conséquent, sélectionnez une intensité laser optimale.
  4. Acquérir le z-stack.
    REMARQUE: Cela peut prendre jusqu’à 5-10 min.
  5. À partir des images collectées dans la z-stack, capturez au moins trois images par pile.
    REMARQUE: Assurez-vous d’obtenir des captures d’écran dans toute la pile afin de ne pas dupliquer les noyaux lors de la quantification.
  6. Enregistrez chaque fichier au format TIFF et passez à l’analyse (étape 5).

5. Analyse

REMARQUE: Utilisez JCountPro pour toutes les analyses d’images suivant le rapport précédemment publié21. Pour obtenir ce logiciel, reportez-vous à la publication associée.

  1. Sous le panneau d’analyse d’objet (en haut du programme) dans l’onglet de sélection de fichiers (en bas du programme), sélectionnez les fichiers TIFF .
  2. Cliquez sur Ajouter pour déplacer les fichiers sélectionnés vers le groupe de fichiers sélectionné. Sélectionnez Affichage.
  3. Sous l’onglet segmentation, sélectionnez bleu comme couleur des noyaux. Sélectionnez Segmentation automatique pour optimiser le seuil des noyaux.
    REMARQUE: Si la segmentation automatique n’identifie pas avec précision les objets, l’utilisateur peut ajuster la mélodie fine et la mélodie brute à l’image ou consulter le manuel de l’utilisateur pour optimiser davantage la segmentation.
  4. Dans le panneau Objets, sélectionnez Fractionner automatiquement les objets volumineux et optimiser la taille des noyaux.
    Remarque : Les noyaux ont généralement une taille inconditionnelle de 5 000 pixels, tandis que la taille conditionnelle est de 1 500 pixels. Consultez le manuel d’utilisation pour optimiser davantage la taille des objets.
  5. Sélectionnez Identifier les objets pour tester les paramètres.
    REMARQUE: Si ces paramètres ne sont pas précis, la taille et le réglage peuvent être ajustés avec d’autres paramètres. Consultez le manuel d’utilisation pour obtenir des instructions concernant l’optimisation ultérieure.
  6. Après avoir ajusté les paramètres à l’image, sélectionnez Identifier les objets dans toutes les images pour identifier les noyaux dans toutes les images sélectionnées.
  7. Sélectionnez le panneau Analyse des foyers (en haut du programme).
  8. Sous l’onglet Sélectionner des fichiers (en bas du programme), sélectionnez les fichiers TIFF utilisés pour l’analyse d’objets et sélectionnez les boutons fléchés (>>) pour déplacer les images vers le groupe de fichiers image.
  9. Dans le groupe de répertoires situé sous les fichiers image qui ont été déplacés, double-cliquez sur le dossier Modification manuelle et choisissez de déplacer les fichiers IOC dans le groupe de fichiers de collection d’objets.
    REMARQUE : Tous les fichiers TIFF sélectionnés doivent avoir des fichiers IOC correspondants.
  10. Appuyez sur Sélectionner pour déplacer les fichiers dans le groupe de fichiers sélectionné. Sélectionnez l’onglet Comptage des foyers au bas du programme.
  11. Optimisez les paramètres en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Index des paramètres de chapeau haut-de-forme: 12.
    2. Canal de focus : sélectionnez la couleur des foyers (vert : ɣ-H2AX ; rouge : RAD51).
    3. Réglages du dôme H: hauteur du dôme %: 30; % de seuil: 28 et 28.
    4. Réglage de la forme/taille : Taille minimale de mise au point, pixels : 5. Sélectionnez Appliquer la forme/la taille. Taille maximale de mise au point (conditionnelle): 32. Rondeur min, x100: 96. Mise au point maximale, pixels: 60.
    5. Filtre antibruit: taille 1.
      REMARQUE: Si vous déterminez si un noyau est positif pour la coloration de la géminine, sélectionnez le vert sous le deuxième canal, et sous l’analyse, sélectionnez l’intensité.
  12. Pour tester les paramètres définis, sélectionnez les boutons ci-dessous dans l’ordre : Top Hat > H-Dome > Foci Count.
    REMARQUE: Si ces paramètres ne fonctionnent pas, la taille et le réglage peuvent être ajustés avec d’autres paramètres. Consultez le manuel de l’utilisateur pour en savoir plus sur la façon dont l’image peut être optimisée.
  13. Une fois les paramètres optimisés pour les images sélectionnées, sélectionnez Comptage automatique pour compter les foyers de chaque image par noyau. Si le deuxième canal est souhaité, le programme déterminera l’intensité qui peut être utilisée.

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Résultats

Le protocole présenté peut colorer, visualiser et quantifier avec succès les protéines de réparation des dommages à l’ADN nucléaire dans les organoïdes. Cette technique a été utilisée pour colorer et évaluer les AOP avant et après l’irradiation. Les AOP ont été exposées à 10 Gy de rayonnement et évaluées pour les biomarqueurs suivants : ɣ-H2AX (Figure 1), un marqueur des dommages à l’ADN; RAD51 (figure 2), un marqueur de HRR; 53BP1, un marqueur de NHEJ; La RPA, ...

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Discussion

La réponse aux dommages à l’ADN joue un rôle essentiel dans le développement du cancer de l’ovaire et de la résistance à la chimiothérapie. Par conséquent, une compréhension approfondie des mécanismes de réparation de l’ADN est impérative. Ici, une méthodologie est présentée pour étudier les protéines de réparation des dommages à l’ADN dans des organoïdes 3D intacts. Un protocole reproductible et fiable est développé en utilisant des anticorps caractéristiques pour évaluer les dommages à l’ADN, la recombinaison homologue...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous sommes reconnaissants à Pavel Lobachevsky, Ph.D., de nous avoir guidés dans l’établissement de ce protocole. Nous tenons également à remercier l’École de médecine du Département d’obstétrique et de gynécologie et la Division d’oncologie gynécologique de l’Université de Washington à St. Louis, le Dean’s Scholar Program de l’Université de Washington, la Gynecologic Oncology Group Foundation et le Reproductive Scientist Development Program pour leur soutien à ce projet.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1x solution saline tamponnée au phosphate avec calcium et magnésium (PBS++)Sigma14-040-133
1x solution saline tamponnée au phosphate sans calcium ni magnésium (PBS)Fisher Scientific  ;
Anticorps anti-53BP1BD Biosciences612522dilué à 1:500 dans un tampon de coloration
Anticorps anti-géminine.Abcamab104306dilué à 1:200 dans un tampon de coloration
Anticorps anti-géminine  ;ProteinTech10802-1-APdilué à 1:400 dans un tampon de coloration
Anticorps anti-RAD51  ;Abcamab133534dilué à 1:1000 dans un tampon de coloration
Anticorps anti-yH2AX  ;Millipore-Sigma05-636dilué à 1:500 dans un tampon de coloration
Ant-phospho-RPA32 (S4/S8)Anticorps Bethyl Laboratories  ;A300-245A-Mdilué à 1:200 dans un tampon de coloration
Albumine sérique bovine (BSA)Fisher Scientific  ;BP1605 100
Centrifugeuse ; Centrifugeuse Sorvall St 16RThermo Scientific  ;
75004240 Microscope confocal, système confocal Leica SP5 DMI4000Leica  ;
Tubes coniques, 15 mLCorning  ;14-959-53A
Compteur de cellules automatisé Countess 3 FL (machine de comptage de cellules)  ;Thermo Scientific  ;
Lames de chambre de comptage de cellules CountessThermo Scientific  ;C10228
Cover SlipLA CouleursN’importe quel vernis à ongles transparent suffira
Cultrex  ; Extrait de membrane basale RGF, type 2 R& D Systems  ;3533-010-02Pourrait probablement utiliser Matrigel ou une autre matrice BME.
DAPI  ;Thermo Scientific  ;  ; R37606NucBlue Réactif Ready Probes, dilué dans 1x PBS  ;
Glycine  ;Fisher Scientific  ;
JCountProJCountProPour accéder au logiciel, Email : jcountpro@gmail.com  ;
Tubes de microcentrifugation  ;Fisher Scientific  ;07-000-243
Vernis à ongles  ;StatLabSL102450
parafomraldéhyde (PFA), 2 %  ;Sciences de la microscopie électronique  ;157-4Diluer à 4 % de PFA dans PBS++ pour obtenir
tampon de perméabilisation de 2Fabriqué en laboratoire0,2 % de X-100 Triton dans PBS++
PipetteRainin17014382
Pointes de pipette  ;Pluie  ;
ProLong Gold Antifade MountantThermo Scientific  ;  ; P36930
Tampon de coloration  ;Fabriqué en laboratoire0,5 % BSA, 0,15 % glycine, 0,1 % X-100 Triton en PBS++
Système de lames de chambre Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II  ;Thermo Scientific  ;12-565-8
Triton X-100Sigma-Alderich  ;
Trypan Blue Solution, 0,4 %Thermo Scientific  ;
TrypLE ExpressInvitrogen12604013enzyme recombinante sans origine animale
Irradiateur biologique X-RAD 320.Irradiation de précision aux rayons X  ;X-RAD320
ICN1860454389584AMQAF2000NC0756056 un % de PFA 170149671133248100115250061

Références

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