Visualisation des protéines de réparation des dommages à l’ADN dans les organoïdes du cancer de l’ovaire dérivés de patients par des tests d’immunofluorescence

Le cancer de l’ovaire est la principale cause de décès dû à une malignité gynécologique. La majorité des patients sont traités avec des médicaments endommageant l’ADN tels que le carboplatine, et ceux qui ont des tumeurs déficientes en réparation de recombinaison homologue (HRR) peuvent recevoir des inhibiteurs de la poly(ADP-ribose) polymérase (PARP) ^1,2. Cependant, la plupart des patients développent une résistance à ces thérapies et meurent dans les 5 ans suivant le diagnostic. La dysrégulation de la réponse aux dommages à l’ADN (DDR) a été associée au développement du cancer de l’ovaire et à la chimiothérapie et à la résistance aux inhibiteurs de PARP³. Ainsi, l’étude du DDR est impérative pour comprendre la physiopathologie du cancer de l’ovaire, les biomarqueurs potentiels et les nouvelles thérapies ciblées.

Les méthodes actuelles d’évaluation du DDR utilisent l’immunofluorescence (IF), car cela permet l’identification et la localisation précises des protéines de dommages à l’ADN et des analogues nucléotidiques. Une fois qu’il y a une cassure double brin (DSB) dans l’ADN, la protéine histones H2AX est rapidement phosphorylée, formant un foyer où les protéines de réparation des dommages à l’ADN se rassemblent⁴. Cette phosphorylation peut être facilement identifiée à l’aide de l’IF; en fait, le test ɣ-H2AX a été couramment utilisé pour confirmer l’induction d’un DSB 5,6,7,8,9. Une augmentation des dommages à l’ADN a été associée à la sensibilité au platine et à l’efficacité des agents endommageant l’ADN 10,11,12^, et ɣ-H2AX a été proposé comme biomarqueur associé à la réponse à la chimiothérapie dans d’autres traitements contre le cancer ¹³. Lors d’un DSB, une cellule compétente en HRR effectue une série d’événements qui conduisent BRCA1 et BRCA2 à recruter RAD51 pour remplacer la protéine de réplication A (RPA) et se lier à l’ADN. La réparation HRR utilise un modèle d’ADN pour réparer fidèlement le DSB. Cependant, lorsque les tumeurs sont déficientes en HRR, elles s’appuient sur des voies de réparation alternatives telles que la jonction d’extrémité non homologue (NHEJ). NHEJ est connu pour être sujet aux erreurs et crée une charge mutationnelle élevée sur la cellule, qui utilise 53BP1 comme régulateur positif¹⁴. Ces protéines de dommages à l’ADN peuvent toutes être identifiées avec précision comme foyers à l’aide de l’IF. En plus de la coloration des protéines, l’IF peut être utilisé pour étudier la protection de la fourchette et la formation de lacunes d’ADN simple brin. La capacité d’avoir des fourches stables a été corrélée avec la réponse du platine, et récemment, des tests d’écart ont montré le potentiel de prédire la réponse aux inhibiteurs de PARP 6,15,16,17. Par conséquent, la coloration des analogues nucléotidiques après introduction dans le génome est une autre façon d’étudier le DDR.

À ce jour, l’évaluation du DDR dans le cancer de l’ovaire a été largement limitée à des lignées cellulaires 2D homogènes qui ne récapitulent pas l’hétérogénéité clonale, le microenvironnement ou l’architecture des tumeurs in vivo ^18,19. Des recherches récentes suggèrent que les organoïdes sont supérieurs aux lignées cellulaires 2D dans l’étude de processus biologiques complexes tels que les mécanismes DDR⁶. La présente méthodologie évalue RAD51, ɣ-H2AX, 53BP1, RPA et geminin dans les AOP. Ces méthodes évaluent l’organoïde intact et permettent d’étudier les mécanismes de DDR dans un cadre plus proche du microenvironnement tumoral in vivo. Avec la microscopie confocale et le comptage automatisé des foyers, cette méthodologie peut aider à comprendre la voie DDR dans le cancer de l’ovaire et à personnaliser les plans de traitement pour les patientes.

Le tissu tumoral et l’ascite ont été obtenus après avoir obtenu le consentement du patient dans le cadre d’un bioréférentiel d’oncologie gynécologique approuvé par le Washington University in St. Louis Institutional Review Board (IRB). Les patientes ont été incluses si elles avaient un cancer séreux de l’ovaire de haut grade à un stade avancé (HGSOC). Toutes les procédures ont été effectuées à température ambiante sur le banc, sauf indication contraire. Tous les réactifs ont été préparés à température ambiante (sauf indication contraire) et conservés à 4 °C.

1. Génération d’organoïdes

1. Générer les organoïdes en suivant le rapport précédemment publié²⁰.

2. Placage et irradiation des organoïdes

1. À l’aide d’organoïdes en culture, délogez les languettes des organoïdes de la boîte de culture par manipulation manuelle d’un embout de pipette. Recueillir les organoïdes dans un tube conique de 15 mL.
2. Centrifuger le tube conique à 1 650 x g pendant 5 min à 4 °C. À l’aide d’une pipette, aspirer soigneusement le surnageant.
3. Ajouter 1 000 μL d’une enzyme recombinante d’origine animale à la pastille (voir le tableau des matériaux). Mélanger la solution et incuber pendant 15 min à 37 °C.
4. Centrifuger la solution à 1 650 x g pendant 5 min à 4 °C. À l’aide d’une pipette, aspirer soigneusement le surnageant.
5. Après centrifugation et aspiration, remettre la pastille en suspension dans 1 000 μL de solution saline tamponnée au phosphate.
6. Transférer 10 μL de la solution dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL et mélanger avec 10 μL de bleu de trypan.
7. Prélever 10 μL de la solution de cellules bleues de trypan dans une lame de chambre de comptage de cellules et l’insérer dans la machine de comptage de cellules (voir Tableau des matériaux).
8. Plaquer 40 000 cellules par 20 μL d’extrait de membrane basale (EMB) dans une lame de chambre en verre à 8 puits (voir Tableau des matériaux). Cela maintient les organoïdes pendant 3-5 jours pour permettre aux cellules de former des organoïdes et de croître à une taille appropriée.
9. Pour induire des cassures d’ADN double brin, rayonnez les organoïdes plaqués avec 10 gris (Gy) d’irradiation ɣ (voir le tableau des matériaux pour les détails de l’irradiateur).
   REMARQUE: Cela peut prendre jusqu’à 5-10 min.
10. Incuber les organoïdes dans leurs milieux de culture dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5% de CO₂ pendant 4 h.

3. Coloration par immunofluorescence

REMARQUE : Les volumes font référence à la quantité par puits de la glissière de la chambre à 8 puits (~300 μL).

1. Après l’irradiation et l’incubation des organoïdes, aspirer le média avec une pipette, avec précaution afin de ne pas perturber la matrice 3D. Laver avec 300 μL de PBS.
2. Fixer les organoïdes dans 300 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 2% pendant 10 min.
   NOTES: Ne pas laisser trop longtemps, car le BME se dépolymérisera et pourrait être aspiré.
3. Laver les organoïdes avec 300 μL de tampon de coloration (voir le tableau des matières). Placer sur un shaker pendant 5 min.
4. Pour la perméabilisation, ajouter doucement 300 μL de tampon de perméabilisation (voir Tableau des matières) et incuber pendant 20 min. Laver avec 300 μL de tampon de coloration. Placer sur un shaker pendant 5 min.
5. Ajouter 300 μL de tampon de coloration pour bloquer l’étape de perméabilisation. Placer sur un shaker pendant 30 min. Aspirer le tampon de coloration à l’aide d’une pipette.
6. Ajouter 300 μL d’anticorps primaires (anti-RAD51 chez le lapin, anti-Géminine chez la souris, anti-RPA chez le lapin, anti-ɣH2AX chez la souris, anti-Géminine chez le lapin, anti-53BP1 chez la souris; voir le tableau des matériaux) dilués dans un tampon de coloration. Incuber à 4 °C pendant 16 h.
   REMARQUE : Évitez de co-colorer avec le même animal hôte. Laissez le couvercle éteint pour éviter que les anticorps ne se mélangent dans les puits voisins.
7. Retirez la solution d’anticorps primaire. Effectuer trois lavages avec 300 μL de tampon de coloration pendant 5 min chacun sur le shaker.
8. Ajouter 300 μL d’anticorps secondaire (chèvre anti-souris Alexa fluor 488 et chèvre anti-lapin Alexa fluor 647; voir tableau des matériaux) solution diluée dans un tampon de coloration et incuber pendant 1 h dans l’obscurité.
   REMARQUE: Toutes les étapes suivantes doivent être effectuées dans l’obscurité.
9. Aspirer la solution d’anticorps secondaire. Ajouter 300 μL de DAPI dilué. Placer sur un shaker pendant 5 min.
10. Effectuer trois lavages avec 300 μL de tampon de coloration pendant 5 min chacun sur le shaker. Retirez le tampon de coloration et détachez les chambres à l’aide de la trousse de retrait fournie avec les lames de la chambre (voir le tableau des matériaux).
    REMARQUE: Assurez-vous de ne pas pousser trop loin vers l’avant afin de perturber la matrice 3D.
11. À l’aide d’une pointe de pipette p200 dont l’embout est coupé, ajouter un support de montage (voir le tableau des matériaux) pour recouvrir chaque puits d’une languette organoïde (p. ex., 20 à 30 μL pour chaque languette organoïde).
12. Placez un couvercle sur le spécimen, en évitant les bulles.
13. Prenez du vernis à ongles transparent et peignez-le sur les côtés du verre de couverture pour sceller la lame. Laisser durcir pendant 1 h et le placer à -20 °C.
    REMARQUE: Après l’imagerie, la lame peut être stockée pendant au moins 6 mois avec une perte minimale de fluorescence.

4. Imagerie

1. Acquérir des images à l’aide d’un microscope confocal (voir Tableau des matériaux) à 63x l’objectif avec de l’huile d’immersion.
   REMARQUE: Si l’imagerie des protéines nucléaires, 63x est avantageux, mais 40x est également acceptable.
2. Utilisez DAPI pour localiser les organoïdes à travers l’oculaire. Sélectionnez les filtres appropriés pour la microscopie en fonction des fluorophores utilisés. Définissez les paramètres de capture des images z-stack.
   REMARQUE : Les fluorophores utilisés dans l’étude étaient DAPI, 488 et 647. Les lasers 405, 488 et 638 ont été allumés pour visualiser la coloration.
   REMARQUE: La pile z recommandée dépend de la puissance de résolution de l’objectif.
3. Ajustez l’image en direct: réglage de la mise au point, intensité laser, etc.
   REMARQUE: Plus l’intensité du laser est élevée, plus l’échantillon est susceptible de photoblanchir. Par conséquent, sélectionnez une intensité laser optimale.
4. Acquérir le z-stack.
   REMARQUE: Cela peut prendre jusqu’à 5-10 min.
5. À partir des images collectées dans la z-stack, capturez au moins trois images par pile.
   REMARQUE: Assurez-vous d’obtenir des captures d’écran dans toute la pile afin de ne pas dupliquer les noyaux lors de la quantification.
6. Enregistrez chaque fichier au format TIFF et passez à l’analyse (étape 5).

5. Analyse

REMARQUE: Utilisez JCountPro pour toutes les analyses d’images suivant le rapport précédemment publié²¹. Pour obtenir ce logiciel, reportez-vous à la publication associée.

1. Sous le panneau d’analyse d’objet (en haut du programme) dans l’onglet de sélection de fichiers (en bas du programme), sélectionnez les fichiers TIFF .
2. Cliquez sur Ajouter pour déplacer les fichiers sélectionnés vers le groupe de fichiers sélectionné. Sélectionnez Affichage.
3. Sous l’onglet segmentation, sélectionnez bleu comme couleur des noyaux. Sélectionnez Segmentation automatique pour optimiser le seuil des noyaux.
   REMARQUE: Si la segmentation automatique n’identifie pas avec précision les objets, l’utilisateur peut ajuster la mélodie fine et la mélodie brute à l’image ou consulter le manuel de l’utilisateur pour optimiser davantage la segmentation.
4. Dans le panneau Objets, sélectionnez Fractionner automatiquement les objets volumineux et optimiser la taille des noyaux.
   Remarque : Les noyaux ont généralement une taille inconditionnelle de 5 000 pixels, tandis que la taille conditionnelle est de 1 500 pixels. Consultez le manuel d’utilisation pour optimiser davantage la taille des objets.
5. Sélectionnez Identifier les objets pour tester les paramètres.
   REMARQUE: Si ces paramètres ne sont pas précis, la taille et le réglage peuvent être ajustés avec d’autres paramètres. Consultez le manuel d’utilisation pour obtenir des instructions concernant l’optimisation ultérieure.
6. Après avoir ajusté les paramètres à l’image, sélectionnez Identifier les objets dans toutes les images pour identifier les noyaux dans toutes les images sélectionnées.
7. Sélectionnez le panneau Analyse des foyers (en haut du programme).
8. Sous l’onglet Sélectionner des fichiers (en bas du programme), sélectionnez les fichiers TIFF utilisés pour l’analyse d’objets et sélectionnez les boutons fléchés (>>) pour déplacer les images vers le groupe de fichiers image.
9. Dans le groupe de répertoires situé sous les fichiers image qui ont été déplacés, double-cliquez sur le dossier Modification manuelle et choisissez de déplacer les fichiers IOC dans le groupe de fichiers de collection d’objets.
   REMARQUE : Tous les fichiers TIFF sélectionnés doivent avoir des fichiers IOC correspondants.
10. Appuyez sur Sélectionner pour déplacer les fichiers dans le groupe de fichiers sélectionné. Sélectionnez l’onglet Comptage des foyers au bas du programme.
11. Optimisez les paramètres en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Index des paramètres de chapeau haut-de-forme: 12.
    2. Canal de focus : sélectionnez la couleur des foyers (vert : ɣ-H2AX ; rouge : RAD51).
    3. Réglages du dôme H: hauteur du dôme %: 30; % de seuil: 28 et 28.
    4. Réglage de la forme/taille : Taille minimale de mise au point, pixels : 5. Sélectionnez Appliquer la forme/la taille. Taille maximale de mise au point (conditionnelle): 32. Rondeur min, x100: 96. Mise au point maximale, pixels: 60.
    5. Filtre antibruit: taille 1.
       REMARQUE: Si vous déterminez si un noyau est positif pour la coloration de la géminine, sélectionnez le vert sous le deuxième canal, et sous l’analyse, sélectionnez l’intensité.
12. Pour tester les paramètres définis, sélectionnez les boutons ci-dessous dans l’ordre : Top Hat > H-Dome > Foci Count.
    REMARQUE: Si ces paramètres ne fonctionnent pas, la taille et le réglage peuvent être ajustés avec d’autres paramètres. Consultez le manuel de l’utilisateur pour en savoir plus sur la façon dont l’image peut être optimisée.
13. Une fois les paramètres optimisés pour les images sélectionnées, sélectionnez Comptage automatique pour compter les foyers de chaque image par noyau. Si le deuxième canal est souhaité, le programme déterminera l’intensité qui peut être utilisée.

Le protocole présenté peut colorer, visualiser et quantifier avec succès les protéines de réparation des dommages à l’ADN nucléaire dans les organoïdes. Cette technique a été utilisée pour colorer et évaluer les AOP avant et après l’irradiation. Les AOP ont été exposées à 10 Gy de rayonnement et évaluées pour les biomarqueurs suivants : ɣ-H2AX (Figure 1), un marqueur des dommages à l’ADN; RAD51 (figure 2), un marqueur de HRR; 53BP1, un marqueur de NHEJ; La RPA, un marqueur du stress de réplication (Figure 3) ; et la géminine, un marqueur du cycle cellulaire de phase G2/S14. La dose de 10 Gy a été choisie sur la base de recherches précédemment publiées étudiant les dommages à l’ADN dans le cancer de l’ovaire 6,22. Le logiciel JCountPro a été utilisé pour identifier le noyau et quantifier le nombre de foyers dans le noyau avec des paramètres illustrés13 (Figure 4). Le logiciel identifie le noyau (Figure 4A,B), puis les foyers nucléaires (Figure 4C), et filtre les foyers des cellules geminines positives (Figure 4D).

Figure 1 : foyers ɣ-H2AX dans les AOP avant et après irradiation. Images représentatives des foyers DAPI et ɣ-H2AX dans les AOP avant et après irradiation à 10x avec des encarts 63x. Barres d’échelle: 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Foyers RAD51 et géminine dans les AOP avant et après irradiation. Images représentatives de DAPI, de géminine, de RAD51 et de co-coloration des PDO foci géminine/RAD51 avant et après irradiation à 10x avec des encarts 63x. Barres d’échelle: 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : RPA et 53BP1 dans les AOP avant et après irradiation. Images représentatives de (A) DAPI, RPA; (B) géminine, 53BP1, et co-coloration des foyers géminine/53BP1 à 10x avec des encarts 63x. Barres d’échelle: 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Workflow de quantification du logiciel JCountPro. (A) Dans le cadre de l’analyse d’objets, le canal bleu est sélectionné pour identifier les objets bleus, les noyaux, puis il est automatiquement optimisé en sélectionnant l’auto segmentation (flèche rouge). (B) Sous division automatique, la taille de l’objet (noyaux) est adaptée à la taille de l’image et au grossissement. Le bouton Identifier l’objet est sélectionné pour tester les paramètres (1) et le bouton Identifier les objets dans toutes les images (flèche rouge) est sélectionné pour identifier les objets (noyaux) pour chaque image. (C) Sous l’onglet Analyse des foyers, les images sont saisies et les paramètres de comptage des foyers sont définis: tout d’abord, la couleur des foyers est sélectionnée sous le canal de mise au point, vert; l’indice Top Hat est fixé à 12; les réglages du dôme H sont réglés pour avoir un pourcentage de hauteur de dôme de 30 et un pourcentage seuil de 28; la forme et la taille des foyers sont optimisées pour la taille de l’image avec les paramètres manuels de pixels de taille de mise au point maximale à 60 et de rondeur minimale x 100 à 96; Enfin, le filtre de bruit est appliqué. Les réglages sont testés en appliquant le chapeau haut-de-forme, le dôme H et le nombre de foyers (1-3). Pour quantifier les foyers ɣ-H2AX par cellule, appuyez sur start (flèche rouge). (D) Pour les foyers RAD51, les paramètres sont appliqués comme illustré pour les foyers ɣ-H2AX, à l’exception du canal de focalisation qui est changé en rouge; Cependant, pour identifier les noyaux colorés à la géminine, le deuxième canal est sélectionné pour le vert et l’analyse est modifiée en intensité. Les paramètres sont testés en appliquant le chapeau haut, le dôme H et le nombre de foyers (1-3), puis en appuyant sur start (flèche rouge) pour quantifier tous les foyers RAD51 et évaluer l’intensité du vert par cellule dans chaque image. Barre d’échelle: 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.