Le présent protocole décrit des méthodes d’évaluation des protéines de réparation des dommages à l’ADN dans les organoïdes du cancer de l’ovaire dérivés de patientes. Vous trouverez ici des méthodes complètes de placage et de coloration, ainsi que des procédures de quantification détaillées et objectives.
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Article de méthode
Visualisation des protéines de réparation des dommages à l’ADN dans les organoïdes du cancer de l’ovaire dérivés de patients par des tests d’immunofluorescence
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’immunofluorescence est l’une des techniques les plus largement utilisées pour visualiser les antigènes cibles avec une sensibilité et une spécificité élevées, permettant l’identification et la localisation précises des protéines, des glycanes et des petites molécules. Bien que cette technique soit bien établie dans la culture cellulaire bidimensionnelle (2D), on en sait moins sur son utilisation dans les modèles cellulaires tridimensionnels (3D). Les organoïdes du cancer de l’ovaire sont des modèles tumoraux 3D qui récapitulent l’hétérogénéité clonale des cellules tumorales, le microenvironnement tumoral et les interactions cellule-cellule et cellule-matrice. Ainsi, ils sont supérieurs aux lignées cellulaires pour l’évaluation de la sensibilité aux médicaments et des biomarqueurs fonctionnels. Par conséquent, la capacité d’utiliser l’immunofluorescence sur les organoïdes primaires du cancer de l’ovaire est extrêmement bénéfique pour comprendre la biologie de ce cancer. La présente étude décrit la technique d’immunofluorescence pour détecter les protéines de réparation des dommages à l’ADN dans les organoïdes du cancer de l’ovaire (AOP) séreux dérivés de patients de haut grade. Après avoir exposé les PDO à des rayonnements ionisants, l’immunofluorescence est réalisée sur des organoïdes intacts pour évaluer les protéines nucléaires en tant que foyers. Les images sont collectées à l’aide de l’imagerie z-stack sur microscopie confocale et analysées à l’aide d’un logiciel automatisé de comptage des foyers. Les méthodes décrites permettent l’analyse du recrutement temporel et spécial des protéines de réparation des dommages à l’ADN et la colocalisation de ces protéines avec des marqueurs du cycle cellulaire.
Introduction
Le cancer de l’ovaire est la principale cause de décès dû à une malignité gynécologique. La majorité des patients sont traités avec des médicaments endommageant l’ADN tels que le carboplatine, et ceux qui ont des tumeurs déficientes en réparation de recombinaison homologue (HRR) peuvent recevoir des inhibiteurs de la poly(ADP-ribose) polymérase (PARP) 1,2. Cependant, la plupart des patients développent une résistance à ces thérapies et meurent dans les 5 ans suivant le diagnostic. La dysrégulation de la réponse aux dommages à l’ADN (DDR) a été associée au développement du cancer de l’ovaire et à la chimiothéra....
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Protocole
Le tissu tumoral et l’ascite ont été obtenus après avoir obtenu le consentement du patient dans le cadre d’un bioréférentiel d’oncologie gynécologique approuvé par le Washington University in St. Louis Institutional Review Board (IRB). Les patientes ont été incluses si elles avaient un cancer séreux de l’ovaire de haut grade à un stade avancé (HGSOC). Toutes les procédures ont été effectuées à température ambiante sur le banc, sauf indication contraire. Tous les réactifs ont été préparés à température ambiante (sauf indication contraire) et conservés à 4 °C.
1. Génération d’organoïdes
- Générer les organoïdes en sui....
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Résultats
Le protocole présenté peut colorer, visualiser et quantifier avec succès les protéines de réparation des dommages à l’ADN nucléaire dans les organoïdes. Cette technique a été utilisée pour colorer et évaluer les AOP avant et après l’irradiation. Les AOP ont été exposées à 10 Gy de rayonnement et évaluées pour les biomarqueurs suivants : ɣ-H2AX (Figure 1), un marqueur des dommages à l’ADN; RAD51 (figure 2), un marqueur de HRR; 53BP1, un marqueur de NHEJ; La RPA, .......
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Discussion
La réponse aux dommages à l’ADN joue un rôle essentiel dans le développement du cancer de l’ovaire et de la résistance à la chimiothérapie. Par conséquent, une compréhension approfondie des mécanismes de réparation de l’ADN est impérative. Ici, une méthodologie est présentée pour étudier les protéines de réparation des dommages à l’ADN dans des organoïdes 3D intacts. Un protocole reproductible et fiable est développé en utilisant des anticorps caractéristiques pour évaluer les dommages à l’ADN, la recombinaison homologue.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Nous sommes reconnaissants à Pavel Lobachevsky, Ph.D., de nous avoir guidés dans l’établissement de ce protocole. Nous tenons également à remercier l’École de médecine du Département d’obstétrique et de gynécologie et la Division d’oncologie gynécologique de l’Université de Washington à St. Louis, le Dean’s Scholar Program de l’Université de Washington, la Gynecologic Oncology Group Foundation et le Reproductive Scientist Development Program pour leur soutien à ce projet.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 1x solution saline tamponnée au phosphate avec calcium et magnésium (PBS++) | Sigma | 14-040-133 | |
| 1x solution saline tamponnée au phosphate sans calcium ni magnésium (PBS) | Fisher Scientific ; | ||
| Anticorps anti-53BP1 | BD Biosciences | 612522 | dilué à 1:500 dans un tampon de coloration |
| Anticorps anti-géminine. | Abcam | ab104306 | dilué à 1:200 dans un tampon de coloration |
| Anticorps anti-géminine ; | ProteinTech | 10802-1-AP | dilué à 1:400 dans un tampon de coloration |
| Anticorps anti-RAD51 ; | Abcam | ab133534 | dilué à 1:1000 dans un tampon de coloration |
| Anticorps anti-yH2AX ; | Millipore-Sigma | 05-636 | dilué à 1:500 dans un tampon de coloration |
| Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) | Anticorps Bethyl Laboratories ; | A300-245A-M | dilué à 1:200 dans un tampon de coloration |
| Albumine sérique bovine (BSA) | Fisher Scientific ; | BP1605 100 | |
| Centrifugeuse ; Centrifugeuse Sorvall St 16R | Thermo Scientific ; | ||
| 75004240 Microscope confocal, système confocal Leica SP5 DMI4000 | Leica ; | ||
| Tubes coniques, 15 mL | Corning ; | 14-959-53A | |
| Compteur de cellules automatisé Countess 3 FL (machine de comptage de cellules) ; | Thermo Scientific ; | ||
| Lames de chambre de comptage de cellules Countess | Thermo Scientific ; | C10228 | |
| Cover Slip | LA Couleurs | N’importe quel vernis à ongles transparent suffira | |
| Cultrex ; Extrait de membrane basale RGF, type 2 | R& D Systems ; | 3533-010-02 | Pourrait probablement utiliser Matrigel ou une autre matrice BME. |
| DAPI ; | Thermo Scientific ; | ; R37606 | NucBlue Réactif Ready Probes, dilué dans 1x PBS ; |
| Glycine ; | Fisher Scientific ; | ||
| JCountPro | JCountPro | Pour accéder au logiciel, Email : jcountpro@gmail.com ; | |
| Tubes de microcentrifugation ; | Fisher Scientific ; | 07-000-243 | |
| Vernis à ongles ; | StatLab | SL102450 | |
| parafomraldéhyde (PFA), 2 % ; | Sciences de la microscopie électronique ; | 157-4 | Diluer à 4 % de PFA dans PBS++ pour obtenir |
| tampon de perméabilisation de 2 | Fabriqué en laboratoire | 0,2 % de X-100 Triton dans PBS++ | |
| Pipette | Rainin | 17014382 | |
| Pointes de pipette ; | Pluie ; | ||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Scientific ; | ; P36930 | |
| Tampon de coloration ; | Fabriqué en laboratoire | 0,5 % BSA, 0,15 % glycine, 0,1 % X-100 Triton en PBS++ | |
| Système de lames de chambre Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II ; | Thermo Scientific ; | 12-565-8 | |
| Triton X-100 | Sigma-Alderich ; | ||
| Trypan Blue Solution, 0,4 % | Thermo Scientific ; | ||
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | enzyme recombinante sans origine animale |
| Irradiateur biologique X-RAD 320. | Irradiation de précision aux rayons X ; | X-RAD320 |
Références
- Lheureux, S., Gourley, C., Vergote, I., Oza, A. M. Epithelial ovarian cancer. Lancet Oncology. 393 (10177), 1240-1253 (2019).
- Tew, W. P., et al. PARP inhibitors in the management of ovarian cancer: ASCO guideline. Journal of Clinical Oncology. 38 (30), 3468-3493 (2....
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Réimpressions et autorisations
