Nous présentons ici un protocole d’évaluation d’un cœur implanté hétérotopiquement après préservation ex situ normothermique dans le modèle du rat.
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Article de méthode
Modèle de rat de transplantation cardiaque hétérotopique perfusée ex situ normamère
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Résumé
Résumé
La transplantation cardiaque est le traitement le plus efficace pour l’insuffisance cardiaque terminale. Malgré les améliorations apportées aux approches et aux interventions thérapeutiques, le nombre de patients atteints d’insuffisance cardiaque en attente d’une transplantation continue d’augmenter. La technique de conservation ex situ normotherme a été établie comme une méthode comparable à la technique conventionnelle d’entreposage frigorifique statique. Le principal avantage de cette technique est que les cœurs des donneurs peuvent être conservés jusqu’à 12 h dans un état physiologique. De plus, cette technique permet la réanimation du cœur du donneur après une mort circulatoire et applique les interventions pharmacologiques requises pour améliorer la fonction du donneur après l’implantation. De nombreux modèles animaux ont été établis pour améliorer les techniques de préservation ex situ normotherme et éliminer les complications liées à la conservation. Bien que les modèles de grands animaux soient faciles à manipuler par rapport aux modèles de petits animaux, ils sont coûteux et difficiles. Nous présentons un modèle de conservation du cœur de donneur normotherme ex situ suivie d’une transplantation abdominale hétérotopique. Ce modèle est relativement bon marché et peut être réalisé par un seul expérimentateur.
Introduction
La transplantation cardiaque reste le seul traitement viable pour l’insuffisance cardiaque réfractaire 1,2,3,4. Malgré une augmentation constante du nombre de patients nécessitant une transplantation cardiaque, une augmentation proportionnelle de la disponibilité des organes de donneurs n’a pas été observée5. Pour résoudre ce problème, de nouvelles approches visant à préserver le cœur des donneurs ont été élaborées dans le but d’améliorer les défis et d’accroître la disponibilité des donneurs 6,7,8,9.
La perfusion cardiaque ex situ normamère (NESHP) à l’aide de machines de système de soins d’organes (OCS) est apparue comme une intervention clinique 1,3. Cette technique a été considérée comme une alternative appropriée à la méthode conventionnelle d’entreposage frigorifique statique (SCS) 2,9. NESHP réduit efficacement la durée de l’ischémie froide, diminue la demande métabolique et facilite l’apport nutritionnel optimal et l’oxygénation pendant le transport des organes du donneur10,11. Malgré le potentiel évident de cette méthode pour améliorer la conservation des organes des donneurs, son application clinique et ses recherches ultérieures ont été limitées par des coûts élevés. Par conséquent, les modèles animaux précliniques du NESHP sont cruciaux pour identifier les principaux défis techniques associés à cette technique12,13. Les porcs et les rats sont les modèles animaux préférés pour les études précliniques en raison de leur tolérance ischémique9. Bien que le modèle porcin soit idéal pour la recherche fondamentale et translationnelle, il est limité par son coût élevé et la main-d’œuvre intensive requise pour les soins et la maintenance. En revanche, les modèles de rats sont moins chers et plus faciles à manipuler14.
Dans cette étude, nous introduisons un modèle simplifié de NESHP chez le rat, suivi d’une transplantation cardiaque hétérotopique, afin d’évaluer l’impact de la technique de préservation sur l’état du greffon post-implantation. Ce modèle est simple, rentable et peut être exécuté par un seul expérimentateur. La figure 1 montre les schémas de la procédure.
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Protocole
Le comité d’éthique du Centre de recherche sur les animaux de laboratoire de l’hôpital universitaire national de Chonnam (approbation no. CNU IACUC - H - 2022-36) a approuvé toutes les expériences sur les animaux. Les rats Sprague-Dawley mâles (350-450 g) utilisés dans cette étude ont reçu des soins conformément aux lignes directrices sur le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Les rats ont été logés dans des pièces à température contrôlée avec un cycle lumière-obscurité de 12 heures, avec de la nourriture et de l’eau standard disponibles.
1. Préparation
REMARQUE: Un seul expérimentateur peut effectuer toutes les procédures expérimentales.
- Assembler l’appareil de Langendorff, y compris l’oxygénateur, la pompe et les conduites de perfusion, avant la chirurgie (figure 2). Remplissez le circuit de perfusion avec 20 ml de solution saline et faites-le circuler jusqu’à ce qu’il soit amorcé avec du sang autologue.
NOTE: L’objectif de cette étape est de réchauffer le circuit extracorporel. - Fixer la ligne cardioplégique au circuit via le robinet fixé à la canule aortique et préparer la pompe à seringue pour la perfusion cardioplégique finale.
REMARQUE: Assurez-vous de l’élimination des bulles d’air du circuit de perfusion et de la ligne cardioplégique. - Placez le capteur de température dans le réservoir où le cœur du donneur sera stocké, en maintenant la température du circuit à 37 °C.
- Préparations chirurgicales
- Préparez un ensemble distinct de micro-instruments et de matériel stériles pour chaque rat donneur et receveur.
- Préparez l’ensemble chirurgical pour le donneur: paire de ciseaux chirurgicaux, paire de micro-pinces, pinces anti-moustiques tranchantes, sutures en soie 5-0, cotons-tiges, seringue de 50 mL, ligne de perfusion pour la solution cardioplégique (CPS), pompe à seringue, angiocathéter de 18 G, un jeu de 5 cathéters fémoraux Fr. et gazes stériles.
- Préparez l’ensemble chirurgical pour le receveur: ciseaux microchirurgicaux, rétracteur de plaie, paire de micro-pinces, pinces anti-moustiques, micro-pinces vasculaires, seringue de 1 mL, une suture en polypropylène 5-0 et 9-0, sutures en soie 5-0, cotons-tiges et gazes stériles.
- Préparez un ensemble distinct de micro-instruments et de matériel stériles pour chaque rat donneur et receveur.
2. Préservation du cœur du donneur et prélèvement sanguin
- Induire l’anesthésie chez le rat donneur avec de l’isoflurane (5%) dans la chambre d’anesthésie et noter le poids du rat avant de le placer sur la table chirurgicale.
- Placez le rat en décubitus dorsal sur la table chirurgicale et administrez une anesthésie continue en délivrant 2% à 2,5% d’isoflurane avec 90% d’oxygène par le nez.
- Vérifiez la profondeur de l’anesthésie en vérifiant l’absence de réponse au pincement des orteils et la fréquence respiratoire, qui devrait être comprise entre 50 et 60 par minute.
REMARQUE: Un niveau adéquat d’anesthésie est crucial pour éviter un stress et une douleur inutiles au rat donneur. - Appliquez du lubrifiant pour les yeux et rasez la région pubienne sur la clavicule, où la chirurgie sera effectuée. Nettoyez la zone avec un gommage à base d’iode et 70% d’alcool.
- Cathétérisme
- Faites une incision abdominale médiane de 7 cm et des incisions bilatérales mesurant 3 cm du processus xiphoïde à la clavicule médiane. Retirez la peau de la région thoracique.
- À l’aide de cotons-tiges, mobiliser les organes abdominaux vers le côté gauche de l’abdomen. Isoler l’aorte abdominale du fascia rétropéritonéal et des tissus adipeux.
- Injecter 1 000 UI d’héparine dissoute dans 0,3 mL de solution saline isotonique à travers la veine cave inférieure (IVC) à l’aide d’une seringue de 1 mL. Arrêtez tout saignement du trou de l’aiguille en comprimant doucement avec un coton-tige.
REMARQUE: Méfiez-vous de l’embolie gazeuse pendant l’injection, car elle peut entraîner un arrêt cardiaque. - Insérez un cathéter fémoral de 5 Fr. dans l’aorte abdominale (Abd. A). Assurez-vous que l’extrémité du cathéter atteint l’arc aortique. Confirmer l’emplacement du cathéter en évaluant la longueur approximative de la partie insérée du cathéter.
- Collecte de sang
- Prélever environ 10 mL de sang via le cathéter inséré dans l’Abd. A.
- Plus tard, diluez le sang d’amorçage avec une solution saline isotonique jusqu’à ce que le volume total atteigne 12 mL. Ajouter 5 mg de céfazoline dissoute dans 0,3 mL de solution saline et d’insuline (20 UI).
- Arrêt cardiaque
- Connectez la ligne de perfusion CPS préalablement préparée au cathéter abdominal et commencez l’administration de CPS avec la pompe à seringue à un débit de 800 mL/h.
- Ouvrez la cavité thoracique du diaphragme et coupez l’IVC près du diaphragme pour éviter la distension ventriculaire. Couper les côtes bilatéralement le long de la colonne thoracique jusqu’à l’entrée thoracique. Réfléchissez la paroi thoracique ventrale mobilisée de manière supérieure avec des pinces anti-moustiques.
- Retirez entièrement le thymus à l’aide de micro-pinces pour visualiser l’arc aortique. Appliquer une légère compression si les artères thymiques saignent.
- Extraction
- Après avoir administré tous les CPS, isolez l’arc aortique des tissus environnants. Disséquer soigneusement juste en dessous de l’artère sous-clavière gauche.
- Transecter les artères carotides brachiocéphales et gauches communes à distance, laissant les moignons plus longs de l’arc aortique pour une manipulation facile pendant la canulation de l’aorte. Transecter l’artère pulmonaire principale (PAM) aussi près que possible de la bifurcation. Veillez à ne pas endommager l’appendice auriculaire gauche.
- Ligaturez soigneusement la veine cave supérieure (SVC) et IVC avec des sutures de soie 5-0, empêchant l’obstruction de l’oreillette droite (PR) et du sinus coronaire. Couvrez les bords gauches du thorax avec de la gaze humide, placez le cœur dessus et rétractez doucement les ligatures SVC et IVC pour exposer le hile.
- Libellez les veines pulmonaires et azygos avec une suture en soie 5-0. Sectionner le tissu dorsal à la ligature et extraire le cœur. Examinez le cœur pour toute blessure. Enfin, pesez le cœur avant la canulation aortique.
3. Perfusion ex situ
- Canulation et perfusion de l’aorte
- Avant la canulation de l’aorte, remplacez le circuit amorcé par une solution saline par un amorçage sanguin.
- Insérez la canule aortique dans l’arc aortique et fixez-la avec une micro-pince temporaire. Assurez-vous que la pointe de la canule est positionnée à la jonction brachiocéphalique.
- Confirmez la position correcte de la canule en saisissant doucement l’aorte avec des micro-pinces.
- Démarrer la perfusion à un débit de 2-3 mL/min, permettant au perfusat de s’échapper du site de canulation pour éliminer les bulles d’air.
- Surveillez la pression et la température de perfusion grâce au capteur connecté au système de surveillance.
- Massez doucement le cœur avec le premier et l’index jusqu’à ce que du sang veineux s’échappe de l’artère pulmonaire principale (AMP).
- Fixez l’aorte avec une ligature de soie 1-0 et retirez la pince après avoir vérifié tous les réglages (circuit de perfusion, pression de perfusion, température).
- Une fois la ligature permanente placée, assurez-vous que le cœur commence à se contracter en quelques secondes et atteint un rythme normal en 60 s. Une pression de perfusion moyenne de 55-65 mmHg avec un débit coronaire de 3-4 mL à 37 °C indique une perfusion adéquate.
- Prélever 0,15 mL de sang dans le réservoir et vérifier l’analyse des gaz du sang (BGA) au début de la perfusion et toutes les 20 minutes par la suite. Surveillez et enregistrez le pH, le pCO 2, le pO2, le glucose, l’hématocrite, le potassium et le lactate pendant la perfusion. Après 120 minutes de perfusion, administrer 3 mL de Custodiol à travers la pompe à seringue à un débit de 250 mL/h pour arrêter le cœur.
4. Implantation
- Préparation du destinataire
- Commencer la préparation du récipient 30 min avant l’arrêt de la perfusion ex situ .
- Anesthésier l’animal receveur en utilisant la même méthode que celle mentionnée à l’étape 2.2.
- Placez le rat en décubitus dorsal sur le coussin chauffant et insérez la sonde de température dans le rectum pour maintenir la température corporelle à 37 °C.
- Appliquez un lubrifiant pour les yeux, rasez le pubis sur la région épigastrique et nettoyez la zone avec un gommage à base d’iode et d’alcool à 70%.
- Médicaments
- Injectez 2 mL de solution saline chaude par voie sous-cutanée pour compenser la perte de liquide pendant la chirurgie. Injecter 200 UI d’héparine par voie sous-cutanée.
- Administrer une antibioprophylaxie en injectant 10 mg/kg de céfazoline dissoute dans 0,3 mL de solution saline par voie sous-cutanée ou intramusculaire.
- Administrer un contrôle de la douleur en injectant 20 mg / kg de diclofénac par voie sous-cutanée.
- Effectuez la laparotomie médiane et insérez un rétracteur pour élargir la cavité abdominale. Mobiliser les organes abdominaux vers le côté gauche du receveur à l’aide de coton-tiges pour faire de la place pour la procédure.
- Prévenez la déshydratation en enveloppant les organes abdominaux avec de la gaze chaude et humide. Étaler par intermittence une solution saline chaude avec une seringue de 50 ml pendant la chirurgie.
- À l’aide d’un microscope chirurgical avec un grossissement de 10x, mobiliser le duodénum et le jéjunum proximal par dissection contondante avec des cotons-tiges pour exposer l’Abd. A. et IVC. Préparez l’Abd. A et IVC pour l’anastomose et implanter systématiquement le cœur du donneur, conformément à la figure 3 ou aux méthodes précédemment documentées15.
NOTE: Ne séparez pas l’Abd. A. et IVC.- En supposant que l’anastomose vasculaire soit placée infrarénale, préparer une partie suffisante de l’aorte et de l’IVC pour le clampage.
- Effectuez une préparation émoussée à l’aide de coton-tiges ou de pinces dentelées pour enlever les graisses et le fascia autour des vaisseaux.
- Placez 5-0 ligatures de soie sur les branches mésentériques et les côtés crânien et caudale des principaux vaisseaux. Élever les vaisseaux abdominaux et coaguler ou ligaturer les branches lombaires avec des sutures de soie 5-0. N’oubliez pas d’épargner les artères et les veines testiculaires et de ne pas les serrer.
- Utilisez des ligatures pour soulever les vaisseaux et positionner les micro-pinces sur les branches mésentériques, les côtés caudal et crânien des principaux vaisseaux pour arrêter le flux sanguin au site de l’anastomose. Éteignez le coussin chauffant avant de placer les pinces, car un excès de chauffage peut exacerber l’ischémie des membres. Assurez-vous d’allumer le coussin chauffant après avoir déserré les récipients pour éviter l’hypothermie.
- Percer l’aorte à l’aide d’une aiguille de 27 G et allonger l’incision avec des micro-ciseaux à une longueur égale ou légèrement supérieure à l’ouverture de l’aorte ascendante donneuse (Asc. A), qui est d’environ 5 mm.
- Faites une incision longitudinale sur l’IVC de la même manière que l’aortotomie, mais faites-la 3 mm plus près de la face caudale par rapport à l’incision de l’aorte.
- En commençant les anastomoses, placez le cœur du donneur sur le côté droit de l’abdomen du receveur et attachez l’Asc du donneur. A à l’Abd du destinataire. A avec un point simple interrompu (polypropylène 9-0) au coin crânien de l’incision longitudinale.
- Déplacez le cœur vers le côté gauche de l’abdomen receveur et effectuez une anastomose de l’ASC du donneur. A avec Abd du destinataire. A utilisant une suture en polypropylène 9-0.
- Fixez l’artère pulmonaire donneuse à l’IVC avec deux sutures interrompues (polypropylène 9-0) aux coins caudale et crânien de l’incision longitudinale.
- Effectuer la première moitié de l’anastomose veineuse à partir du côté intraluminal du vaisseau et compléter la seconde moitié du côté extraluminal du vaisseau. Avant de serrer les nœuds, rincer le champ avec une solution saline pour éviter l’embolie gazeuse.
- Désaération et décompression
- Retirez d’abord la pince veineuse mésentérique après avoir terminé l’anastomose pour permettre au côté droit du cœur de se remplir de sang veineux.
- Retirez l’air dans le circuit coronaire et Asc. A. en appliquant une perfusion coronaire rétrograde pendant plusieurs secondes.
- Placez un morceau de gaze des deux côtés des vaisseaux et retirez la pince caudale et la pince crânienne.
- Appliquer une légère compression avec des cotons-tiges pendant 1-2 min. Après avoir assuré une hémostase adéquate, retirez les écouvillons et lavez les anastomoses avec une solution saline chaude.
REMARQUE: Le cœur devrait commencer à battre dans la première minute de la reperfusion. Si la température corporelle du rat receveur est inférieure à 35 °C, le rythme cardiaque se normalisera après que la température aura atteint 36 °C.
- Replacez les organes abdominaux de manière sinueuse et fermez les couches de l’incision abdominale à l’aide de sutures continues en polypropylène 5-0.
- Après la chirurgie, placez l’animal anesthésié sur un endroit propre au-dessus d’un coussin chauffant jusqu’à ce que la température corporelle atteigne 37 °C.
REMARQUE: Ne commencez pas les examens postopératoires avant que la température corporelle atteigne 37 ° C. Maintenir l’anesthésie à 2-2,5% d’isoflurane jusqu’à la fin des expériences. - Surveiller l’ECG du cœur du donneur transplanté pendant 3 h. Ensuite, excisez le cœur sous anesthésie profonde pour des études histologiques.
REMARQUE: Confirmez la profondeur de l’anesthésie par l’absence de réflexe de pédale avant d’exciser le cœur. L’intervention chirurgicale et la surveillance de l’ECG prennent moins de 6 h. Le diclofénac, administré en périopératoire (étape 4.2.3.), permet de gérer la douleur pendant toute la durée de cette procédure. Le régime analgésique peut être ajusté conformément aux lignes directrices institutionnelles sur l’utilisation des animaux.
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Résultats
La figure 1 illustre le plan expérimental utilisé dans un modèle de petit animal. La figure 2 montre l’appareil de perfusion de Langendorff modifié, qui comprend un oxygénateur pour petits animaux. L’ordre de l’anastomose pour l’implantation abdominale hétérotopique est présenté à la figure 3.
La figure 4 montre les paramètres utilisés pour évaluer la viabilité du cœur pendan...
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Discussion
Notre objectif en établissant ce modèle était de reproduire la transplantation cardiaque humaine normotherme. Les modèles non éjectifs sont la technique couramment préférée pour préserver le cœur du donneur dans un environnement ex situ 16. Bien que les modèles d’éjection offrent de nombreux avantages dans l’évaluation de la fonction cardiaque lors de la perfusion ex situ 17, ils ne conviennent pas aux modèles de transplantation hétérotopique. Dans la tran...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par une subvention B2021-0991 de l’Institut de recherche biomédicale de l’hôpital universitaire national de Chonnam et NRF-2020R1F1A1073921 de la Fondation nationale de recherche de Corée
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Système d’évacuation active AES | Smiths medical | PC-6769-51A | Utilise le CO2 et l’excès d’isoflurane |
| Appareil d’anesthésie | Smiths medical | PC-8801-01A | Mélange l’isoflurane et l’oxyegn et fournit à l’animal |
| B20 Moniteur patient | GE systèmes médicaux | B20 | pour observer la pression aortique moyenne et la température |
| Système de surveillance homéothermique Appareil | Harvard | 55-7020 | Pour surveiller et maintenir la température de l’animal |
| Oxygénateur de rat Micro-1 | Instruments médicaux Dongguan Kewei | Micro-MO | Pour l’échange gazeux dans le circuit de langendorff |
| Introducteur de micropuncture Set | COOK medical | G48007 | pour l’administration d’une solution cardioplégique à l’arcade par l’aorte abdominale |
| Microscope | Amscope | MU1403 | Pour le zoom chirurgical terrain (Receveur) |
| Loupe chirurgicale | SurgiTel | L2S09 | Pour zoomer champ chirurgical (Donneur) |
| Pompe à seringue | AMP all | SP-8800 | Pour délivrer une solution cardioplégique |
| Capteur de débit transsonique | Transonic | ME3PXL-M5 | Capteur de débit de circuit de perfusion |
| Module de débit de tubulure transsonique | d’acquisition de débit | Transonic | TS410 |
| Watson - Pompes Marlow | Appareil Harvard | 010.6131.DAO | Pompe péristaltique utilisée pour le perfusat de recirculation |
| WBC-1510A | JEIO TECH | Bain chauffant | |
| Rats Sprague-Dawley | Samtako Bio Korea Co., Ltd., Osan City Korea | ||
| Medications | |||
| BioHAnce Gel Gouttes ophtalmiques | SENTRIX Soins pour animaux | pommades humides pour les yeux | |
| Cefazolin | JW pharmaceutique | Pour la prophilaxie | |
| Custodiol | DR, FRANZ KOHLER CHEMIE GMBH | Pour le prélèvement cardiaque | |
| Diclofenac | Myungmoon Pharm. Co. Ltd | Pour le contrôle de la douleur | |
| Héparine | JW pharmaceutique | Anticoagulant | |
| Insuline | JW pharmaceutique | hormonthérapie | |
| Saline | JW pharmaceutical | Pour la thérapie d’hydratation |
Références
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Réimpressions et autorisations
Erratum
Formal Correction: Erratum: Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation
Posted by JoVE Editors on 8/28/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation. The Protocol section was updated.
Section 4 of the Protocol was updated from:
4. Implantation
- Preparation of recipient
- Begin the recipient preparation 30 min before the cessation of ex situ perfusion.
- Anesthetize the recipient animal using the same method as mentioned in step 2.2.
- Place the rat in a supine position on the heating pad and insert the temperature probe into the rectum to maintain the body temperature at 37 °C.
- Apply eye lubricant, shave the pubic to the epigastric area, and cleanse the area with an iodine-based scrub and 70% alcohol.
- Medications
- Inject 2 mL of warm saline subcutaneously to compensate for the fluid lost during the surgery. Inject 200 IU of heparin subcutaneously.
- Administer antibiotic prophylaxis by injecting 10 mg/kg cefazolin dissolved in 0.3 mL of saline subcutaneously or intramuscularly.
- Administer pain control by injecting 20 mg/kg of diclofenac subcutaneously.
- Perform the mid-line laparotomy and insert a retractor to widen the abdominal cavity. Mobilize the abdominal organs to the left side of the recipient using cotton swabs to make space for the procedure.
- Prevent dehydration by wrapping the abdominal organs with warm and wet gauze. Intermittingly spread warm saline with a 50 mL syringe during the surgery.
- Utilizing a surgical microscope with a 10x magnification, mobilize the duodenum and proximal jejunum by blunt dissection with cotton swabs to expose the Abd. A. and IVC. Prepare the Abd. A and IVC for anastomosis and systematically implant the donor heart, in accordance with Figure 3 or previously documented methods15.
NOTE: Do not separate the Abd. A. and IVC.- Assuming vascular anastomosis to be placed infrarenal, prepare a sufficient portion of the aorta and IVC for clamping.
- Perform blunt preparation using cotton swabs or sharp-serrated forceps to remove the fats and fascia around the vessels.
- Place 5-0 silk ligatures to the mesenteric branches and both the cranial and caudal sides of the major vessels. Elevate the abdominal vessels and coagulate or ligate the lumbar branches with 5-0 silk sutures. Remember to spare the testicular arteries and veins and do not clamp them.
- Use ligatures to lift the vessels and position the micro-clamps to the mesenteric branches, caudal, and cranial sides of the major vessels to stop the blood flow at the anastomosis site. Be sure to switch off the heating pad before placing the clamps, as excess heating can exacerbate limb ischemia.
- Puncture the aorta using a 27 G needle and elongate the incision with micro scissors to a length equal to or slightly larger than the opening of the donor ascending aorta (Asc. A), which is approximately 5 mm.
- Make a longitudinal incision on the IVC in the same way as the aortotomy, but make it 3 mm closer to the caudal side compared to the aorta incision.
- Starting the anastomoses, placed the donor heart on the right side of the recipient's abdomen and attach the donor Asc. A to the recipient's Abd. A with one simple interrupted stitch (9-0 polypropylene) at the cranial corner of the longitudinal incision.
- Move the heart to the left side of the recipient abdomen and perform anastomosis of the donor's Asc. A with the recipient's Abd. A using a running 9-0 polypropylene suture.
- Fixate the donor pulmonary artery to the IVC with two interrupted sutures (9-0 polypropylene) at the caudal and cranial corners of the longitudinal incision.
- Perform the first half of the venous anastomosis from the intraluminal side of the vessel and complete the second half from the extraluminal side of the vessel. Before tightening the knots, flush the field with saline to prevent air embolism.
- De-airing and de-clamping
- Remove the mesenteric vein clamp first after completing the anastomosis to allow the right side of the heart to fill with venous blood.
- Remove the air in the coronary circuit and Asc. A. by applying retrograde coronary perfusion for several seconds.
- Place a piece of gauze on both sides of the vessels and remove the caudal clamp and the cranial clamp.
- Apply gentle compression with cotton swabs for 1-2 min. After ensuring adequate hemostasis, remove the swabs and wash the anastomoses with warm saline.
NOTE: The heart should begin beating within the first minute of reperfusion. If the recipient rat's body temperature is below 35 °C, the heart rhythm will normalize after the temperature reaches 36 °C.
- Replace the abdominal organs in a meander-like manner and close the layers of the abdominal incision using continuous 5-0 polypropylene sutures.
to:
4. Implantation
- Preparation of recipient
- Begin the recipient preparation 30 min before the cessation of ex situ perfusion.
- Anesthetize the recipient animal using the same method as mentioned in step 2.2.
- Place the rat in a supine position on the heating pad and insert the temperature probe into the rectum to maintain the body temperature at 37 °C.
- Apply eye lubricant, shave the pubic to the epigastric area, and cleanse the area with an iodine-based scrub and 70% alcohol.
- Medications
- Inject 2 mL of warm saline subcutaneously to compensate for the fluid lost during the surgery. Inject 200 IU of heparin subcutaneously.
- Administer antibiotic prophylaxis by injecting 10 mg/kg cefazolin dissolved in 0.3 mL of saline subcutaneously or intramuscularly.
- Administer pain control by injecting 20 mg/kg of diclofenac subcutaneously.
- Perform the mid-line laparotomy and insert a retractor to widen the abdominal cavity. Mobilize the abdominal organs to the left side of the recipient using cotton swabs to make space for the procedure.
- Prevent dehydration by wrapping the abdominal organs with warm and wet gauze. Intermittingly spread warm saline with a 50 mL syringe during the surgery.
- Utilizing a surgical microscope with a 10x magnification, mobilize the duodenum and proximal jejunum by blunt dissection with cotton swabs to expose the Abd. A. and IVC. Prepare the Abd. A and IVC for anastomosis and systematically implant the donor heart, in accordance with Figure 3 or previously documented methods15.
NOTE: Do not separate the Abd. A. and IVC.- Assuming vascular anastomosis to be placed infrarenal, prepare a sufficient portion of the aorta and IVC for clamping.
- Perform blunt preparation using cotton swabs or sharp-serrated forceps to remove the fats and fascia around the vessels.
- Place 5-0 silk ligatures to the mesenteric branches and both the cranial and caudal sides of the major vessels. Elevate the abdominal vessels and coagulate or ligate the lumbar branches with 5-0 silk sutures. Remember to spare the testicular arteries and veins and do not clamp them.
- Use ligatures to lift the vessels and position the micro-clamps to the mesenteric branches, caudal, and cranial sides of the major vessels to stop the blood flow at the anastomosis site. Switch off the heating pad before placing the clamps, as excess heating can exacerbate limb ischemia. Ensure to switch on the heating pad after de-clamping the vessels to avoid hypothermia.
- Puncture the aorta using a 27 G needle and elongate the incision with micro scissors to a length equal to or slightly larger than the opening of the donor ascending aorta (Asc. A), which is approximately 5 mm.
- Make a longitudinal incision on the IVC in the same way as the aortotomy, but make it 3 mm closer to the caudal side compared to the aorta incision.
- Starting the anastomoses, placed the donor heart on the right side of the recipient's abdomen and attach the donor Asc. A to the recipient's Abd. A with one simple interrupted stitch (9-0 polypropylene) at the cranial corner of the longitudinal incision.
- Move the heart to the left side of the recipient abdomen and perform anastomosis of the donor's Asc. A with the recipient's Abd. A using a running 9-0 polypropylene suture.
- Fixate the donor pulmonary artery to the IVC with two interrupted sutures (9-0 polypropylene) at the caudal and cranial corners of the longitudinal incision.
- Perform the first half of the venous anastomosis from the intraluminal side of the vessel and complete the second half from the extraluminal side of the vessel. Before tightening the knots, flush the field with saline to prevent air embolism.
- De-airing and de-clamping
- Remove the mesenteric vein clamp first after completing the anastomosis to allow the right side of the heart to fill with venous blood.
- Remove the air in the coronary circuit and Asc. A. by applying retrograde coronary perfusion for several seconds.
- Place a piece of gauze on both sides of the vessels and remove the caudal clamp and the cranial clamp.
- Apply gentle compression with cotton swabs for 1-2 min. After ensuring adequate hemostasis, remove the swabs and wash the anastomoses with warm saline.
NOTE: The heart should begin beating within the first minute of reperfusion. If the recipient rat's body temperature is below 35 °C, the heart rhythm will normalize after the temperature reaches 36 °C.
- Replace the abdominal organs in a meander-like manner and close the layers of the abdominal incision using continuous 5-0 polypropylene sutures.
- After the surgery, place the anesthetized animal on a clean area over a heating pad until the body temperature reaches 37°C.
NOTE: Do not initiate the postoperative examinations till the body temperature reaches 37°C. Maintain anesthesia at 2-2.5% isoflurane until the end of the experiments. - Monitor ECG of the transplanted donor heart for 3 h. Then, excise the heart under deep anesthesia for histological studies.
NOTE: Confirm anesthesia depth via lack of pedal reflex before excising the heart. The surgical procedure and the ECG monitoring take less than 6 h. Diclofenac, administered perioperatively (step 4.2.3.), enables pain management for the entire duration of this procedure. The analgesia regimen can be adjusted per the institutional animal use guidelines.
