Le présent protocole décrit comment utiliser une lésion médiée par FeCl3 pour induire une thrombose artérielle, et comment collecter et préparer des échantillons de lésions artérielles à différents stades de la thrombose pour l’analyse en microscopie électronique.
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Article de méthode
Thrombose artérielle induite par le chlorure ferrique et prélèvement d’échantillons pour analyse en microscopie électronique 3D
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les maladies cardiovasculaires sont l’une des principales causes de mortalité et de morbidité dans le monde. La thrombose aberrante est une caractéristique commune des affections systémiques comme le diabète et l’obésité, et des maladies inflammatoires chroniques comme l’athérosclérose, le cancer et les maladies auto-immunes. En cas de lésion vasculaire, le système de coagulation, les plaquettes et l’endothélium agissent généralement de manière orchestrée pour prévenir les saignements en formant un caillot sur le site de la blessure. Les anomalies de ce processus entraînent soit des saignements excessifs, soit une thrombose incontrôlée / une activité antithrombotique insuffisante, ce qui se traduit par une occlusion des vaisseaux et ses séquelles. Le modèle de lésion carotidienne induite par FeCl3 est un outil précieux pour sonder comment la thrombose commence et progresse in vivo. Ce modèle implique des dommages endothéliaux/dénudation et la formation subséquente de caillots sur le site blessé. Il fournit un test quantitatif très sensible pour surveiller les dommages vasculaires et la formation de caillots en réponse à différents degrés de dommages vasculaires. Une fois optimisée, cette technique standard peut être utilisée pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents à la thrombose, ainsi que les changements ultrastructuraux dans les plaquettes dans un thrombus en croissance. Ce test est également utile pour étudier l’efficacité des agents antithrombotiques et antiplaquettaires. Cet article explique comment initier et surveiller la thrombose artérielle induite par FeCl3 et comment prélever des échantillons pour analyse par microscopie électronique.
Introduction
La thrombose est la formation d’un caillot sanguin qui bloque partiellement ou complètement un vaisseau sanguin, entravant la circulation naturelle du sang. Cela conduit à des événements cardiovasculaires graves et mortels, tels que les cardiopathies ischémiques et les accidents vasculaires cérébraux. Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de morbidité et de mortalité, et causent un décès sur quatre dans le monde 1,2,3. Bien que la thrombose se manifeste par un dysfonctionnement du système vasculaire, elle pourrait être le résultat d’une infection microbienne....
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Protocole
Toutes les expériences discutées ici ont été examinées et approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université du Kentucky.
REMARQUE : Les instruments chirurgicaux sont énumérés à la figure 1 et dans le tableau des matériaux. Des souris C57BL/6J, âgées de 8 à 10 semaines, mâles/femelles ou des souches génétiquement modifiées (Knockout ou Knockin) ont été utilisées.
1. Lésion de l’artère carotide induite par FeCl3
- Induction de l’anesthésie chez la souris
- Pesez la souris. ....
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Résultats
Les données sont généralement présentées comme le temps jusqu’à l’occlusion, ou le temps nécessaire pour former un thrombus complètement occlusif. Ces données peuvent être tracées sous la forme d’une courbe de survie de Kaplan-Meier (Figure 4A)19, d’un diagramme à points avec des barres montrant le flux sanguin terminal au moment de l’arrêt du flux sanguin ou de la fin d’une expérience (Figure 4B), ou sous forme de graphique linéaire (Figure 4C).<.......
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Discussion
L’application topique de FeCl3 au système vasculaire pour induire la thrombose est une technique largement utilisée et a joué un rôle déterminant dans l’établissement des rôles de divers récepteurs plaquettaires, des voies de signalisation des ligands et de leurs inhibiteurs20,21,22,23. Le mécanisme par lequel FeCl3 provoque la thrombose est multiforme; Auparavant, la dénu.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts lié à cette étude.
Profils ORCID : S.J. : 0000-0001-6925-2116; S.W.W.: 00000-0001-5577-0473.
Remerciements
Les auteurs remercient les membres du Laboratoire Whiteheart pour leur lecture attentive de ce manuscrit. Le travail a été soutenu par des subventions du NIH, NHLBI (HL56652, HL138179 et HL150818), et une bourse du mérite du ministère des Anciens Combattants à S.W.W., R01 HL 155519 à B.S., et une subvention du programme intra-muros NIBIB à R.D.L.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,9 % de solution saline ; | Fisher Scientific ; | BP358-212 | NaCl utilisé pour faire une solution de solution saline à 0,9 % ; |
| Seringue de 1 ml ; | Becton, Dickinson et Cie. | ||
| Éthanol 190 proof ; | KOPTEC | V1101 ; | Utilisé pour fabriquer une solution d’éthanol à 70 % à utiliser pour préparer la souris à la chirurgie. |
| 2,2,2 Tribromoéthanol | Sigma Aldrich | 48402 | |
| 25 Yard Noir Tressé Suture en Soie (5-0) | DEKNATEL | 136082-1204 | |
| 26G x 3/8 Aiguille ; | Becton, Dickinson et Cie. | 305110 | |
| 2-méthyl-2-butanol | Sigma Aldrich | 240486 | |
| Pipette de transfert de 7,5 ml, graduée à 3 mL | Globe Scientific Inc. | 135010 | |
| Tampons de préparation à l’alcool (alcool isopropylique à 70 %) | Medline | MDS090735 | |
| Araldite GY 502 ; | Services de microscopie électronique ; | 10900 | |
| Plat de culture cellulaire 35mm x 10mm ; | Corning Incorporated ; | ||
| Balance compacte | Ward’s Science ; | 470314-390 | |
| Ciseaux de dissection, longueur 12,5 cm | World Precision Instrument | 15922-G | |
| DMP-30 activateur ; | Services de microscopie électronique ; | 13600 | |
| Anhydride dodénylsuccinique/ DDSA | Services de microscopie électronique ; | 13700 | |
| Doggy Poo Bags/sac d’élimination de carcasse d’animal | Crown Products ; | PP-RB-200 | |
| Doppler FlowProbe | Transonic Systems Inc. | MA0.5PSB | |
| EMBED 812 résine ; | Services de microscopie électronique ; | 14900 | |
| , anhydre 200 proof ; | Services de microscopie électronique ; | 15055 | |
| Pince à pansement oculaire, 4" entièrement incurvée, standard, pointes larges de 0,8 mm | Integra Miltex | 18-784 | |
| Papier filtre ; | VWR | 28310-106 | |
| Ciseaux fins - Outils | de science fine tranchants | 14028-10 | |
| Poinçons d’oreille à boucle de doigt | Outils de science fine ; | 24212-01 | |
| Éponges de gaze 2 » x 2 » &ndash ; 12 plis ; | Dukal Corporation | 2128 | |
| Glutaraldéhyde (solution à 10 %) | Services de microscopie électronique ; | 16120 | |
| Integra Miltex Lame chirurgicale en acier au carbone #10 | Integra® ; Miltex® ; | 4110 | |
| Chlorure de fer (III) ; | SIGMA-ALDRICH | 157740-100G | |
| Manche de couteau Miltex® ; Acier inoxydable extra fin taille 3 | Integra Lifesciences ; | 157510 | |
| Acide L-aspartique | Sigma ; Fisher | ; A93100 | |
| Acide L-aspartique | Fisher Scientific ; | BP374-100 | |
| Nitrate de plomb | Fisher Scientific ; | L-62 | |
| LEICA S8AP0 Microscope | LEICA | N’est plus disponible | N’est plus disponible chez le fabricant |
| LEICA S8AP0 Microscope Stand ; | LEICA | 10447255 | N’est plus disponible auprès de l’entreprise |
| Essuie-tout léger ; | VWR | 82003-822 | |
| Micro pince à dissectionnement ; 1x2 dents, pleine courbure ; largeur de pointe de 0,8 mm ; longueur de 4 | " Roboz Surgical Instrument Company | RS-5157 | |
| Tétroxyde d’osmium 4 % solution aqueuse ; | Services de microscopie électronique ; | 19150 | |
| Paraformaldéhyde (solution à 16 %) | Microscopie électronique Services ; | 15710 | |
| Ferricyanure de potassium | SIGMA-ALDRICH | P-8131 | |
| Oxyde de propylène, réactif ACS ; | Services de microscopie électronique ; | 20401 | |
| Pipette classique Rainin PR-10 | Débitmètre | de recherche 17008649 | |
| ; | Systèmes Transonic Inc. | Modèle T402B01481 | : T402 |
| Scotch Magic Invisible Tape, 3/4 » x 1000 », | transparent | ||
| Coussin chauffant pour petits animaux | K& H Manufacturing Inc. | Modèle : HM10 | |
| Tampon de cacodylate de sodium 0.2M, pH7.4 | Microscopie électronique Services ; | 11623 | |
| Applicateurs stériles à pointe de coton ; | Produits Médicaux Puritains ; | 25-806 1WC | |
| Illuminateur Steromaster ; | Fisher Scientific ; | 12-562-21 | N’est plus disponible chez l’entreprise |
| Surgical Dumont #7 Forceps ; | Outils de science fine ; | 11271-30 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | SIGMA-ALDRICH | 88535 | |
| Recharge universelle à faible rétention de l’embout de pipette (0,1-10 & micro ; L) | VWR | 76323-394 | |
| Acétate d’uranyle | Services de microscopie électronique ; | 22400 | |
| Veet Gel Cream Épilateur | Reckitt Benckiser | 3116875 | |
| Blanc Antistatique Hexagonal Pesées Bateaux, Moyen, 64 x 15 x 19 mm | Fisher Scientific ; | S38975 | |
| Logiciel WinDAQ/100 pour Windows | DATAQ Instruments, Inc. | Version 3.38 | Disponible en téléchargement gratuit. https://www.dataq.com/products/windaq/ |
| ZEISS AxioCam Icc 1 | ZEISS | 57615 |
Références
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
- Raskob, G. E., et al.
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Réimpressions et autorisations
