Mesure du transport de la cargaison axonale dans les neurones corticaux primaires cultivés de souris

Résumé

Le présent protocole décrit l’ensemble de la procédure d’analyse pour le transport axonal. En particulier, le calcul de la vitesse de transport, sans compter la pause, et la méthode de visualisation à l’aide du logiciel en libre accès « KYMOMAKER » sont présentés ici.

Résumé

Les cellules neuronales sont des cellules hautement polarisées qui hébergent de manière stéréotypée plusieurs dendrites et un axone. La longueur d’un axone nécessite un transport bidirectionnel efficace par les protéines motrices. Divers rapports ont suggéré que des défauts dans le transport axonal sont associés à des maladies neurodégénératives. De plus, le mécanisme de coordination de plusieurs protéines motrices a été un sujet intéressant. Étant donné que l’axone a des microtubules unidirectionnels, il est plus facile de déterminer quelles protéines motrices sont impliquées dans le mouvement. Par conséquent, la compréhension des mécanismes sous-jacents au transport de la cargaison axonale est cruciale pour découvrir le mécanisme moléculaire des maladies neurodégénératives et la régulation des protéines motrices. Ici, nous présentons l’ensemble du processus d’analyse du transport axonal, y compris la culture des neurones corticaux primaires de souris, la transfection des plasmides codant pour les protéines de cargaison et les analyses directionnelles et de vitesse sans effet de pause. De plus, le logiciel en libre accès « KYMOMAKER » est introduit, qui permet de générer un kymographe pour mettre en évidence les traces de transport en fonction de leur direction et permettre une visualisation plus facile du transport axonal.

Introduction

Les membres de la famille des kinésines et la dynéine cytoplasmique sont des protéines motrices qui se déplacent le long des microtubules dans les cellules pour transporter leur cargaison¹. La plupart des kinésines se déplacent vers l’extrémité positive, tandis que la dynéine se déplace vers l’extrémité négative d’un microtubule. Les fonctions et les mécanismes du transport de marchandises dans l’axone neuronal ont été étudiés de manière approfondie. En raison de leur longueur, les axones ont besoin d’un transport stable sur de longues distances pour maintenir la santé des neurones. Des défauts dans le transpor....

Protocole

Les expériences ont été approuvées par le Comité d’études animales de l’Université d’Hokkaido, conformément aux directives ARRIVE (Animal Research : Reporting of In Vivo Experiments). Des souris femelles C57BL/6J (gestantes, 15,5 jours) ont été utilisées pour la présente étude.

1. Préparation de neurones corticaux primaires cultivés de souris

1. Ajouter 0,1 mg/mL de poly-L-lysine dans 0,1 M de Tris (tris(hydroxyméthyl)aminométhane)-HCl (pH 8,5) dans une chambre à fond de verre à 8 puits (n° 1.0) (voir le tableau des matériaux). Incuber la chambre dans un incubateur....

Résultats

Les neurones primaires cultivés du cortex de souris E15.5 ont été cultivés dans une boîte à fond de verre comme décrit. À titre d’exemple, APP-EGFP, Alcα-EGFP ou Alcβ-EGFP ont été exprimés dans les neurones corticaux primaires. On sait que l’APP et l’Alcα sont transportés dans l’axone par la kinésine-1 ^2,17. L’APP s’associe à la kinésine-1 via la protéine adaptatrice JIP1 (protéine interagissant avec JNK 1), tandis que l’Alcα se lie directement via

Discussion

Une méthode d’analyse du transport axonal est décrite, qui comprend le calcul de la vitesse segmentée et la génération de kymographes. Une étape critique de l’étape de transfection est le maintien de la santé des neurones en culture. La méthode de transfection décrite par Jiang et Chen²⁹ a été suivie avec des modifications mineures. Le mélange doux de la solution d’ADN/CaCl₂ et de 2x HBS a augmenté l’efficacité de la transfection en réduisant la taille .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
5-Fluoro-2-désoxyuridine	Sigma-Aldrich	F0503
Apo TIRF 100x/1.49 HUILE	Nikon
B-27 Supplément (50x), sans sérum	Thermo fischer scientific	17504044
Albumine sérique bovine	Wako	013-25773
CalPhos Kit de transfection de mammifères	Takara	631312
Passoire à cellules  ; 40 et micro ; m Nylon	Falcon	352340
CoolSNAP HQ	Photometrics
Deoxyribonuclease I	Sigma-Aldrich	DN-25
D-Glucose	Wako	041-00595
DMEM/Ham' s F-12	Wako	042-30555
Dumont N° 7 pince	Dumont  ;	N°7
Lame chirurgicale plume  ;	Feather	No.11
Poignée de lame chirurgicale Feather  ;	Plume	n° 3
Gentamicine	Wako	079-02973
Sulfate de gentamicine	Wako	075-04913
Supplément GlutaMAX Thermo	fischer scientific	35050061
HEPES	DOJINDO	342-01375
Sérum de cheval, inactivé thermiquement	Thermo fischer scientific	26050088
KCl	Wako	163-03545
KH2PO4	Wako	169-04245
KYMOMAKER			http://www.pharm.hokudai.ac.jp/shinkei/Kymomaker.html
L-15 Medium (Leibovitz)	Sigma-Aldrich	L5520
MetaMorph version 6.2r1  ;	Metamorph
Na2HPO4	Wako	197-02865
NaCl	Wako	197-01667
NaHCO3	Wako	191-01305
Neurobasal Medium	Thermo fischer	scientific 21103049
Nikon ECLIPSE TE 2000-E	Nikon
Nunc Lab-Tek  ; 8 puits Coverglass à chambre	Thermo fischer scientific	155411
Papain	Worthington	LS003126
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Bromhydrate de poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P2636-500MG
Base Trizma	Merck	T1194-10PAK	résolu avec de l’eau pour obtenir 0,1 M Tris-HCl (pH.8.5)