Stimulation multimodale automatisée et enregistrement neuronal simultané à partir de plusieurs petits organismes

Résumé

Nous présentons une méthode pour la stimulation chimique flexible et multimodale et l’enregistrement de l’activité neuronale simultanée de nombreux vers Caenorhabditis elegans . Cette méthode utilise la microfluidique, du matériel et des logiciels open source et une analyse automatisée supervisée des données pour permettre la mesure de phénomènes neuronaux tels que l’adaptation, l’inhibition temporelle et la diaphonie de stimulus.

Résumé

Les indicateurs de calcium fluorescents codés génétiquement ont grandement contribué à notre compréhension de la dynamique neuronale depuis le niveau des neurones individuels jusqu’à des circuits cérébraux entiers. Cependant, les réponses neuronales peuvent varier en raison de l’expérience antérieure, des états internes ou des facteurs stochastiques, générant ainsi le besoin de méthodes permettant d’évaluer la fonction neuronale chez de nombreux individus à la fois. Alors que la plupart des techniques d’enregistrement examinent un seul animal à la fois, nous décrivons l’utilisation de la microscopie à grand champ pour étendre les enregistrements neuronaux à des dizaines de Caenorhabditis elegans ou d’autres organismes à l’échelle inférieure à la fois. Le matériel et les logiciels open source offrent une grande flexibilité dans la programmation d’expériences entièrement automatisées qui contrôlent l’intensité et le moment de divers types de stimulus, y compris les stimuli chimiques, optiques, mécaniques, thermiques et électromagnétiques. En particulier, les dispositifs d’écoulement microfluidique fournissent un contrôle précis, reproductible et quantitatif des stimuli chimiosensoriels avec une résolution temporelle inférieure à la seconde. Le pipeline d’analyse de données semi-automatisé NeuroTracker extrait ensuite les réponses neuronales individuelles et à l’échelle de la population pour découvrir les changements fonctionnels dans l’excitabilité et la dynamique neuronales. Cet article présente des exemples de mesure de l’adaptation neuronale, de l’inhibition temporelle et de la diaphonie stimulus. Ces techniques augmentent la précision et la répétabilité de la stimulation, permettent l’exploration de la variabilité de la population et sont généralisables à d’autres signaux fluorescents dynamiques dans de petits biosystèmes, des cellules et organoïdes aux organismes entiers et aux plantes.

Introduction

Les techniques d’imagerie calcique ont permis l’enregistrement non invasif de la dynamique neuronale in vivo en temps réel à l’aide de la microscopie à fluorescence et d’indicateurs de calcium génétiquement codés exprimés dans les cellules cibles ^1,2,3. Ces capteurs utilisent généralement une protéine fluorescente verte (GFP), telle que la famille de peptides GFP-calmodulin-M13 (GCaMP), pour augmenter l’intensité de fluorescence lors de l’activation neuronale et des niveaux élevés de calcium intracellulaire. L’imagerie calcique a été particulièrement puissante chez l....

Protocole

1. Équipement d’imagerie neuronale

REMARQUE : voir Lawler et Albrecht¹⁵ pour obtenir des instructions détaillées sur la construction du système d’imagerie et de stimulation, qui contrôle le moment de l’illumination du microscope, l’acquisition d’images et la délivrance de stimuli (Figure 1). Un contrôleur de stimulus Arduino Nano peu coûteux actionne les vannes fluidiques via des signaux numériques vers un contrôleur de vanne et contrôle l’éclairage optogénétique via des signaux de tension analogiques vers un contrôleur LED. D’autres stimuli, tels que les moteurs de vibrat....

Résultats

Nous présentons plusieurs exemples de modèles de stimulus qui évaluent différents phénomènes neuronaux, y compris l’inhibition temporelle, l’adaptation et la désinhibition. L’inhibition temporelle est la suppression momentanée d’une réponse neuronale à une deuxième présentation de stimulus survenant peu de temps après la présentation initiale¹⁴. Pour tester ce phénomène, dans une expérience d’impulsion appariée, huit modèles consistant en deux impulsions odorantes de 1 s séparées .......

Discussion

Dans ce protocole, nous décrivons un système de microscopie en libre accès pour l’évaluation des phénomènes d’activité neuronale en utilisant la livraison temporellement précise de différents modèles de stimulus. La plate-forme microfluidique fournit des stimuli reproductibles tout en maintenant des dizaines d’animaux dans le champ de vision du microscope. Peu de logiciels de microscopie commerciaux permettent de programmer facilement divers modèles de synchronisation de stimulus, et ceux qui le font nécessitent souvent .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Souches bactériennes
E.  ; coli (OP50)	Caenorhabditis Centre de Génétique (CGC)	Cat# OP50
Modèles expérimentaux : Organismes/souches
C.  ; souches elegans exprimant GCaMP (et éventuellement, Chrimson) dans les neurones souhaités	Caenorhabditis Genetics Center (CGC) ou auteurs correspondants de l’œuvre publiée	NZ1091, par exemple
Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies
2,3-Butanedione	Sigma-Aldrich	Cat# B85307	diacétyle, exemple chimique stimulus
Chlorure de calcium, CaCl2	Sigma-Aldrich	Cat# C3881
Fluorescéine, sel de sodium	Sigma-Aldrich	Cat# F6377
Hydrofuge en verre	Rain-X	Cat #800002250	traitement hydrophobe en verre (à usage unique)
Chlorure de magnésium, MgCl2	Sigma-Aldrich	Cat# M2393
Gélose gélose Genesee		Cat # : 20-273NGM
Boîtes de Pétri (60  ; mm)	Tritech	Cat #T3305
Poly(diméthylsiloxane) (PDMS) : Sylgard 184	Dow Chemical	Cat# 1673921
Phosphate de potassium monobasique	Sigma-Aldrich	Cat# P5655
Phosphate de potassium dibasique	Sigma-Aldrich	Cat# P8281
Chlorure de sodium, NaCl	Sigma-Aldrich	Cat# S7653
(tridécafluoro-1,1,2,2-tétrahydrooctyl)trichlorosilane (TFOCS)	Gelest	CAS# 78560-45-9	traitement hydrophobe du verre (durable)
Software and algorithms
Arduino IDE	Arduino	https://www.arduino.cc/en/software
ImageJ	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/
MATLAB	MathWorks	https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Micro-manager Micro-manager		https://micro-manager.org/
Logiciel de contrôle de	microscope Albrecht Lab	https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl
Logiciel d’analyse de données Neurotracker	Albrecht Lab	https://github.com/albrechtLab/Neurotracker
Automated Microscope and Stimulation System
Axio Observer.A1 microscope inversé configuré pour l’épifluorescence (cubes de filtre GFP, objectif 5× ou similaire)	Zeiss	Cat #491237-0012-000
Excelitas X-cite XYLIS Illuminateur LED	Excelitas	Cat #XYLIS
Orca Flash 4.0 Caméra numérique sCMOS	Hamamatsu	Cat #C11440-22CU
Arduino nano	Arduino	Cat #A000005
Vanne d’isolement miniature Diapragm à 3 voies (LQX12)	Parker	Cat #LQX12-3W24FF48-000	Vanne 1 :
Commande 2 voies normalement fermée (NC) Vanne à manchon	Bio-Chem Valve Inc	Cat #075P2-S432	Vanne 2 :
Sortie Vanne à manchon 3 voies	NResearch	Cat #161P091	Valve 3 : Stimulus sélection
LED et contrôleur de stimulation optogénétique (615 nm)	Mightex	Cat #PLS-0625-030-S et #SLA-1200-2
ValveLink 8.2 contrôleur de vanne numérique/manuel	AutoMate Scientific	Cat #01-18
Fils et connecteurs	divers	Voir Fig. 2 du protocole Cell STARS (Lawler, 2021)
Microfluidic Device Preparation
Coupeuse rotative à vitesse variable Dremel 4000  ;	Dremel	Cat #F0134000AB	Réglez la vitesse à 5k RPM pour couper le verre
Perceuse à colonne Dremel outil rotatif poste de travail	Dremel	Cat #220-01
Foret diamanté	Dremel	Cat #7134
Glissière de verre, 1  ; mm d’épaisseur	VWR	Cat #75799-268
Scribe en verre (Diamond scriber)	Ted Pella	Cat #54468
Luer 3-way stopcock	Cole-Parmer	Cat #EW-30600-07
Luer 23 G Blunt needle	VWR	Cat #89134-100
Dispositif microfluidique	Corresponing author or make à partir de fichiers CAD associés à cet article	N/A
Pince de dispositif microfluidique	Warner Instruments (ou atelier d’usinage)	P-2
Tube microfluidique, 0.02&Prime ; ID	Cole-Parmer	Cat #EW-06419-01
Tube 19 g, 0.5&Prime ;	Chat de petit tube de la Nouvelle-Angleterre	#NE-1027-12