Article de méthode

Quantification et caractérisation du génome entier de l’ARN du SRAS-CoV-2 dans les eaux usées et les échantillons d’air

DOI :

10.3791/65053

⸱

30 juin 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Sustainable Processes, University of Valladolid, 2Department of Chemical Engineering and Environmental Technology, University of Valladolid, 3Department of Public Health Microbiology, National Laboratory of Health, Environment and Food, 4ICBAS - School of Medicine and Biomedical Sciences, Porto University, 5Epidemiology Research Unit (EPIUnit), Instituto de Saúde Pública da Universidade do Porto, 6Laboratório para a Investigação Integrativa e Translacional em Saúde Populacional (ITR)

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole vise à quantifier l’ARN du SRAS-CoV-2 dans les eaux usées et les échantillons d’air destinés à être utilisés pour des études épidémiologiques basées sur les eaux usées et à évaluer le risque d’exposition au SRAS-CoV-2 dans les aérosols intérieurs et extérieurs. Ce protocole décrit également une approche de séquençage à matrice longue d’amplicon en mosaïque pour la caractérisation du génome entier du SRAS-CoV-2.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’épidémiologie basée sur les eaux usées est apparue comme un système de surveillance prometteur et efficace du SRAS-CoV-2 et d’autres maladies infectieuses dans de nombreux pays. Le processus implique généralement la concentration des eaux usées, l’extraction d’acides nucléiques, l’amplification de segments génomiques sélectionnés, ainsi que la détection et la quantification du segment génomique amplifié. Cette méthodologie peut également être utilisée pour détecter et quantifier les agents infectieux, tels que le SRAS-CoV-2, dans les échantillons d’air. Initialement, on a présumé que le SRAS-CoV-2 se propageait principalement par contact personnel étroit avec des gouttelettes générées par une personne infectée en parlant, en éternuant, en toussant, en chantant ou en respirant. Cependant, un nombre croissant d’études ont signalé la présence d’ARN du SRAS-CoV-2 dans l’air des établissements de santé, établissant la transmission par voie aérienne comme une voie viable pour le virus. Cette étude présente un ensemble de protocoles établis pour faciliter la détection, la quantification et le séquençage des virus dans l’environnement à partir d’échantillons d’eaux usées et d’air.

Introduction

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En décembre 2019, une nouvelle maladie appelée COVID-19 est apparue, causée par un coronavirus jusque-là inconnu, le SRAS-CoV-21. La pandémie mondiale qui en a résulté a représenté un défi de taille pour les laboratoires cliniques et de santé publique du monde entier, car un grand nombre de personnes ont besoin de tests pour évaluer avec précision la transmission et la prévalence du virus dans la communauté. Cependant, dans de nombreuses régions, il est économiquement impossible d’atteindre le niveau nécessaire de tests en temps opportun et de manière spatialement complète 2,3. Les systèmes de surveillance actuels, basés sur des diagnostics cliniques individuels, dépendent fortement de la gravité des symptômes et de la déclaration individuelle, ainsi que de la mesure dans laquelle ces symptômes se chevauchent avec les maladies existantes circulant dans la population 4,5,6,7,8,9,10. Par conséquent, un nombre élevé de cas asymptomatiques contribue à une sous-estimation significative de la charge de morbidité 7,11.

En raison de ces défis, l’épidémiologie basée sur les eaux usées (WBE) pour la surveillance de la COVID-19 a été proposée comme stratégie de surveillance complémentaire. Le WBE a été décrit pour la première fois en 200112 et a d’abord été utilisé pour retracer la cocaïne et d’autres drogues illégales13. Cette approche repose sur l’hypothèse qu’il est possible de calculer la concentration initiale de toute substance stable dans les eaux usées et excrétée par l’homme 8,12. WBE a été mis en œuvre avec succès dans de nombreux pays en tant que système de surveillance complémentaire et efficace du SRAS-CoV-2 3,8,14,15,16. La majorité des méthodes de détection des virus humains en milieu aquatique suivent les étapes suivantes : concentration, extraction des acides nucléiques, amplification du ou des segments génomiques choisis, et détection/quantification du segment génomique amplifié3.

Un autre environnement important pour la détection et la quantification du SRAS-CoV-2 est celui des échantillons d’air. Initialement, on pensait que le SRAS-CoV-2 se transmettait principalement par contact personnel étroit avec des gouttelettes respiratoires provenant d’aérosols générés par une personne infectée en parlant, en éternuant, en toussant, en chantant ou en respirant17. Cependant, plusieurs études ont commencé à signaler la présence d’ARN du SRAS-CoV-2 dans l’air, en particulier dans les établissements de santé et autres espaces clos 18,19,20,21. Des preuves de viabilité du SRAS-CoV-2 dans des échantillons d’air prélevés à l’intérieur des hôpitaux et d’autres espaces clos ont été trouvées lorsque la concentration du virus était suffisamment élevée22,23,2 4. Les études en plein air n’ont généralement trouvé aucune preuve de la présence du SRAS-CoV-2, sauf dans les espaces extérieurs bondés 21,25,26,27,28,29. À l’heure actuelle, la transmission aérienne du SRAS-CoV-2 a été reconnue comme un mode de transmission30,31. Une étude récente montre les différences entre l’extérieur, où les risques de transmission par voie aérienne sont minimes à l’extérieur des zones surpeuplées, et l’intérieur, où des risques plus importants pourraient être présents dans des environnements mal ventilés dans lesquels des sources fortes (c’est-à-dire le nombre de personnes infectées) pourraient être présentes. Une étude approfondie récente a mis en évidence les différences substantielles entre les risques de transmission par voie aérienne dans les environnements extérieurs et intérieurs, en particulier dans les zones surpeuplées où la ventilation est faible. L’étude indique que le risque de transmission par voie aérienne est minime dans les environnements extérieurs, où il y a un plus grand volume d’air disponible pour la dilution et la dispersion des particules virales32. Ces résultats ont des implications importantes pour les politiques et les directives de santé publique liées à la COVID-19. En reconnaissant les différences significatives dans les risques de transmission entre les environnements intérieurs et extérieurs, les décideurs peuvent élaborer des stratégies plus efficaces pour atténuer la propagation du virus et protéger la santé publique.

Il existe une variété de méthodes et de protocoles pour la détection, la quantification et le séquençage du SRAS-CoV-2 à partir de différents échantillons environnementaux. Cet article sur la méthode vise à présenter une combinaison de protocoles bien établis qui permettent à des laboratoires ayant différents niveaux de capacité d’effectuer la détection, la quantification et le séquençage environnementaux des virus à partir d’échantillons d’eaux usées et d’air.

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Protocole

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Toutes les méthodes décrites ici ont été publiées ailleurs et contiennent de petites modifications par rapport aux méthodes originales.

1. Collecte des eaux usées et prétraitement des échantillons

REMARQUE : En raison des faibles concentrations d’ARN du SRAS-CoV-2 dans les échantillons environnementaux, la mise en œuvre d’une étape de concentration est cruciale pour une détection réussie33,34,35. Il s’agit de la première méthode de détection du SRAS-CoV-2 dans les eaux usées36.

  1. Prélèvement et concentration d’échantillons d’eaux usées
    1. Prélever 1 L d’échantillon d’eaux usées composites sur 24 h. Conservez l’échantillon à 4 °C et procédez au protocole dans les 24 heures.
    2. Homogénéisez l’échantillon en agitant doucement le flacon. Prélever 70 mL dans un tube centrifuge de 100 mL ou diviser l’échantillon en deux tubes centrifuges de 50 mL.
    3. Augmenter de 20 μL de mengovirus (3,2 x 10,3 copies/μL) dans 70 mL de chaque échantillon comme contrôle interne du processus de concentration. Vous pouvez également injecter 10 μL de mengovirus (3,2 x 103 copies/μL) dans chaque tube à centrifuger de 50 mL.
    4. Homogénéiser l’échantillon et centrifuger à 700 x g pendant 10 min pour éliminer les grosses particules et les organismes (pastilles).
    5. Utiliser le surnageant obtenu pour la concentration avec des dispositifs d’ultrafiltration centrifuge avec un seuil de coupure de 10 KDa en centrifugeant à 4 000 x g pendant 40 min à 4 °C. Éluer le concentré en centrifugeant à 700 x g pendant 40 min et en inversant la position du dispositif d’ultrafiltration.
    6. Mesurez le volume du concentré obtenu. Le volume changera en fonction de la quantité de solides dans l’échantillon qui obstruent les filtres centrifuges. Dans cette étude, les volumes de concentré obtenus se situaient entre 200 et 1 200 μL.
    7. Utilisez le concentré obtenu pour l’extraction de l’ARN à l’aide d’un kit commercial ou d’une méthode interne. Pour les échantillons utilisés dans cette étude, un kit commercial spécifique pour l’extraction de l’ARN viral avec un volume d’élution de 50 μL est utilisé.
    8. Mesurez la concentration de l’ARN extrait à l’aide d’un kit de quantification de l’ARN fluorométrique. Diviser l’ARN extrait en aliquotes et congeler à -80 °C jusqu’à une analyse plus approfondie.
      NOTA : Pour chaque ensemble de procédures d’isolement de l’ARN, un contrôle négatif de l’isolement (NCI) doit être inclus, contenant uniquement des tampons pour détecter une éventuelle contamination pendant l’extraction.
  2. Prélèvement d’échantillons d’air à l’aide d’un échantillonneur d’air compact Coriolis
    1. Choisissez une stratégie d’échantillonnage en fonction de l’objectif de la recherche en définissant la fréquence d’échantillonnage et les lieux d’échantillonnage.
    2. Réglez le débit sur l’échantillonneur d’air (ici, 50 L/min pendant 30 min). Veuillez noter qu’un débit supérieur à 200 L/min peut dégrader l’ARN viral, il est donc recommandé d’utiliser un débit inférieur à 200 L/min.
    3. Placez un cône stérile dans l’échantillonneur d’air avant de commencer le prélèvement en pulsant le démarrage. Une fois l’échantillonnage terminé, ajoutez 5 à 15 mL de solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) dans le cône. Agitez doucement l’échantillon à la main pendant 15 s. Conservez les échantillons jusqu’à 24 h à 4 °C ou à -80 °C dans des cryotubes.
    4. Une étape de concentration facultative peut être effectuée. Nettoyez et décontaminez les cônes après chaque expérience à l’aide d’eau de Javel.
    5. Extraire l’ARN à l’aide d’un kit commercial ou d’une méthode interne. Pour les échantillons de cette étude, un kit commercial spécifique pour l’extraction de l’ARN viral avec un volume d’élution de 50 μL est utilisé.
    6. Mesurez la concentration de l’ARN extrait à l’aide d’un kit de quantification de l’ARN fluorométrique. Diviser l’ARN extrait en aliquotes et congeler à -80 °C jusqu’à une analyse plus approfondie.
      NOTA : Pour chaque ensemble de procédures d’isolement de l’ARN, un contrôle négatif de l’isolement (NCI) doit être inclus, contenant uniquement des tampons pour détecter une éventuelle contamination pendant l’extraction.

2. Quantification de l’ARN du SARS-CoV-2 par réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel (RT-qPCR)

REMARQUE : Le protocole ci-dessous est conforme au panel de diagnostic RT-PCR37 du CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV). Divisez le mélange amorce/sonde en plusieurs aliquotes pour éviter les cycles de congélation et de décongélation.

  1. Préparer le mélange principal de réactions pour chaque cible (mengovirus ; SARS-CoV-2 [gènes N1 et N2]) comme dans le tableau 1, dans une hotte propre dans la salle d’installation des réactifs. Mélangez le mélange amorces/sonde et l’enzyme par inversion cinq fois. Alternativement, le vortex d’impulsion de lumière le mélange d’amorces / sonde et l’enzymecinq fois.
    REMARQUE : Gardez tous les réactifs au froid pendant la préparation et l’utilisation. Afin de minimiser les cycles de gel-dégel, il est fortement recommandé de congeler en aliquotes.
  2. Essorez (1 000 x g pendant 15 à 30 s) les tubes pour recueillir le contenu au fond et placez les tubes dans une grille froide ou sur de la glace.
  3. Étiqueter les tubes de microcentrifugation de 1,5 ml pour chaque cible. Ajouter à chaque tube de microcentrifugation la quantité de chaque réactif nécessaire (volume par réaction, fois le nombre de réactions, y compris les contrôles nécessaires). Mélanger en pipetant de haut en bas et centrifuger pendant 5 s pour recueillir le contenu au fond.
  4. Conservez les tubes de microcentrifugation dans une grille froide et distribuez 15 μL dans des tubes PCR en bandelette ou une plaque à 96 puits dans une grille de refroidissement. Couvrez la plaque et déplacez-la dans la zone de manipulation des acides nucléiques (conservez-la dans une grille de refroidissement).
  5. Décongeler une aliquote d’ARN extrait et tourbillonner doucement pendant 5 s. Pipeter 5 μL d’ARN (en plus de 5 μL de témoin sans matrice [NTC], de contrôle négatif d’isolement [NCI] et de contrôle positif [PC]) dans chaque puits de réaction ou tube contenant le mélange maître préalablement préparé. Changez souvent de gants au besoin pour éviter la contamination croisée.
  6. Couvrez l’ensemble de la plaque ou des tubes de réaction et tourbillonnez doucement. Centrifuger (1 000 x g pendant 15-30 s) la plaque ou les tubes PCR.
  7. Démarrer la RT-qPCR de 25 μL avec les conditions de cyclage suivantes : transcriptase inverse à 45 °C pendant 10 min ; activation de la polymérase à 95 °C pendant 10 min ; 45 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 15 s ; et recuit/extension à 60 °C pendant 45s.
  8. Calculer l’efficacité de récupération des contrôles du mengovirus telle que rapportée par Conte et al.38 :
    figure-protocol-1 × 100

3. Variantes de séquençage dans les eaux usées et analyse des données

NOTE : Le protocole décrit est un protocole modifié créé par Quick et al.39,40. Il utilise deux ensembles d’amorces pour l’amplification du génome du SRAS-CoV-2 par la méthodologie de pavage PCR : les amorces ARTIC et les amorces VarSkip. Une combinaison d’amorces est utilisée pour garantir la meilleure couverture du génome et pour minimiser la possibilité de nouvelles mutations entraînant l’échec d’amorces d’un type. En général, le protocole est divisé en trois parties : la transcription inverse (RT) et la génération d’amplicons, la préparation de la bibliothèque de séquençage, et le séquençage et l’analyse des données.

  1. Transcription inverse et génération d’amplicon
    1. Assurez-vous que les échantillons d’entrée ont une valeur connue de seuil de cyclage (Ct) qPCR pour les diluer correctement dans de l’eau de qualité PCR. La valeur Ct est obtenue lors de la quantification par qPCR. Les dilutions sont les suivantes : si la valeur Ct est comprise entre 12 et 15, diluer les échantillons à 1 :100 ; si la valeur Ct est comprise entre 15 et 18, diluer les échantillons 1 :10 ; si la valeur Ct est comprise entre 18 et 35, ne diluez pas l’échantillon. Les échantillons au-dessus d’une valeur Ct de 35 ont de fortes chances de ne pas fonctionner.
    2. Dans une plaque PCR, pipeter 16 μL de chaque échantillon jusqu’à sa position sur la plaque. Ajouter 4 μL de mastermix de transcription inverse (RT) (5x). Couvrez la plaque et démarrez la réaction PCR dans les conditions suivantes : 25 °C pendant 2 min, 55 °C pendant 20 min et 95 °C pendant 1 min.
    3. Préparez des dilutions de 10 μM de chaque ensemble d’amorces (ARTIC pool A et pool B, et VarSkip pool A et pool B). Préparez le mélange principal pour chaque jeu d’amorces (ensemble ARTIC A et B, et ensemble VarSkip A et B) comme dans le tableau 2. Quatre mastermixes en découleront.
    4. Sur une nouvelle plaque PCR, pipeter 20 μL du mastermix dans chaque puits correspondant. Ajouter 5 μL de l’échantillon RT à chaque mélange.
      REMARQUE : Chaque échantillon comportera quatre mélanges réactionnels : les groupes A et B de l’ARTIC et les groupes A et B de VarSkip.
    5. Couvrir la plaque et démarrer la réaction PCR comme suit : activation de la polymérase à 98 °C pendant 30 s ; 35 cycles de dénaturation à 98 °C pendant 15 s ; et recuit/extension à 65 °C pendant 4 min. Essorez (1 000 x g pendant 15 à 30 s) la plaque. Combinez les pools de réaction ARTIC et combinez séparément les pools de réaction VarSkip. Chaque échantillon aura deux réactions d’amplicon de 50 μL.
    6. Ajouter 50 μL de réactif à base de billes pour la purification par PCR dans chaque puits et bien mélanger par pipetage. Incuber à température ambiante pendant 5 min.
      REMARQUE : Avant chaque utilisation, mélangez vigoureusement le réactif de purification PCR pour remettre les billes en suspension.
    7. Placez la plaque sur un support de séparation magnétique et attendez que les billes forment une pastille et que le liquide s’éclaircisse (~5 min). Pipeter et jeter le surnageant. Conservez la plaque PCR sur le support magnétique.
    8. En maintenant la plaque PCR sur le support magnétique, ajoutez 200 μL d’éthanol à 80 % à chaque échantillon sans toucher la pastille de bille. Retirez l’éthanol.
    9. Répétez l’étape précédente. Laissez la plaque sur le support magnétique à découvert pendant 30 s pour permettre à l’éthanol de s’évaporer.
    10. Retirez la plaque du support magnétique et ajoutez 15 μL d’eau de qualité PCR à chaque échantillon. Remettre le granulé en suspension par pipetage. Incuber à température ambiante pendant 2 min.
    11. Replacez la plaque sur le support magnétique et laissez les perles s’agglutiner (2 min). Pipeter soigneusement 15 μL de surnageant de chaque échantillon sur une nouvelle plaque PCR.
    12. Mesurez la concentration de chaque échantillon à l’aide d’un kit de quantification de l’ARN fluorométrique. Prélever environ 50 ng de chaque échantillon dans 12,5 μL à l’étape suivante. Si nécessaire, diluez l’échantillon dans de l’eau de qualité PCR.
  2. Préparation de la bibliothèque
    1. Ajoutez 1,75 μL de tampon réactionnel du kit de préparation de la banque d’ADN Illumina et 0,75 μL de mélange enzymatique à chaque échantillon. Couvrir brièvement la plaque, tourbillonner et faire tourner vers le bas (1 000 x g pendant 15 à 30 s). Incuber à 21°C pendant 5 min et à 65 °C pendant 5 min.
    2. Dans une nouvelle plaque, pipeter 3 μL d’eau de qualité PCR pour chaque échantillon dans une nouvelle plaque PCR. Ajouter 0,75 μL des échantillons préparés, 1,25 μL de codes-barres pour la préparation de la bibliothèque de séquençage et 5 μL de mélange maître d’ADN ligase T4. Bien mélanger par pipetage, essorer brièvement (1 000 x g pendant 15 à 30 s) dans une centrifugeuse et incuber à 21 °C pendant 20 min et à 65 °C pendant 10 min.
      REMARQUE : Si vous utilisez moins de 25 échantillons, doublez tous les volumes à cette étape.
    3. Regroupez tous les échantillons en ajoutant 10 μL de chaque échantillon dans le même tube à faible liaison. Passez à l’étape suivante avec 480 μL.
    4. Ajouter 192 μL de réactif à base de billes pour la purification par PCR dans le pool et bien mélanger par pipetage. Incuber à température ambiante pendant 10 min.
    5. Placez le tube sur un support magnétique et attendez que le surnageant se dégage et qu’une pastille de bille se forme. Retirez le surnageant. Retirez le tube du support magnétique.
    6. Ajouter 700 μL de tampon à fragments courts (SFB) et mélanger par pipetage. Replacez-le sur le support magnétique et attendez que la pastille se forme et que le liquide s’éclaircisse (~5 min). Pipeter le surnageant et le jeter.
    7. Répétez l’étape précédente. Laissez le tube sur le support magnétique. Ajouter 100 μL d’éthanol à 80 % sans toucher le billet. Pipeter l’éthanol et laisser sécher le cordon pendant 30 s.
      REMARQUE : Ne laissez pas la perle trop sécher.
    8. Retirez le tube du support magnétique et ajoutez 35 μL d’eau de qualité PCR. Mélanger par pipetage et incuber à température ambiante pendant 2 min. Placez le tube sur le support magnétique et laissez la perle s’agglutiner et le liquide s’éclaircir. Pipeter 35 μL du surnageant dans un nouveau tube.
    9. Mesurez la concentration d’ARN de la banque regroupée. Pipetez le volume nécessaire pour atteindre une quantité de 30 à 50 ng d’ARN et remplissez-le d’eau de qualité PCR pour atteindre un volume final de 30 μL.
    10. Préparer le mélange réactionnel de ligature de l’adaptateur : 30 μL de la bibliothèque regroupée, 5 μL de l’Adapter Mix II, 10 μL du tampon de réaction de ligature (5x) et 5 μL de l’ADN ligase T4. Mélanger par pipetage et essorage (1 000 x g pendant 15 à 30 s). Incuber à température ambiante pendant 10 min.
    11. Ajouter 20 μL du réactif à base de billes pour la purification par PCR et mélanger par pipetage. Incuber pendant 10 min à température ambiante.
    12. Placez le tube sur le support magnétique et attendez que la pastille de bille se forme et que le surnageant devienne incolore. Pipeter soigneusement et jeter le surnageant.
    13. Retirer du support magnétique et ajouter 125 μL de SFB. Mélangez par pipetage et replacez sur le support magnétique pour séparer les billes. Lorsque le liquide est clair, pipetez et jetez le surnageant.
    14. Répétez l’étape précédente. Laissez le tube ouvert sur le support magnétique pendant 30 s pour qu’une partie du liquide restant s’évapore.
    15. Retirez le tube du support magnétique et ajoutez 15 μL de tampon d’élution. Bien mélanger en pipetant et essorer brièvement (1 000 x g pendant 15 à 30 s). Incuber à température ambiante pendant 5 min. Placez-le sur le support magnétique pendant 2 min.
    16. Pipeter 15 μL de surnageant dans un nouveau tube à faible liaison. Il s’agit de la bibliothèque finale. Mesurez la concentration à l’aide d’un kit de quantification de l’ADN fluorométrique.
      REMARQUE : À l’étape suivante, 12 μL sont nécessaires. Si la concentration est très élevée et que moins de 12 μL de la bibliothèque sont nécessaires, remplir jusqu’à 12 μL avec le réactif tampon d’élution.
  3. Chargement et séquençage des cellules d’écoulement
    1. Insérez la cellule d’écoulement (R9.4.1) dans le dispositif de séquençage de l’ADN et de l’ARN en temps réel.
    2. Préparez le mélange d’amorçage en ajoutant 30 μL de réactif d’attache de rinçage (FLT) à un tube de réactif tampon de rinçage (FB). Vortex à mélanger et à faire tourner vers le bas (1 000 x g pendant 15 à 30 s).
    3. Ouvrez le couvercle de l’orifice d’amorçage. À l’aide d’une pipette de 1 000 μL, réglez sur 200 μL et insérez l’embout dans l’orifice d’amorçage. Tournez la molette de réglage du volume et augmentez le volume jusqu’à ce que le liquide dans l’embout soit visible. Jetez l’embout.
      REMARQUE : Ne tournez la roue que jusqu’à ce que quelques μL de liquide dans la pointe soient visibles. Le fait de tirer de plus grandes quantités pourrait endommager la cellule d’écoulement.
    4. Ajouter lentement 800 μL du mélange d’amorçage dans l’orifice d’amorçage, en prenant soin de ne pas introduire de bulles. Attendez 5 min.
    5. En attendant, préparez les bibliothèques pour le chargement. Mélangez 37,5 μL du tampon de séquençage, 25,5 μL du tampon de chargement et 12 μL de la bibliothèque.
      REMARQUE : Mélangez le tampon de chargement avant le pipetage. Les billes de ce réactif se déposent très rapidement.
    6. Ouvrez le couvercle du port. Pipeter 200 μL du mélange d’amorçage dans l’orifice d’amorçage.
      REMARQUE : Lors du pipetage dans l’orifice d’amorçage avec l’orifice de couvercle ouvert, on remarquera de petites gouttes provenant de l’orifice d’échantillonnage. Pipetez assez lentement pour que l’orifice d’échantillonnage puisse aspirer les gouttes sans déborder.
    7. Avant de charger la bibliothèque préparée, bien mélanger par pipetage. À l’aide d’une pipette de 100 μL réglée sur 75 μL, prélevez la bibliothèque et la pipette goutte à goutte dans l’orifice d’échantillonnage. Ne touchez pas l’orifice et attendez que chaque goutte soit absorbée dans l’orifice avant de charger la goutte suivante pour éviter le débordement du liquide.
    8. Fermez l’orifice de capot et l’orifice d’amorçage. Ouvrez le logiciel et lancez l’expérience de séquençage. Sélectionnez l’appel de base activé. Pour une bibliothèque de 96 échantillons multiplexés, 10 à 12 h de séquençage suffisent généralement pour générer suffisamment de données.
      REMARQUE : À l’aide du logiciel, on peut insérer la feuille d’échantillon au format .csv. La feuille d’échantillons nécessite les données suivantes : flow_cell_id, position_id, sample_id, experiment_id, flow_cell_product_code et kit. L’ID de la cellule d’écoulement est nécessaire (indiqué sur le côté de la cellule d’écoulement) ainsi que le kit utilisé. Pour le protocole suggéré, le kit LSK109 doit être sélectionné.
  4. Analyse des données de séquençage
    1. Insérez les lectures fastq compressées dans le flux de travail wf-artic41. Exécutez le flux de travail séparément avec deux schémas d’amorce différents (ARTIC/V4.1 et NEB-VarSkip/v1a). Deux « . primertrimmed.rg.sorted.bam » sont créés pour chaque échantillon.
    2. Fusionnez les fichiers BAM en un seul fichier avec la commande « samtools merge »42. Insérez le fichier BAM fusionné dans l’outil Freyja, en laissant les paramètres par défaut, pour récupérer les abondances relatives de la lignée43.
    3. Pour créer un fichier FASTA, insérez le fichier BAM fusionné dans les outils « samtools mpileup » et « ivar » avec les paramètres par défaut44,45. Pour l’appel de mutation, chargez le fichier FASTA dans l’outil Nextclade46,47.

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Résultats

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Les résultats résumés dans le tableau 3 montrent des exemples de détection et de quantification de l’ARN du SRAS-CoV-2 dans des échantillons d’eaux usées et d’air à l’aide de la méthode décrite dans cet article. Des échantillons d’eaux usées ont été prélevés dans des stations d’épuration en Espagne et en Slovénie et ont été considérés comme positifs si le Ct était inférieur à 40 dans au moins deux des trois répétitions, la quantification étant considérée comme valide si le Ct présentait une variation inf...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La détection et la quantification microbiennes et virales à l’aide de méthodes de (RT-)qPCR ont été largement acceptées en raison de leur sensibilité remarquable. Cependant, ces techniques se heurtent à de nombreux défis lors de l’analyse d’échantillons environnementaux. Les échantillons d’eaux usées contiennent une abondance de substances inhibitrices qui peuvent fausser les mesures et générer des résultats trompeurs. Pour remédier à ces limitations et améliorer la précision, un protocole complexe a été conçu, conçu et ...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont pas d’intérêts économiques concurrents ou d’autres conflits d’intérêts.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été réalisé avec le soutien financier du gouvernement régional de Castille-et-León et du programme FEDER (projets CLU 2017-09, UIC315 et VA266P20).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Adaptateur+A25+A2 :D19+A2 :D20+A2+A2 :D19Oxford NanoporeEXP-AMII001Séquençage
AllPrep PowerViral DNA/RNA KitQiagen28000-50Kit d’extraction d’ARN
AMPure XPBeckman CoulterA63880Purification PCR, nettoyage NGS, nettoyage PCR ARTIC
SARS-CoV-2 Amplicon PanelIDT10011442amplification du génome SARS-CoV-2
Blunt/TA Ligase Master MixNEBM0367SPréparation de la bibliothèque
CENTRICON PLUS­ ; 70 10KDA.Fisher Scientific10296062Filtres de concentration
CORIOLIS ÉCHANTILLONNEUR D’AIR COMPACTBertin Technologies083-DU001Échantillonneur d’air
Duran  ; flacons de laboratoireMerckZ305200-10EAFlacons d’échantillonnage
Flow Cell (R9.4.1)NanoporeFLO-MIN106DSequencing
Consommables généraux (tubes, plaques qPCR, etc)
Kit de séquençage de ligatureOxford NanoporeSQK-LSK109Séquençage
LunaScript  ; Kit RT SuperMixNEBE3010  ; synthèse de l’ADNc
Kit de contrôle de l’extraction du mengovirusBiomé ; rieuxKMGContrôle de la concentration
Nalgene General Stockage à long terme Tubes cryogéniquesThermofisher5011-0012Stockage d’échantillons
Native Barcoding Expansion 1-12 (sans PCROxford NanoporeEXP-NBD104Barcoding
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing ModuleNEBE7595Réparation de l’ADN
NEBNext VarSkip Short SARS-CoV-2 Primer MixesNEBE7658Amplification du génome du SARS-CoV-2
NEBNext  ; Tampon de réaction de ligature rapideNEBB6058SSéquençage  ;
Saline tamponnée au phosphateMerckP4474Tampon de collecte
Saline tamponnée au phosphate (PBS, 1X), filtrée stérilementThermofisherJ61196. APÉlution d’échantillons d’air
Q5  ; Démarrage à chaud Haute-Fidélité 2X Master MixNEBM0494Sà démarrage à chaud ADN polymérase
Qubit ARN HS Kit de dosageThermofisherQ32852Quantification de l’ARN
SARS-CoV-2 RUO qPCR Amorce & Kit de sondeIDT10006713Mélange Primer-Sonde et contrôle positif qPCR
TaqPath 1-Step RT-qPCR MasterMix ThermofisherA15299Kit RT-qPCR
Oxford

Références

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