Concentration de particules virales provenant d’échantillons d’eau et d’eaux usées prélevés dans l’environnement par floculation et ultrafiltration du lait écrémé

Résumé

La concentration de virus à partir d’échantillons d’eau et d’eaux usées dans l’environnement est une tâche difficile, effectuée principalement pour l’identification et la quantification des virus. Bien que plusieurs méthodes de concentration virale aient été développées et testées, nous démontrons ici l’efficacité de l’ultrafiltration et de la floculation du lait écrémé pour les virus à ARN avec différents types d’échantillons.

Résumé

L’épidémiologie basée sur l’eau et les eaux usées est apparue comme des méthodes alternatives pour surveiller et prédire l’évolution des épidémies dans les communautés. La récupération des fractions microbiennes, y compris les virus, les bactéries et les microeucaryotes à partir d’échantillons d’eaux usées et d’eau environnementale est l’une des étapes difficiles de ces approches. Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur l’efficacité de récupération de l’ultrafiltration séquentielle et des méthodes de floculation de lait écrémé (SMF) utilisant l’ARN blindé comme virus test, qui est également utilisé comme contrôle par d’autres études. Une préfiltration avec des filtres à disque à membrane de 0,45 μm et 0,2 μm a été appliquée pour éliminer les particules solides avant l’ultrafiltration afin d’éviter le colmatage des dispositifs d’ultrafiltration. Les échantillons d’essai, traités avec la méthode d’ultrafiltration séquentielle, ont été centrifugés à deux vitesses différentes. Une vitesse accrue a entraîné une baisse des taux de récupération et de positivité de l’ARN blindé. D’autre part, SMF a entraîné des taux de récupération et de positivité relativement constants de l’ARN blindé. Des tests supplémentaires effectués avec des échantillons d’eau environnementale ont démontré l’utilité de SMF pour concentrer d’autres fractions microbiennes. La répartition des virus en particules solides pourrait avoir un impact sur les taux de récupération globaux, compte tenu de l’étape de préfiltration appliquée avant l’ultrafiltration des échantillons d’eaux usées. SMF avec préfiltration a donné de meilleurs résultats lorsqu’il est appliqué à des échantillons d’eau environnementale en raison de concentrations solides plus faibles dans les échantillons et donc de taux de séparation plus faibles dans les solides. Dans la présente étude, l’idée d’utiliser une méthode d’ultrafiltration séquentielle est née de la nécessité de diminuer le volume final des concentrés viraux pendant la pandémie de COVID-19, lorsque l’approvisionnement en dispositifs d’ultrafiltration couramment utilisés était limité et qu’il était nécessaire de développer d’autres méthodes de concentration virale.

Introduction

La détermination de la concentration effective de microorganismes dans les échantillons de surface et d’eaux usées pour l’analyse des communautés microbiennes et les études épidémiologiques est l’une des étapes importantes pour surveiller et prévoir l’évolution des éclosions dans les communautés ^1,2. La pandémie de COVID-19 a révélé l’importance d’améliorer les méthodes de concentration. La COVID-19 est apparue à la fin de 2019 et, en mars 2023, constitue toujours une menace pour la santé humaine, la vie sociale et l’économie. Les stratégies efficaces de surveillance et de contrôle visant à atténuer les réperc....

Protocole

1. Comparaison de l’ultrafiltration en série et de la floculation du lait écrémé avec les virus concentrés dans les échantillons d’eaux usées

1. Préparation des échantillons
   1. Prélever 2 L d’échantillons composites d’eaux usées brutes (influentes) proportionnels au débit sur 24 h. Des échantillons ont été prélevés dans les trois principales usines de traitement des eaux usées (STEP) de Winnipeg, au Canada, au cours de l’été et de l’automne 2020 (tableau 1).
   2. Transporter les échantillons au laboratoire dans des bouteilles résistantes à la lumière dans une glacière et les traiter dans les 24 heures. Recueillir des ....

Résultats

Évaluation des méthodes de concentration de l’ARN viral
Les six échantillons traités avec de l’UF-3k x g étaient positifs et ont donné lieu à une récupération de 13,38 % ± 8,14 % (figure 1). Un seul échantillon était positif lorsque les échantillons ont été traités avec de l’UF-7,5k x g. Tous les échantillons traités avec SMF étaient positifs et ont donné lieu à un taux de récupération de 15,27 % ± de 2,65 % (figure 1). Les .......

Discussion

L’une des étapes critiques de cette étude est l’élimination des particules solides par l’application d’une étape de préfiltration avec des filtres à membrane de 0,2 μm et 0,45 μm. Compte tenu de la répartition des virus en particules solides, en particulier en virus enveloppés, la préfiltration peut entraîner une perte importante de récupération^virale30. Alors qu’une étape de préfiltration pour les méthodes d’ultrafiltration est presque toujours nécessaire pour les échantillons environnementaux et.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tampon phosphate de sodium de 0,2 M avec un pH de 7,5	Alfa Aesar	J62041AP	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
0,2 &mu ; m 47 mm Supor-200 filtres à disques à membrane	VWR	66234	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
0.45 &mu ; Filtres à disques à membrane Supor-200 de 47 mm	VWR	60043	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4444432	Life Technologies, Carlsbad, CA, États-Unis
ARN blindé Quant IPC-1 Contrôle de traitement	Asuragen	49650	Asuragen, Austin, TX, États-Unis
Marque A, Dispositif centrifuge Jumbosep, 30 kDa	Pall  ;	OD030C65	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Marque B, Dispositif centrifuge Microsep Advance, 30 kDa		Pall MCP010C46	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Tubes à centrifuger (50 ml)  ;	Nalgene	3119-0050PK	Thermo Fisher Scientific
DNAse I	Invitrogen	18047019	Thermo Fisher Scientific
Dyna Mag-2	Invitrogen	12027	Thermo Fisher Scientific
GWV Capsules d’échantillonnage d’eau souterraine haute capacité - 0,45 & micro ; m	Pall	12179	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Acide chlorhydrique, solution étalon 1N	Thermo Fisher Scientific	AC124210025	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit	Applied biosystems	A42358	Thermo Fisher Scientific
Eau sans nucléase	Promega	P1197	Promega Corporation, Fitchburg, WI, États-Unis
Pompe péristaltique	Masterflex, instrument Cole-Parmer	7553-20	Thermo Fisher Scientific
pH-mètre  ;	Instrument Denver	RK-59503-25	Cole-Parmer. Ce produit n’est plus produit de la production
Phénol :chloroforme :alcool isoamylique 25:24:1	Invitrogen	15593031	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Primers and sonde	sets IDT		Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kit	Qiagen Qiagen		Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
QuantStudio 5 Real-Time PCR Système	Thermo Fisher Scientific	A34322	Life Technologies, Carlsbad, CA, États-Unis
Kit de dosage haute sensibilité (HS) Qubit 1X dsDNA	Invitrogen	Q33231	Fluorimètre Thermo Fisher Scientific
Qubit 4, avec WiFi	Invitrogen	Q33238
dosage de l’ARN haute sensibilité (HS)	Qubit Invitrogen	Q32855	Thermo Fisher Scientific
RNAse A	Invitrogen	EN0531	Thermo Fisher Scientific
RNeasy PowerMicrobiome Kit	Qiagen	26000-50	Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, États-Unis
Lait écrémé en poudre	Difco (BD Life Sciences)	DF0032173	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, États-Unis
Tampon de phosphate de sodium	Alfa Aesar		Alfa Aesar, Ottawa, ON, Canada
Eau de mer synthétique	VWR  ;	RC8363-1	RICCA société chimique
ADN monocaténaire synthétique gBlock	IDT		Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, États-Unis
Dispositifs de filtration sous vide VacuCap 90 - 0,1 & micro ; m, 90 mm, irradié aux rayons gamma	Pall	4621	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
VacuCap 90 Dispositifs de filtration sous vide - 0,2 & micro ; m, 90 mm, irradié aux rayons gamma	Pall	4622	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
&beta ;-mercaptoéthanol	Gibco	21985023	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, États-Unis

Kit de Thermo Fisher Scientific