Un modèle animal approprié est nécessaire pour comprendre les mécanismes pathologiques sous-jacents à la sténose valvulaire aortique (SVA) et pour évaluer l’efficacité des interventions thérapeutiques. Le présent protocole décrit une nouvelle procédure pour le développement du modèle de lapin AVS via une blessure directe par ballonnet in vivo.
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Article de méthode
Un modèle de sténose valvulaire aortique de lapin induite par une lésion directe par ballonnet
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Dans cet article
Résumé
Résumé
Les modèles animaux apparaissent comme un outil important pour comprendre les mécanismes pathologiques sous-jacents à la sténose valvulaire aortique (SVA) en raison du manque d’accès à des sources fiables de valves aortiques humaines malades. Parmi les différents modèles animaux, les modèles de lapins AVS sont l’un des plus couramment utilisés dans les études sur les grands animaux. Cependant, les modèles traditionnels de lapins AVS nécessitent une longue période de supplémentation alimentaire et de manipulation génétique pour induire une sténose significative de la valve aortique, ce qui limite leur utilisation dans les études expérimentales. Pour remédier à ces limitations, un nouveau modèle de lapin AVS est proposé, dans lequel la sténose est induite par une lésion directe de la valve aortique par ballonnet. Le présent protocole décrit une technique efficace pour induire l’AVS chez les lapins blancs de Nouvelle-Zélande (NZW), avec des procédures étape par étape pour la préparation, l’intervention chirurgicale et les soins postopératoires. Ce modèle simple et reproductible offre une approche prometteuse pour l’étude de l’initiation et de la progression de l’AVS et constitue un outil précieux pour étudier les mécanismes pathologiques sous-jacents de la maladie.
Introduction
Il est de plus en plus reconnu que l’utilisation de modèles animaux appropriés peut contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes pathologiques sous-jacents à la sténose valvulaire aortique (SVA) en raison du manque d’accès à des sources fiables de valves aortiques humaines malades associées à la progression de la sténose aortique (SA). Parmi les différents modèles animaux pour l’étude de l’AVS, les lapins sont l’un des modèles AVS les plus couramment utilisés pour les grands animaux, et le modèle AVS du lapin est induit soit par une supplémentation en cholestérol/vitamine D2, soit par des manipulations génétiques 1,2,3,4.
Bien que les modèles AVS de lapin aient fourni des informations significatives sur le développement et la progression de l’AVS, il reste encore difficile d’induire l’AVS de manière cohérente et reproductible, comme on l’a vu dans nos expériences préliminaires.
En plus des modèles animaux induits par l’alimentation et génétiquement prédisposés, un nouveau modèle d’AVS a été établi par lésion mécanique directe chez la souris 5,6. Le modèle de lésion mécanique induit avec succès une sténose aortique et représente un modèle AVS simple et reproductible chez les souris de type sauvage. À notre connaissance, il n’y a pas eu d’études antérieures examinant les effets d’une lésion mécanique sur la valve aortique dans des modèles de lapin. Ainsi, cette étude fournit une nouvelle procédure pour induire l’AVS chez les lapins blancs mâles de Nouvelle-Zélande par une lésion directe de la valve aortique par ballonnet, qui peut imiter avec précision l’état de sténose aortique valvulaire. Ce protocole comprend des descriptions étape par étape de la préparation, de l’intervention chirurgicale et des soins postopératoires, qui sont utiles pour induire des modèles de lapin AVS reproductibles.
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Protocole
Toutes les procédures de recherche sur les animaux ont été approuvées et exécutées conformément à la loi sur le bien-être des animaux de laboratoire, au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et aux directives et politiques pour l’expérimentation animale fournies par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC) du Collège de médecine de l’Université catholique de Corée (numéro d’approbation : CUMC-2021-0176-05). La présente étude a utilisé des lapins blancs de Nouvelle-Zélande (NZW) mâles âgés de 3 mois pesant 3,5 à 4,0 kg, qui ont été maintenus dans des conditions standard dans des cages individuelles. Les lapins ont été nourris soit avec une alimentation normale, soit avec une alimentation enrichie en cholestérol à 0,5 %, complétée par 50 000 U de vitamine D2 (voir le tableau des matériaux). La conception expérimentale et les méthodes d’analyse pour l’induction du modèle de lapin AVS sont illustrées à la figure 1.
1. Préparation de l’opération
- S’assurer que tous les instruments médicaux et chirurgicaux (voir tableau des matériaux) sont stérilisés au début de l’opération.
- Préparez l’ensemble de cathéters à ballonnet de dilatation en suivant les étapes ci-dessous.
- Connectez le dispositif de dégonflage rempli d’un mélange de solution saline et de produit de contraste disponible dans le commerce (1 :1) à la partie Luer Lock du cathéter à ballonnet (voir le tableau des matériaux).
- Remplissez le ballonnet avec une solution de gonflage et retirez l’air du cathéter à ballonnet.
NOTA : Pour la présente étude, la solution d’inflation était composée à 30 % d’iodixanol et à 0,9 % de solution saline (voir le tableau des matériaux). - Vérifiez le bon gonflage du ballonnet en purgeant la lumière du ballon avec la solution de gonflage.
2. Intervention chirurgicale pour la lésion valvulaire aortique
- Administrer une injection intramusculaire de tiletamine et de zolazépam (15 mg/kg) et de xylazine (5 mg/kg) (voir le tableau des matériaux) pour anesthésier l’animal.
REMARQUE : Avant d’administrer l’anesthésie, les lapins ont été prétraités avec une injection sous-cutanée de glycopyrrolate (0,05 mg / kg) comme agent anticholinergique pré-anesthésique. Le niveau d’anesthésie adéquat a été déterminé par une combinaison de critères, y compris une absence de réponse à un pincement d’orteil et une fréquence respiratoire stable. - Insérez un cathéter intraveineux (IV) de 24 G dans la veine auriculaire marginale et connectez un dispositif de perfusion avec une solution saline héparinée (100 U/kg d’héparine).
- Connectez le lapin à un moniteur vétérinaire multiparamètre (voir le tableau des matériaux) pour surveiller en permanence les signes vitaux, tels que le signal de saturation en oxygène (SpO2), la température et la pression artérielle.
REMARQUE : Pour la surveillance de la SpO 2, fixez le capteur SpO2 à la langue du lapin. Pour la surveillance de la température, insérez la sonde dans le rectum du lapin. Pour la surveillance de la pression artérielle, placez le brassard sur le membre antérieur. - Placez le lapin en décubitus dorsal sur une table d’opération équipée d’une fluoroscopie à arceau (voir le tableau des matériaux) et retirez les poils de la région ventrale du cou à l’aide d’une tondeuse à poils d’animaux (figure 2A).
- Stérilisez la zone d’incision avec de l’iode et couvrez le lapin avec des serviettes chirurgicales.
- Positionnez le cœur du lapin au centre de l’image de l’arceau.
REMARQUE : Tous les chercheurs doivent porter un équipement de protection muni d’un dosimètre thermoluminescent (TLD) afin de réduire l’exposition aux rayonnements pendant qu’ils effectuent la chirurgie guidée par arceau.- Allumez l’arceau et sélectionnez le mode fluoroscopique pour l’imagerie cardiaque.
- Ajustez la position du lapin pour vous assurer que le cœur est au centre du champ d’imagerie.
- Faites une incision longitudinale d’environ 3 cm dans la peau du cou et utilisez des ciseaux chirurgicaux pour couper le fascia et le tissu adipeux.
- Exposez l’artère carotide commune gauche (LCCA) en séparant soigneusement les muscles jusqu’à ce qu’environ 3 à 3,5 cm de l’ACLC soient exposés (Figure 2B).
- Mettez en relation le LCCA avec une suture en soie 3-0 (voir le tableau des matériaux) en haut et à l’extrémité du LCCA exposé pour arrêter le flux sanguin.
- Insérez un cathéter IV de 22 G dans le LCCA et introduisez un fil-guide (0,016 po, voir le tableau des matériaux) dans le ventricule gauche (VG) à travers le cathéter IV, en veillant à ce que l’extrémité du cathéter soit correctement positionnée dans le champ d’imagerie de l’arceau.
REMARQUE : Lors de l’insertion du cathéter IV, desserrez soigneusement la suture de ligature en descendant vers la valve aortique pour permettre l’avancement du cathéter. - Retirez le cathéter IV, en laissant le fil-guide, et placez une gaine 4-F (voir le tableau des matériaux) sur le fil-guide dans le LCCA pour introduire le cathéter à ballonnet (Figure 2C).
REMARQUE : Après avoir remplacé le cathéter IV par la gaine, tout air emprisonné doit être retiré du dispositif de gaine. - Insérez avec précaution le cathéter à ballonnet de 8 mm sur le fil-guide dans la valve aortique sous guidage fluoroscopique de l’arceau (Figure 2D).
- Placez l’extrémité du cathéter à ballonnet à environ 1-2 cm distale de la valve aortique et gonflez le ballonnet en purgeant la solution de gonflage avec un gonfleur à pression à 6 atm.
- Faites avancer le ballon dans l’apex BT et tirez-le vers l’arrière dans la sortie BT. Répétez cette procédure cinq fois, puis dégonflez le ballon (Figure 2E, F).
- Répétez les étapes 2.8 à 2.9 trois fois pour vous assurer que les dommages valvulaires sont adéquats.
- Retirez le cathéter à ballonnet et le fil-guide. Retirez lentement la gaine de l’ACVL et attachez immédiatement l’ACV à la suture en descendant jusqu’à la valve aortique.
- Nettoyez la zone de l’incision avec une solution saline pour éliminer les caillots sanguins et inspectez le site perforé pour détecter les saignements artériels.
- Fermez le muscle et la peau avec une suture non résorbable 3-0 et stérilisez tous les côtés de la plaie avec de l’iode.
3. Soins post-opératoires
- Retirez les patchs et les clips de surveillance et gardez le lapin dans un incubateur de soins intensifs.
REMARQUE : Après l’opération, les lapins ont été étroitement observés pendant 1 jour dans un incubateur de soins intensifs, puis déplacés dans une cage à domicile. - Gérer la douleur postopératoire avec 5 mg/kg de tramadol et 3 mg/kg de kétoprofène et administrer des antibiotiques (4 mg/kg de gentamicine) deux fois par jour pendant 3 jours par injection sous-cutanée (voir le tableau des matériaux).
REMARQUE : La prise en charge de la douleur postopératoire doit être conforme aux directives vétérinaires et de l’IACUC (p. ex., opioïdes, AINS, anesthésique local ou combinaison). - Nourrissez un régime enrichi en cholestérol à 0,5 % avec 50 000 U de vitamine D2 (HC + VitD2) pendant 8 semaines.
4. Échocardiographie
- Après 8 semaines de blessure par ballonnet, anesthésiez le lapin en utilisant la même procédure que celle décrite à l’étape 2.1.
- Visualisez les valves aortiques à l’aide de vues transthoraciques bidimensionnelles et enregistrez des images en mode M dans des vues à court et à long axe.
- Placez le lapin en décubitus dorsal sur une table d’écho.
- Rasez la poitrine à l’aide d’une tondeuse et d’une crème dépilatoire.
- Appliquez un gel transducteur à ultrasons (voir le tableau des matériaux) sur la poitrine.
- Ajustez le transducteur pour obtenir la vue parasternale à grand axe et la vue parasternale à court axe de la valve aortique.
- Utilisez l’imagerie en mode M pour enregistrer des images de la valve aortique dans des vues grand axe et petit axe, et enregistrez les images pour une analyse ultérieure.
5. Analyse histologique
- Après l’échocardiographie, euthanasier le lapin en lui administrant une injection intraveineuse de chlorure de potassium (KCl, 3 g/20 mL, 1 mL).
- Ouvrez la cavité thoracique, prélevez le cœur avec l’aorte ascendante7 et placez-le sur de la glace dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Immergez immédiatement le cœur dans une solution de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % et incorporez-le dans un bloc de paraffine (voir le tableau des matériaux).
- Coupez le bloc cardiaque enrobé de paraffine en sections de 4 μm d’épaisseur à l’aide d’un microtome, et colorez les sections avec du trichrome de Masson (MT), du rouge d’alizarine et de von Kossa (voir le tableau des matériaux) pour évaluer le dépôt de collagène et la calcification valvulaire, respectivement 8,9.
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Résultats
Modèle AVS de lapin induit par une lésion valvulaire aortique
Pour induire le modèle AVS de lapin, des lapins NZW mâles pesant 3,5 à 4,0 kg ont été utilisés pour cette étude. Selon les procédures chirurgicales décrites à l’étape 2 (Figure 2), le modèle AVS a été établi par lésion valvulaire aortique, ce qui a entraîné une dégénérescence et une calcification de la valve aortique mécanique. Le groupe témoin comprenait des lapins nourris avec un régime enrichi en cholestérol...
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Discussion
Les modèles de SVA chez l’animal sont couramment utilisés pour étudier les aspects pathologiques du SVA, y compris l’initiation et la progression du SVA. Ce protocole introduit un nouveau modèle AVS de lapin induit par une lésion directe de la valve aortique par ballonnet. Dans cette étude, le modèle de lésion valvulaire aortique a montré un épaississement et une calcification significatifs des feuillets. Par rapport au modèle AVS léger induit par une supplémentation alimentaire, la valve aortique dans le modèle de lésio...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer avec ce travail.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par une subvention de la National Research Foundation of Korea (NRF) financée par le gouvernement coréen (MSIT) (n° 2020R1A4A3079570), le ministère de l’Éducation (n° 2021R1I1A1A01051425) et le programme de développement technologique stratégique industriel (n° 20014873) financé par le ministère du Commerce, de l’Industrie et de l’Énergie de la République de Corée.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 3-0 Suture en soie | AILEE | SK312 | |
| 4 % paraformaldéhyde (PFA) | Intron | IBS-BP031-2 | |
| Rouge d’alizarine Solution | Millpore | TMS-008-C | |
| ASAHI SION BLUE ; | ASAHI | Fil de guidage | |
| Couverture de table arrière | Yuhan kimberly | 80101-30 | |
| Dispositif de dégonflage de ballon | Demax Medical | DID30s | |
| Bionet Moniteur vétérinaire | BIONET | BM3 VET | |
| C-Arm | SIEMENS Healthcare GmbH | Cios alpha | |
| Certified Rabbit Diet | Purina | 5322 | 4,7 % d’huile de noix de coco hydrogénée, 0,5 % de cholestérol et 1 % Molasse |
| Curadle Incubateur Intelligent | Autoelex | CS-CV206 | Unité de Soins Intensifs (USI) |
| Ergocalciférol | Sigma-aldrich ; | E5750 | Vitamine D2 |
| Fechtner conjonctive pince titane | WORLD PRECISSION Instrument | WP1820 | |
| Pince | HEBU | HB203 | |
| Gentamicine | Shin Poong | ||
| Glycopyrrolate ; | SamChunDang | ||
| Greenflex NS | DAI HAN PHARM | Solution saline normale de 500 mL | |
| d’hématoxyline | Sigma-aldrich ; | HT1079-1 SET | |
| Héparine | JW pharmaceutique | 25 000 U | |
| Set de perfusion à usage unique | SWOON MEDICAL | ||
| Iode | Vert pharmaceutique | ||
| Iodixanol | GE Healthcare | Visipaque | Solution de gonflage (agent de contraste) |
| Cathéter IV 22 G | BD ; | ||
| Cathéter IV 24 G | BD | 382412 | |
| Kétoprofène | SamChunDang | ||
| Seringue Luer-Lok 10 mL | Becton Dickinson Medical | ||
| Seringue Luer-Lok 3 mL | Becton Dickinson Microscope médical | ||
| OLYMPUS | SZ61 | ||
| Microtome | ThermoFisher Scientific | HM 325 | |
| MT kit de coloration | Sigma-aldrich | HT15-1kt | |
| Porte-aiguille | Solco | 009-1304 | |
| Porte-aiguille avec serrure et suture | JEUNGDO BIO & PLANTE | H-1222-18 | |
| Paraffine | LK LABKOREA | H06-660-107 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Chlorure de potassium 40 | Daihan Pharm | KCl | |
| Prelude Gaine hydrophile idéale | MERIT MEDICAL | PID4F11018SS | Gaine 4F |
| PTA Cathéter de dilatation par ballonnet | Boston Scientific | H749-3903280208-0 | Cathéter à ballonnet 8,0 mm |
| Rompun | Elanco | Xylaxine | |
| stérile Gaze | DAE HAN Medical | 10 cm x 20 cm ; | |
| Gants chirurgicaux | Ansell | Ansell | |
| Blouse chirurgicale | Yuhan kimberly | 90002-02 | |
| Ciseaux chirurgicaux | Nopa, Allemagne | AC020/16 | |
| Ruban chirurgical | 3M micopore | 1530-1 | |
| Seringue 1 mL | Shin Chang Seringue médicale | ||
| 10 mL | Shin Chang Medical | ||
| Cassette de tissus | Scilav korea | Cas3003 | |
| Transducteur gel ; | SUNGHEUNG | SH102 | |
| Tridol | Yuhan Corp. | Tramadol HCl | |
| Système d’échographie | Philps | Affiniti 50 | |
| Von Kossa stain kit | Abcam | ab105689 | |
| Zoletil 50 | Virbac korea | Tiletamine & zolazepam |
Références
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Réimpressions et autorisations
