Génération de souris knockout spécifiques à la graisse brune à l’aide d’un système combiné d’ARN monoguide Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 et virus adéno-associé

Résumé

Dans ce protocole, nous décrivons les procédures techniques pour générer des souris knockout spécifiques au tissu adipeux brun (MTD) en utilisant un système combiné d’ARN monoguide (ARNg) Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 et virus adéno-associé (AAV). Les étapes décrites comprennent la conception des ARNg, la préparation des particules AAV-sgRNA et la microinjection d’AAV dans les lobes BAT.

Résumé

Le tissu adipeux brun (MTD) est un dépôt adipeux spécialisé dans la dissipation d’énergie qui peut également servir d’organe endocrinien via la sécrétion de molécules bioactives. La création de souris knockout spécifiques aux MTD est l’une des approches les plus populaires pour comprendre la contribution d’un gène d’intérêt à la régulation énergétique médiée par les MTD. La stratégie conventionnelle de ciblage génique utilisant le système Cre-LoxP a été la principale approche pour générer des souris knockout spécifiques aux tissus. Cependant, cette approche est longue et fastidieuse. Ici, nous décrivons un protocole pour l’élimination rapide et efficace d’un gène d’intérêt dans la MTD à l’aide d’un système combiné de Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 et d’ARN monoguide (ARNg) du virus adéno-associé (AAV). La MTD interscapulaire est située dans la couche profonde entre les muscles. Ainsi, la MTD doit être exposée afin d’injecter l’AAV précisément et directement dans la MTD dans le champ visuel. Une manipulation chirurgicale appropriée est cruciale pour prévenir les dommages aux nerfs sympathiques et aux vaisseaux, tels que la veine de Sultzer qui se connecte à la MTD. Pour minimiser les lésions tissulaires, il est essentiel de comprendre l’emplacement anatomique tridimensionnel de la MTD et les compétences chirurgicales requises dans les étapes techniques. Ce protocole met en évidence les procédures techniques clés, y compris la conception d’ARNg ciblant le gène d’intérêt, la préparation de particules AAV-sgRNA et la chirurgie pour la microinjection directe d’AAV dans les deux lobes BAT pour générer des souris knockout spécifiques aux MTD, qui peuvent être largement appliquées pour étudier les fonctions biologiques des gènes dans les MTD.

Introduction

L’obésité augmente à un rythme significatif dans le monde entier, entraînant un large éventail de maladies métaboliques ^1,2,3. Le tissu adipeux est la clé de ces pathologies. Les deux types de tissu adipeux fonctionnellement distincts qui existent sont le tissu adipeux blanc (WAT), qui stocke l’excès de calories, et le tissu adipeux brun (MTD) et sa graisse beige / brite associée, qui dissipe l’énergie pour la thermogenèse. Bien que la MTD ait été reconnue pour sa fonction de dissipation d’énergie, elle a également des fonctions endocriniennes via la production de mo....

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux et les procédures de soins ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du Joslin Diabetes Center.

1. Criblage d’ARNg efficaces dans des cellules en culture

REMARQUE: Pour rendre le test rentable, avant d’emballer les sgRNA en particules AAV, nous recommandons de tester différents sgRNA dans des cellules en culture via un système à base de lentivirus pour l’expression Cas9 / sgRNA (Figure 1) et de sélectionner les sgRNA qui donnent la plus grande efficacité knockdown pour les expéri....

Résultats

Tout au long des procédures ci-dessus, l’administration précise de l’ARNsg-AAV au BAT est cruciale pour le succès du protocole. Pour maximiser l’effet de l’ARNg AAV et minimiser les lésions tissulaires pendant la chirurgie, il est essentiel de comprendre l’emplacement anatomique tridimensionnel (3D) de la MTD. Comme le montre la figure 3E, il est difficile d’identifier l’emplacement précis de la MTD sans exposer le tissu. Cependant, une exposition excessive aux MTD peut endommager les tissus.......

Discussion

Les méthodes publiées existantes pour l’administration de gènes médiés par AAV à la MTD interscapulaire ne contiennent pas d’images et de vidéos détaillées décrivant les techniques chirurgicales et l’approche pour l’injection directe d’AAV dans la MTD. Dans la plupart des méthodes publiées^33,34, l’AAV est injecté dans les tissus adipeux entourant la MTD interscapulaire au lieu de la MTD elle-même. Par conséquent, il y a plusieurs étapes clés dans ce protocole qui.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Produits chimiques, peptides et protéines
Milieu sans sérum OPTI-MEM	Invitrogen	31985
Réactif d’infection / transfection de polybrène	Sigma	TR-1003-G
Réactif de transfection TransIT-LT1	Mirus	MIR 2300
ADN
lentiCRISPR v2 vecteur  ;	Addgene	52961
pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP	Addgene	89060
pMD2.G plasmide d’enveloppe	Addgene	12259
psPAX2 plasmide d’emballage	Addgene	12260
Modèles expérimentaux : Lignées cellulaires
Cellules HEK-293	Cellules ATCC	CRL-1573
WT-1	Développé dans le laboratoire de Tseng	PMID : 14966273
Modèles expérimentaux : organismes/souches
Cas9 souris knockin	Laboratories	24857
souris Ucp1-CRE	Jackson Laboratories	24670
Autres
Banamine	Patterson	07-859-1323
Hamilton seringue	Hamilton	Modèle 710 RN Seringue
Solution de peroxyde d’hydrogène	Fisher Scientific	H325-500
Aiguille	Hamilton	32 gauge, petit moyeu RN aiguille, pointe d’aiguille style 2
Suture 5-0 Unify PCL25 P-3 Non teint 18 pouces Monofilament 12/Bx	Henry Schein	1273504
Suture 5-0 Unify Silk P-3 Noir 18 pouces 12/Bx	Henry Schein