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Article de méthode

Génération de souris knockout spécifiques à la graisse brune à l’aide d’un système combiné d’ARN monoguide Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 et virus adéno-associé

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DOI :

10.3791/65083

⸱

24 mars 2023

 ,  , 
1Section on Integrative Physiology and Metabolism, Research Division, Joslin Diabetes Center, Harvard Medical School

Dans cet article

Résumé

Dans ce protocole, nous décrivons les procédures techniques pour générer des souris knockout spécifiques au tissu adipeux brun (MTD) en utilisant un système combiné d’ARN monoguide (ARNg) Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 et virus adéno-associé (AAV). Les étapes décrites comprennent la conception des ARNg, la préparation des particules AAV-sgRNA et la microinjection d’AAV dans les lobes BAT.

Résumé

Le tissu adipeux brun (MTD) est un dépôt adipeux spécialisé dans la dissipation d’énergie qui peut également servir d’organe endocrinien via la sécrétion de molécules bioactives. La création de souris knockout spécifiques aux MTD est l’une des approches les plus populaires pour comprendre la contribution d’un gène d’intérêt à la régulation énergétique médiée par les MTD. La stratégie conventionnelle de ciblage génique utilisant le système Cre-LoxP a été la principale approche pour générer des souris knockout spécifiques aux tissus. Cependant, cette approche est longue et fastidieuse. Ici, nous décrivons un protocole pour l’élimination rapide et efficace d’un gène d’intérêt dans la MTD à l’aide d’un système combiné de Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 et d’ARN monoguide (ARNg) du virus adéno-associé (AAV). La MTD interscapulaire est située dans la couche profonde entre les muscles. Ainsi, la MTD doit être exposée afin d’injecter l’AAV précisément et directement dans la MTD dans le champ visuel. Une manipulation chirurgicale appropriée est cruciale pour prévenir les dommages aux nerfs sympathiques et aux vaisseaux, tels que la veine de Sultzer qui se connecte à la MTD. Pour minimiser les lésions tissulaires, il est essentiel de comprendre l’emplacement anatomique tridimensionnel de la MTD et les compétences chirurgicales requises dans les étapes techniques. Ce protocole met en évidence les procédures techniques clés, y compris la conception d’ARNg ciblant le gène d’intérêt, la préparation de particules AAV-sgRNA et la chirurgie pour la microinjection directe d’AAV dans les deux lobes BAT pour générer des souris knockout spécifiques aux MTD, qui peuvent être largement appliquées pour étudier les fonctions biologiques des gènes dans les MTD.

Introduction

L’obésité augmente à un rythme significatif dans le monde entier, entraînant un large éventail de maladies métaboliques 1,2,3. Le tissu adipeux est la clé de ces pathologies. Les deux types de tissu adipeux fonctionnellement distincts qui existent sont le tissu adipeux blanc (WAT), qui stocke l’excès de calories, et le tissu adipeux brun (MTD) et sa graisse beige / brite associée, qui dissipe l’énergie pour la thermogenèse. Bien que la MTD ait été reconnue pour sa fonction de dissipation d’énergie, elle a également des fonctions endocriniennes via la production de molécules bioactives qui régulent le métabolisme dans les organes distaux 4,5. De nombreuses études chez les rongeurs ont démontré que l’augmentation de la quantité ou de l’activité de graisse brune ou beige entraîne une augmentation de la dépense énergétique et une amélioration de la sensibilité à l’insuline. Chez l’homme, les personnes atteintes de MTD détectables ont une prévalence significativement plus faible de maladies cardiométaboliques6. Ainsi, la MTD présente un excellent potentiel thérapeutique pour les séquelles métaboliques liées à l’obésité 7,8,9.

Pour étudier la physiologie et la physiopathologie du développement et de la fonction des MTD et élucider les mécanismes moléculaires impliqués dans ces processus, le modèle murin transgénique spécifique aux MTD est une méthode de choix10. Le système de recombinaison Cre-LoxP est le moyen le plus couramment utilisé pour produire des souris knockout conditionnelles en modifiant le génome de la souris. Ce système a permis la modification (surexpression ou knockout) de gènes d’intérêt d’une manière spécifique aux tissus/cellules11. Il peut également être utilisé pour marquer un type de cellule spécifique en exprimant un gène rapporteur fluorescent sélectif.

Récemment, l’approche du système Cre-LoxP a été développée en combinant la technologie CRISPR-Cas9 et le système d’ARN monoguide (ARNg) du virus adéno-associé (AAV)12. Le système CRISPR-Cas9 est un outil d’édition de gènes spécifique et efficace pour modifier, réguler ou cibler des régions précises du génome13. L’édition du génome basée sur CRISPR-Cas9 permet une manipulation génétique rapide des loci génomiques car elle ne nécessite pas de recombinaison homologue avec un vecteur de ciblage gène. Les techniques combinées Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 et AAV-sgRNA permettent aux chercheurs de comprendre plus précisément les fonctions des gènes en permettant d’étudier le rôle des gènes d’intérêt à des moments souhaités dans les tissus / cellules. De plus, ces techniques combinées réduisent le temps et les efforts nécessaires pour générer des souris transgéniques et permettent le contrôle temporel de l’activité de CRISPR-Cas9 pour l’édition inductible du génome chez la souris si une lignée Cre inductible est utilisée14.

Les vecteurs AAV sont des systèmes d’administration de gènes in vivo sûrs et efficaces. Cependant, les AAV ciblant le tissu adipeux ont pris du retard par rapport aux applications dans d’autres tissus, tels que le cerveau, le cœur, le foie et les muscles15. En raison de l’efficacité de transduction et du tropisme relativement faibles avec les vecteurs de sérotypes naturels, l’administration de gènes guidée par AAV au tissu adipeux est toujours difficile15. Au cours des 5 dernières années, nous et d’autres avons réussi à établir des moyens efficaces et peu invasifs de délivrer des gènes guidés par AAV dans le tissu adipeux et avons créé des modèles murins qui nous permettent de mieux comprendre les gènes impliqués dans la régulation de la fonction BAT16,17,18,19. Par exemple, en utilisant AAV8 pour délivrer de l’ARNg ciblant Alox12, qui code pour la 12-lipoxygénase (12-LOX), dans la MTD des souris Ucp1-Cre/Cas9, nous avons découvert que la MTD activée produit des métabolites 12-LOX, à savoir l’acide 12-hydroxy-eicosapentaénoïque (12-HEPE) et l’acide 13R, 14S-dihydroxy docosahexaénoïque (marésine 2), pour réguler le métabolisme du glucose et résoudre l’inflammation associée à l’obésité, respectivement16, 17. Ici, nous fournissons un protocole étape par étape sur les procédures techniques, en particulier la chirurgie pour la micro-injection directe d’AAV-sgRNA dans les lobes BAT, pour générer des souris knockout spécifiques à la MTD en utilisant le système combiné Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 et AAV-sgRNA.

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Protocole

Toutes les expériences sur les animaux et les procédures de soins ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du Joslin Diabetes Center.

1. Criblage d’ARNg efficaces dans des cellules en culture

REMARQUE: Pour rendre le test rentable, avant d’emballer les sgRNA en particules AAV, nous recommandons de tester différents sgRNA dans des cellules en culture via un système à base de lentivirus pour l’expression Cas9 / sgRNA (Figure 1) et de sélectionner les sgRNA qui donnent la plus grande efficacité knockdown pour les expériences in vivo .

  1. Conception de l’ARNg CRISPR-Cas9
    1. Concevoir des ARNg à l’aide d’outils en ligne, tels que l’outil de conception Broad sgRNA (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)20,21, l’outil en ligne CRISPOR (http://crispor.tefor.net/)22 et d’autres outils disponibles.
    2. Entrez les noms de gènes ou les séquences cibles d’ADN dans la zone de nom de gène, puis sélectionnez NGG comme motif adjacent protospacer (PAM) pour SpCas9 afin de générer des séquences potentielles d’ARNg.
    3. Sélectionnez les sgRNA avec une efficacité élevée prévue sur la cible et une faible activité hors cible. Par exemple, il est recommandé d’utiliser des sgRNA avec un score de spécificité d’au moins 50 sur la sortie CRISPOR. Parmi les sgRNA spécifiques qui passent le filtre, choisissez ceux avec des scores d’efficacité élevés23.
      REMARQUE: En général, trois ou quatre sgRNA sont choisis pour assurer l’identification des sgRNA efficaces.
  2. Construction du plasmide sgRNA CRISPR-Cas9
    1. Synthétiser des paires d’oligo-ARNg codant pour 20 séquences ciblées nucléotidiques (nt) avec des surplombs (5' et 3') à partir du site de restriction BsmBI (Tableau 1) via une plateforme de synthèse d’ADN.
    2. Paires d’oligo recuits Ligate avec le vecteur lentiCRISPR v2 linéarisé BsmBI.
    3. Transformer le produit de ligature en souche Stbl3 E. coli et confirmer les insertions d’ARNg par séquençage de l’ADN de Sanger à l’aide de l’amorce directe U6.
      REMARQUE: Voir la procédure de clonage détaillée dans le protocole d’Addgene intitulé LentiCRISPRv2 et lentiGuide-Puro: lentiviral CRISPR / Cas9 et ARN guideunique 24.
  3. Production de particules lentivirales
    1. Environ 24 h avant la transfection, plaquer 7 x 105 cellules HEK-293 dans 4 mL de milieu de croissance complet dans une plaque de culture tissulaire de 6 cm.
    2. Ajouter 15 μL de réactif de transfection LT1 à 250 μL de milieu sans sérum et incuber à température ambiante pendant 5 min.
    3. Préparer un cocktail de transfection pour chaque ARNg conformément au tableau 2 dans 250 μL de milieu sans sérum. Mélanger le réactif de transfection préparé à l’étape 1.3.2 avec le cocktail plasmidique, et incuber pendant 20-30 min à température ambiante.
    4. Remplacer le milieu de croissance complet par 3,5 mL de milieu de croissance frais pour les cellules HEK-293, puis ajouter le mélange de réactifs de transfection d’ADN goutte à goutte aux cellules HEK-293 cultivées dans les 3,5 mL de milieu de croissance frais.
    5. Après 12-15 h de transfection, changer le milieu pour éliminer le réactif de transfection et le remplacer par 4 mL de milieu de croissance frais.
    6. Après 24 h d’incubation, prélever le milieu de culture cellulaire qui contient des particules lentivirales et filtrer le milieu à travers un filtre de 0,45 μm pour éliminer toutes les cellules HEK-293. Les virus peuvent être conservés à 4 °C pendant quelques jours. Pour un stockage à long terme, les virus doivent être congelés à −80 °C.
      REMARQUE : Suivez les directives de biosécurité lors de la préparation de particules lentivirales et travaillez dans un environnement (p. ex. BL2+) propice à la manipulation du lentivirus. Voir la procédure détaillée de préparation du lentivirus dans le protocole d’Addgene intitulé pLKO.1 - TRC Cloning Vector (https://www.addgene.org/protocols/plko/#G).
  4. Infection des préadipocytes bruns et détermination de l’élimination médiée par l’ARNg
    1. Plaque 1 x 10 6 préadipocytes bruns immortalisés de souris dans 1 mL de milieu frais contenant 8 μg/mL de polybrène par puits dans une plaque de6 puits.
      NOTE: Dans cette étude, les préadipocytes bruns immortalisés ont été générés à l’aide de l’antigène TSV40 25. Les préadipocytes bruns sont cultivés dans du DMEM à haute teneur en glucose avec 10% FBS.
    2. Ajouter 1 mL de solution de particules lentivirales de l’étape 1.3 pour infecter les cellules. Maintenir un puits de cellules non infectées en parallèle pour servir de contrôle de la sélection des antibiotiques.
    3. Passer à un milieu frais 24 h après l’infection. Ajouter les antibiotiques correspondants (p. ex. puromycine avec une concentration finale de 1 μg/mL) au milieu pour tuer les cellules non infectées et sélectionner les cellules infectées. Passez à un milieu frais contenant l’antibiotique sélectionné tous les deux jours jusqu’à ce que toutes les cellules témoins non infectées soient mortes.
    4. Recueillir des protéines à partir des cellules infectées par le virus et déterminer l’efficacité knockdown des sgRNAs par analyse par transfert Western. Suivez la procédure détaillée de transfert Western à Eslami et Lujan26. En raison du taux de renouvellement variable entre les protéines, testez plusieurs points temporels (par exemple, du jour 6 au jour 12 après l’infection virale) pour observer la perte du signal protéique.
      REMARQUE: Si un anticorps qui reconnaît la protéine codée par le gène d’intérêt n’est pas disponible, le séquençage de Sanger peut également être utilisé pour déterminer l’efficacité d’édition du génome de chaque sgRNA. En bref, amplifiez l’ADN génomique en utilisant des amorces flanquant la région ciblée par l’ARNg pour générer des amplicons PCR de ~700 pb de longueur. Le site de rupture projeté devrait de préférence être de ~200 pb en aval du site de démarrage du séquençage. Ensuite, soumettez le produit PCR au séquençage Sanger. Analyser les résultats du séquençage à l’aide des outils en ligne, tels que Tracking of Indels by DEcomposition (TIDE), pour déterminer la fréquence des petits indels générés par chaque sgRNA dans un pool de cellules27.

2. Construction du plasmide AAV-sgRNA

REMARQUE : Dans cette étape, les ARNg efficaces identifiés à partir de l’écran ci-dessus sont clonés dans le vecteur pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP28 (Figure 2). Entre-temps, un ARNg non ciblé (p. ex., TCTGATAGCGTAGGAGTGAT29) qui ne reconnaît aucune séquence dans le génome de la souris est également cloné dans le même vecteur pour servir de témoin non édité.

  1. Linéariser le squelette pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP à l’aide de BbsI, qui génère des surplombs identiques avec des oligos sgRNA synthétisés.
  2. Litérer les paires d’oligo recuites avec le vecteur pAAV linéarisé et confirmer les insertions d’ARNg comme décrit à l’étape 1.2.
    REMARQUE: La procédure de clonage pour lentiCRISPRv2-sgRNA est également appliquée pour la construction plasmidique AAV-sgRNA.

3. Emballage AAV

  1. Regrouper les vecteurs AAV générés à la section 2 dans le sérotype AAV 8. Préparez un AAV à titre élevé selon un protocole30 précédent, ou demandez un service d’emballage AAV auprès de cœurs viraux ou de services commerciaux. Diluer le titre du virus à 1 x 1013 copies du génome/mL.
    REMARQUE : Le génome AAV2 modifié exprimant un ARNg est emballé dans le sérotype AAV 8. Ce sérotype a été choisi en raison de sa grande efficacité pour le tissu adipeux18,31. Pour prévenir la réponse immunitaire induite par des contaminants, tels que des débris cellulaires et de petites quantités de composants moyens, un AAV ultra-purifié est nécessaire pour l’injection in vivo. L’ultra-purification peut être réalisée par gradients d’iodixanol et par ultracentrifugation30.

4. Préparation des souris Ucp1 Cre/Cas9

  1. Achetez la souche de souris Ucp1-Cre (voir le tableau des matériaux) qui exprime la recombinase Cre sous le contrôle du promoteur Ucp1. Acheter des souris homozygotes STOP-Cas9knock-in 32 (voir le tableau des matériaux), dans lesquelles l’expression de Cas9 est régulée d’une manière dépendante de la recombinase Cre.
  2. Croisez ces souches pour générer des souris Ucp1-Cre/Cas9, comme décrit précédemment16,17. Gardez toutes les souris dans une pièce à température et humidité contrôlées (23 °C, 30% d’humidité) sur un cycle lumière-obscurité de 12 h (lumières allumées à 6h30; lumières éteintes à 18h30) avec accès gratuit au régime alimentaire et à l’eau.
  3. Traiter les souris Ucp1-Cre/Cas9 résultantes avec des AAV portant soit l’ARNg témoin, soit l’ARNsg ciblant le gène d’intérêt par la méthode décrite ci-dessous. Dans cette étude, des souris mâles Ucp1-Cre/Cas9 âgées de 12 à 15 semaines pesant environ 30 g ont été utilisées.

5. Chirurgie pour injection d’AAV dans la MTD chez la souris

  1. Anesthésier les souris par inhalation continue d’isoflurane à 2,5 % pour l’induction et l’entretien.
  2. Lubrifiez les deux yeux pour éviter le dessèchement. Ensuite, donnez des analgésiques (banamine, 2,5 mg/kg de poids corporel [PC], injection sous-cutanée, voir le tableau des matières) aux souris pour minimiser et prévenir la douleur et la détresse postopératoires.
  3. Raser la fourrure de souris sur la zone interscapulaire à l’aide d’un rasoir et stériliser la zone chirurgicale avec au moins trois cycles alternés d’un gommage à base d’iode ou de chlorhexidine suivi d’éthanol à 70%. Ensuite, appliquez des champs chirurgicaux stériles autour du site d’incision.
  4. Inciser la peau entre les omoplates à l’aide d’un scalpel (Figure 3A-B), puis décoller la peau rasée pour exposer les tissus adipeux du cou à l’aide de ciseaux chirurgicaux (Figure 3C-D). La taille de l’incision dépend de la taille du corps, mais généralement, l’incision doit être d’environ 2 cm pour exposer les tissus adipeux sur la région interscapulaire.
  5. Coupez les tissus adipeux à la frontière entre la région distale des tissus adipeux et les muscles à l’aide d’une seule incision (figure 3E-F). La taille de l’incision doit être d’environ 1 cm pour ouvrir l’entrée pour l’insertion des ciseaux chirurgicaux pour le peeling émoussé des tissus adipeux.
  6. À l’aide de la main dominante, décollez les tissus adipeux brutalement et verticalement avec des ciseaux chirurgicaux pour exposer la MTD tout en pinçant les tissus adipeux, y compris la MTD, avec la main non dominante (Figure 3G). Utilisez la veine de Sultzer comme point de repère pour indiquer l’emplacement précis de la MTD.
    REMARQUE : La MTD de la figure 3H a été complètement exposée aux fins d’une démonstration d’image. Une dissection excessive peut endommager les nerfs de la chauve-souris environnante. Une mauvaise direction des ciseaux peut blesser les muscles environnants et la veine de Sultzer drainant la MTD et pourrait entraîner un saignement excessif.
  7. Pour chaque souris, injecter lentement 40 μL d’AAV dans les deux lobes des MTD (20 μL par lobe de la MTD) à l’aide d’une aiguille tranchante (32 G, voir le tableau des matériaux) reliée à une seringue Hamilton (100 μL, voir le tableau des matériaux; Figure 3I). Vérifier si l’injection est réussie, comme indiqué par l’absence de fuites du site d’injection pendant l’administration d’AAV.
    REMARQUE : La MTD de la figure 3I a été complètement exposée aux fins d’une démonstration d’image. Le volume de solution AAV à administrer dans un lobe BAT est déterminé par la taille de la BAT de la souris réceptrice. Nous avons déterminé que 20 μL de solution AAV sont appropriés pour un lobe BAT pesant environ 0,05 g chez une souris C57BL6/J ordinaire pesant 30 g. Si nécessaire, la solution virale peut avoir besoin d’être concentrée pour atteindre le volume souhaité.
  8. Confirmer l’absence de saignement de la MTD injectée ou des tissus environnants. Presser de la gaze imbibée d’une solution de peroxyde d’hydrogène (voir le tableau des matières) sur un site de saignement pour l’hémostase.
  9. Replacez les tissus adipeux exposés à leur position normale. Coudre le bord des tissus adipeux et des muscles à l’aide d’un fil monofilament résorbable 5-0 (Figure 3J). Suturez la peau ouverte avec des fils tressés en vicryl non teint enduits de 5-0 (Figure 3K-L).
    REMARQUE : La figure 4 décrit les étapes de couture des tissus adipeux pelés et des muscles.
  10. Maintenir les animaux sur un coussin chauffant après la chirurgie jusqu’à leur rétablissement complet. Fournissez aux animaux un accès à de la nourriture, de l’eau et une litière suffisante pour la nidification. Surveillez-les régulièrement pour détecter tout signe de détresse ou de maladie pendant 7 jours de rétablissement avant le début de l’expérience.
  11. Confirmer l’efficacité de la délétion génique ciblée par l’analyse par transfert Western dans la MTD disséquée chez la souris, comme dans Sugimoto et coll.16.

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Résultats

Tout au long des procédures ci-dessus, l’administration précise de l’ARNsg-AAV au BAT est cruciale pour le succès du protocole. Pour maximiser l’effet de l’ARNg AAV et minimiser les lésions tissulaires pendant la chirurgie, il est essentiel de comprendre l’emplacement anatomique tridimensionnel (3D) de la MTD. Comme le montre la figure 3E, il est difficile d’identifier l’emplacement précis de la MTD sans exposer le tissu. Cependant, une exposition excessive aux MTD peut endommager les tissus...

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Discussion

Les méthodes publiées existantes pour l’administration de gènes médiés par AAV à la MTD interscapulaire ne contiennent pas d’images et de vidéos détaillées décrivant les techniques chirurgicales et l’approche pour l’injection directe d’AAV dans la MTD. Dans la plupart des méthodes publiées33,34, l’AAV est injecté dans les tissus adipeux entourant la MTD interscapulaire au lieu de la MTD elle-même. Par conséquent, il y a plusieurs étapes clés dans ce protocole qui...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu en partie par les subventions R01DK122808, R01DK102898 et R01DK132469 des National Institutes of Health (aux États-Unis), ainsi que P30DK036836 (au Centre de recherche sur le diabète du Joslin Diabetes Center). T. T. a été soutenu par la bourse de recherche SUNSTAR (bourse Hiroo Kaneda, Fondation Sunstar, Japon) et la subvention de l’American Heart Association 903968. Y. Z. a été soutenu par le Charles A. King Trust Fellowship. Nous remercions Sean D. Kodani d’avoir bien voulu relire le manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Produits chimiques, peptides et protéines
Milieu sans sérum OPTI-MEMInvitrogen31985
Réactif d’infection / transfection de polybrèneSigmaTR-1003-G
Réactif de transfection TransIT-LT1MirusMIR 2300
ADN
lentiCRISPR v2 vecteur  ;Addgene52961
pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFPAddgene89060
pMD2.G plasmide d’enveloppeAddgene12259
psPAX2 plasmide d’emballageAddgene12260
Modèles expérimentaux : Lignées cellulaires
Cellules HEK-293Cellules ATCCCRL-1573
WT-1Développé dans le laboratoire de TsengPMID : 14966273
Modèles expérimentaux : organismes/souches
Cas9 souris knockinLaboratories24857
souris Ucp1-CREJackson Laboratories24670
Autres
BanaminePatterson07-859-1323
Hamilton seringueHamiltonModèle 710 RN Seringue
Solution de peroxyde d’hydrogèneFisher ScientificH325-500
AiguilleHamilton32 gauge, petit moyeu RN aiguille, pointe d’aiguille style 2
Suture 5-0 Unify PCL25 P-3 Non teint 18 pouces Monofilament 12/BxHenry Schein1273504
Suture 5-0 Unify Silk P-3 Noir 18 pouces 12/BxHenry Schein
recombinantesrecombinant Jackson 1294522

Références

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