Isolement, culture et caractérisation des fibroblastes cutanés primaires à partir de tissus chéloïdes humains

Résumé

Cette étude décrit un protocole optimisé pour établir des fibroblastes primaires à partir de tissus chéloïdes capables de fournir efficacement et régulièrement des fibroblastes purs et viables.

Résumé

Les fibroblastes, le principal type cellulaire dans le tissu chéloïde, jouent un rôle essentiel dans la formation et le développement des chéloïdes. L’isolement et la culture de fibroblastes primaires dérivés de tissus chéloïdes sont à la base d’études plus approfondies de la fonction biologique et des mécanismes moléculaires des chéloïdes, ainsi que de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les traiter. La méthode traditionnelle d’obtention de fibroblastes primaires présente des limites, telles qu’un mauvais état cellulaire, le mélange avec d’autres types de cellules et la susceptibilité à la contamination. Cet article décrit un protocole optimisé et facilement reproductible qui pourrait réduire l’apparition de problèmes possibles lors de l’obtention de fibroblastes. Dans ce protocole, les fibroblastes peuvent être observés 5 jours après l’isolement et atteignent près de 80% de confluence après 10 jours de culture. Ensuite, les fibroblastes sont passés et vérifiés à l’aide d’anticorps PDGFRα et vimentine pour les tests d’immunofluorescence et d’anticorps CD90 pour la cytométrie en flux. En conclusion, les fibroblastes du tissu chéloïde peuvent être facilement acquis grâce à ce protocole, ce qui peut fournir une source abondante et stable de cellules dans le laboratoire pour la recherche chéloïde.

Introduction

Chéloïde, une maladie fibroproliférative, se manifeste par la croissance continue de plaques qui envahissent souvent la peau normale environnante sans autolimitation et provoquent divers degrés de démangeaisons, de douleurs et de fardeaux cosmétiques et psychologiques pour les patients¹. Les fibroblastes, les cellules primaires impliquées dans les chéloïdes, jouent un rôle essentiel dans la formation et le développement de cette maladie par une prolifération excessive, une production redondante de matrice extracellulaire et des collagènes désorganisés ^2,3. Cependant, la pathogenèse sous-jacente reste floue et il manque encore une méthode thérapeutique efficace pour la chéloïde; Par conséquent, il est urgent de poursuivre les recherches ^4,5.

Comme il n’existe pas de modèle animal idéal pour la recherche chéloïde in vivo ^6,7, la construction d’un modèle in vitro par l’acquisition de fibroblastes primaires à partir de tissus chéloïdes peut offrir faisabilité et fiabilité pour la recherche chéloïde ^2,6. Les cellules primaires sont celles qui proviennent directement de tissus vivants, et il est généralement reconnu que ces cellules peuvent ressembler davantage à l’état physiologique et au bagage génétique de plusieurs individus que les lignées cellulaires ^8,9. La culture de cellules primaires fournit un moyen puissant d’étudier la croissance et le métabolisme des cellules, ainsi que d’autres phénotypes cellulaires.

À l’heure actuelle, il existe deux méthodes d’acquisition de fibroblastes primaires: la digestion enzymatique et la culture d’explant. Cependant, plusieurs obstacles ont été identifiés à l’obtention de fibroblastes primaires, tels que le risque de contamination par diverses bactéries ou champignons, le mélange avec d’autres types de cellules qui ne sont pas facilement éliminées, la longue période du cycle de culture, les modifications ultérieures des caractéristiques cellulaires par rapport aux cellules d’origine, etc.⁹. Par conséquent, le développement d’un processus réalisable et efficace pour obtenir des fibroblastes primaires est la base d’études et d’applications ultérieures. Cette étude décrit un protocole optimisé pour extraire les fibroblastes primaires des tissus chéloïdes qui peuvent fournir efficacement et régulièrement des fibroblastes purs et viables.

Protocole

Cette étude a été approuvée par le comité d’examen institutionnel de l’hôpital de dermatologie de la Southern Medical University (2020081). Le consentement éclairé du patient a été obtenu avant que les tissus ne soient prélevés sur les individus.

1. Préparation

REMARQUE : Les procédures suivantes doivent être effectuées dans un environnement stérile sous une enceinte de sécurité biologique.

1. Préparer un milieu de culture complet en ajoutant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de solution de pénicilline-streptomycine-amphotéricine B (PSA) au milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) à haute teneur en glucose.
2. Préparer une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec du PSA en ajoutant 1% de PSA dans 1x PBS. Préparez PBS avec FBS en ajoutant 1% FBS à 1x PBS.
3. Préparez plusieurs ciseaux, pinces et scalpels stérilisés par autoclavage.

2. Obtention de tissus enlevés

1. Obtenir des tissus de patients chéloïdes par chirurgie. Recueillir les tissus chéloïdes frais dans un sac d’emballage stérile ou un tube à centrifuger stérile et les transférer dans une enceinte de sécurité biologique en laboratoire dès que possible.
   REMARQUE: Dans ce protocole, la taille du tissu chéloïde acquis était d’environ ~20 x 20 x 10 mm³, et la taille peut varier en fonction de la chirurgie.

3. Isolement

1. Retirez le tissu chéloïde à l’aide d’une pince à épiler stérile et placez-le dans un tube centrifuge stérile de 50 ml contenant 10 à 25 ml de PBS avec 1% de PSA pendant 10 min. Ensuite, préparez une plaque de 6 puits et ajoutez 4 mL de PBS complété par 1% PSA à chaque puits. Retirez le mouchoir à l’aide d’une pince à épiler stérilisée et lavez-le deux fois avec du PBS supplémenté en PSA à 1%. À l’aide de pinces stériles, transférez le tissu séquentiellement d’un puits à l’autre.
2. Retirez les couches adipeuses et épidermiques à l’aide de ciseaux chirurgicaux ou d’un scalpel chirurgical et laissez la couche dermique intacte. Couper et disséquer la couche de derme en 3-5 mm² morceaux avec des ciseaux, transférer ces morceaux à l’aide de pinces stériles au puits suivant et les laver à nouveau dans du PBS avec une solution de PSA à 1%.

4. La culture

1. Placez les morceaux de tissu dermique dans des boîtes de Petri à l’aide de forceps stérilisés; Assurez-vous que le nombre de pièces est compris entre 10 et 30 et que la distance entre chaque pièce est de >5 mm. Mettez les boîtes de Petri à l’envers dans un incubateur à 5% de CO₂ à 37 °C pendant 30-60 minutes jusqu’à ce que les morceaux de tissus sèchent un peu et collez à la boîte de Pétri. Ensuite, ajoutez du DMEM complété par 10% FBS et 1% PSA, et placez soigneusement les boîtes de Petri dans un incubateur à 5% de CO₂ à 37 ° C.
   NOTE: Les fibroblastes sont une population cellulaire morphologiquement et fonctionnellement hétérogène. Compte tenu de cette complexité, les étapes d’isolement et de culture doivent être effectuées avec soin; Sélectionnez les morceaux de tissu dermique chéloïde uniformément et mélangez-les bien avant de les placer dans la boîte de Pedia.
2. Après 3 jours, remplacer la moitié du surnageant par un milieu de culture complet. Changez le milieu de culture tous les 2-3 jours. Observez les fibroblastes au microscope à un grossissement de 40x tous les jours.
   REMARQUE: Toutes les étapes doivent être effectuées en douceur. Ne déplacez pas la boîte de Petri pendant 2 jours après l’isolement, car les morceaux de tissu prennent du temps à adhérer aux boîtes de Pétri.
3. Lorsque les fibroblastes qui se développent autour des morceaux de tissu atteignent environ 90% de confluence, retirez les morceaux de tissu et le milieu de culture. Lavez les fibroblastes avec 1x PBS stérile et ajoutez 2 ml de solution stérile 1x trypsine-EDTA aux plaques. Incuber les cellules pendant environ ~3-5 min à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5% de CO₂ . Tapotez doucement le plat de culture et observez-le au microscope. Lorsque la majorité des cellules se détachent de la plaque, ajouter 2 mL de milieu complet pour mettre fin au processus de digestion.
4. Transférer la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger stérile de 15 ml et centrifuger le tube à 300 × g pendant 3 minutes à température ambiante. Jeter soigneusement le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans un milieu complet. Ensemencer les fibroblastes dans une boîte de culture cellulaire de 9 cm et incuber à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5% de CO₂ .

5. Entretien et préservation

1. Environ 3-4 jours plus tard, lorsque les fibroblastes ont atteint 80% de confluence, répétez les étapes 4.2-4.4 et passez les fibroblastes dans un rapport de 1:3. Utilisez les fibroblastes passés pour d’autres expériences.
   REMARQUE: La culture de fibroblastes doit être arrêtée après 10 passages, car les cellules peuvent commencer à montrer des caractéristiques modifiées par rapport aux cellules d’origine.
2. Cryoconserver les cellules de passage de P1-P3 dans de l’azote liquide pour une utilisation ultérieure.
   1. Répétez les étapes 4.2 à 4.3. Transférer la suspension cellulaire dans un tube centrifuge stérile de 15 ml et centrifuger le tube pendant 3 min à 300 × g. Jeter soigneusement le surnageant, remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de milieu de congélation cellulaire contenant 90 % de FBS et 10 % de DMSO, et transférer la suspension dans des cryotubes cellulaires.
   2. Déplacez les cellules dans une boîte congelée, puis mettez la boîte congelée dans un congélateur à −80 °C. Après 1 jour, transférer les cellules dans de l’azote liquide pour une conservation à long terme.

6. Identification des fibroblastes par coloration par immunofluorescence

1. Placer des lamelles de couverture rondes dans une assiette de 24 puits et mettre en culture les fibroblastes passés à une concentration de 1 × 10⁴ cellules/puits. Lorsque les fibroblastes atteignent 60% de confluence, retirez le milieu de culture. Ajouter 1 mL de paraformaldéhyde à 4% pour fixer les fibroblastes pendant 20 min à température ambiante, et laver 3x avec du PBS pendant 1 min à chaque fois.
   REMARQUE: Comptez le nombre de cellules à l’aide d’une lame d’hémocytomètre sous un microscope ou un compteur de cellules automatique.
2. Retirer le PBS, incuber avec 0,5% de Triton X-100 pendant 20 min pour la perméabilisation des membranes cellulaires, puis laver 3x avec du PBS pendant 1 min à chaque fois. Ajouter le PBS avec 0,5 % d’albumine sérique bovine et laisser tremper pendant 30 minutes. Ensuite, retirez-le et ajoutez l’anticorps PDGFR-α/vimentine dilué dans un diluant d’anticorps à 1:1 000. Incuber pendant une nuit à 4 °C.
3. Le lendemain, retirez l’anticorps primaire, lavez les cellules 3x avec du PBS pendant 3 min, et ajoutez l’anticorps secondaire Alexa Fluor-555 chèvre anti-lapin IgG dilué avec un diluant d’anticorps à 1:200 pour faire tremper pendant 1 h.
4. Retirez l’anticorps secondaire et lavez les cellules 3x avec du PBS. Retirez les lamelles rondes à l’aide d’une pince, placez-les sur des lames de verre et ajoutez 50 μL de solution de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) à 5 μg/mL pour colorer les noyaux cellulaires. Conservez les échantillons dans une boîte humide et sombre et observez-les au microscope confocale à fluorescence laser.
   REMARQUE: Ajouter un groupe témoin négatif sans anticorps primaire mais avec un anticorps secondaire pour exclure la coloration non spécifique.

7. Identification des fibroblastes par cytométrie en flux

1. Recueillir la pastille cellulaire dans un tube centrifuge stérile de 1,5 mL et la remettre en suspension avec 50 μL de PBS contenant 1 % de FBS. Incuber avec anti-CD90 pendant 30 minutes dans l’obscurité et ajouter un contrôle d’isotype anti-IgG au groupe témoin. Ensuite, ajouter 200 μL de PBS contenant 1% de FBS et centrifuger le tube pendant 10 min à 300 × g à 4 °C.
2. Retirer le surnageant et ajouter 200 μL de PBS contenant 1 % de FBS. Resuspendre et filtrer la suspension à travers une crépine à cellules (70 mesh). Ajouter une solution mère de 5 μg/mL de DAPI à 1:100 au filtrat, puis obtenir les résultats par cytométrie en flux. Définissez la diffusion vers l’avant (FSC) comme abscisse et la diffusion latérale (SSC) comme ordonnée, et encerclez la population cellulaire principale. Sélectionnez la population cellulaire et définissez la phycoérythrine comme abscisse et le nombre comme ordonnée pour l’analyse.

Résultats

La chronologie du protocole est résumée à la figure 1A. Quelques images représentatives du processus d’isolement sont présentées à la figure 2; L’épiderme et les couches adipeuses ont été soigneusement enlevés et la couche dermique a été séparée en petits fragments de 3-4 mm², qui ont été inoculés dans les boîtes de Pétri.

Comme le montre la figure 3A, plusieurs excroissances de fibroblaste...

Discussion

L’obtention de fibroblastes primaires à partir de tissus chéloïdes est une base essentielle pour la poursuite des recherches. Jusqu’à présent, il existait deux méthodes d’acquisition de fibroblastes primaires: la digestion enzymatique et la culture d’explant^11,12,13,14. Cependant, les deux méthodes traditionnelles ont des limites, telles que la susceptibilité à la contamination, le mélange avec...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tube à centrifuger stérile de 1,5 mL	JETBIOFIL	CFT002015
Tube à centrifuger stérile de 15 mL	JETBIOFIL	8076
4 % de polyformaldéhyde	Beyotime Biotechnology	P0099	Fixation cellulaire
Tube de centrifugation stérile de 50 mL	JETBIOFIL	8081	Mettre le tissu chéloïde
Alexa Fluor-555 chèvre anti-lapin IgG  ;	Abcam	Alexa  ; Fluor  ; 555  ;	Deuxième anticorps pour le test de coloration par immunofluorescence
Anti humain CD90	BioLegend	B301002	Identifier la pureté des fibroblastes
Anticorps diluant	Beyotime Biotechnology	P0262
Enceinte de sécurité biologique  ;	Thermo Scientific	1300 série A2	Cellules d’isolement et de culture
Albumine sérique bovine	aladdin	B265993	Blocage pour le test de coloration par immunofluorescence
Incubateur de dioxyde de carbone	ESCO	CCL-170B-8	Utilisation pour la culture de cellules
Cryotubes cellulaires	Corning	43513	Stocker les cellules dans une machine centrifuge à basse température
	Thermo Fisher	ST 16R	Surnageant de mise au rebut  ;
DAPI	Beyotime Biotechnology	C1006	Colorer le noyau cellulaire
DMSO	MP Biomedicals	196055	Utilisation pour la préservation des cellules
Milieu d’aigle modifié de Dulbecco	Gibco	C11995500BT	Milieu de culture solution
Sérum fœtal bovin	BI	04-001-1A
Cytomètre en flux	BD	BD FACSCelesta	Observation l’identité des cellules
congelées en boîte	Thermo Scientific	; 5100-0050
Microscope inversé	Nikon	ECLIPSE Ts2
Microscope confocal laser	Nikon	AIR-HD25	Observation du test de coloration par immunofluorescence
Anticorps PDGFR-&alpha ;	CST	3174T	Premier anticorps pour le test de coloration par immunofluorescence
Pénicilline-streptomycine Solution	Am Solarbio	P1410	Ajouter une solution de milieu de culture pour éviter la contamination
boîte de Pétri	JETBIOFIL	7556	Fibroblastes de culture
Solution saline tamponnée au phosphate	Gibco	C10010500BT	Solution de milieu de culture
Lapin (DAIE) mAB IgG XR (R) Contrôle des isotuges (PE)	Technologie de signalisation cellulaire	5742S	Comme contrôle pour la cytométrie en flux
Lambeau rond	Biosharp	801007	Culture cellulaire
Triton X 100	Solarbio	T8200	Perforations dans la membrane cellulaire
Trypsine-EDTA	Gibco	25200072	Utilisé pour le passage des cellules
Anticorps Vimentin	Abcam	ab8978	Premier anticorps pour le test de coloration par immunofluorescence

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