Isolement et identification de cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux de rats Sprague Dawley

Résumé

Ce protocole décrit une méthodologie pour isoler et identifier les cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (CSM) de rats Sprague Dawley.

Résumé

Les cellules mésenchymateuses adultes ont révolutionné la biologie moléculaire et cellulaire au cours des dernières décennies. Ils peuvent se différencier en différents types de cellules spécialisées, en plus de leur grande capacité d’auto-renouvellement, de migration et de prolifération. Le tissu adipeux est l’une des sources les moins invasives et les plus accessibles de cellules mésenchymateuses. Il a également été rapporté pour avoir des rendements plus élevés par rapport à d’autres sources, ainsi que des propriétés immunomodulatrices supérieures. Récemment, différentes procédures pour obtenir des cellules mésenchymateuses adultes à partir de différentes sources de tissus et d’espèces animales ont été publiées. Après avoir évalué les critères de certains auteurs, nous avons normalisé une méthodologie applicable à différents usages et facilement reproductible. Un pool de fraction vasculaire stromale (SVF) provenant de tissus adipeux périrénaux et épididymaires nous a permis de développer des cultures primaires avec une morphologie et une fonctionnalité optimales. Les cellules ont été observées collées à la surface plastique pendant 24 h et présentaient une morphologie semblable à celle d’un fibroblaste, avec des prolongements et une tendance à former des colonies. Des techniques de cytométrie en flux (FC) et d’immunofluorescence (IF) ont été utilisées pour évaluer l’expression des marqueurs membranaires CD105, CD9, CD63, CD31 et CD34. La capacité des cellules souches dérivées du tissu adipeux (CSA) à se différencier dans la lignée adipogène a également été évaluée à l’aide d’un cocktail de facteurs (4 μM d’insuline, 0,5 mM de 3-méthyl-iso-butyl-xanthine et 1 μM de dexaméthasone). Après 48 h, une perte progressive de la morphologie fibroblastoïde a été observée, et à 12 jours, la présence de gouttelettes lipidiques positives à la coloration rouge d’huile a été confirmée. En résumé, une procédure est proposée pour obtenir des cultures d’ASC optimales et fonctionnelles pour une application en médecine régénérative.

Introduction

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont fortement impacté la médecine régénérative en raison de leur grande capacité d’auto-renouvellement, de prolifération, de migration et de différenciation en différentes lignées cellulaires ^1,2. Actuellement, de nombreuses recherches se concentrent sur leur potentiel pour le traitement et le diagnostic de diverses maladies.

Il existe différentes sources de cellules mésenchymateuses: moelle osseuse, muscle squelettique, liquide amniotique, follicules pileux, placenta et tissu adipeux, entre autres. Ils sont obtenus à partir de différentes....

Protocole

Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées conformément aux lignes directrices mexicaines sur les soins aux animaux, basées sur les recommandations de l’Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, Mexique). Le protocole a été examiné, approuvé et enregistré par le Comité d’éthique pour la recherche en santé de l’Instituto Mexicano del Seguro Social (R-2021-785-092).

1. Ablation du tissu adipeux de rats par résection chirurgicale

1. Préparer deux tubes coniques avec 20 mL de solution antimycotique saline-antibiotique tampon....

Résultats

Le tissu adipeux a été obtenu à partir de rats Sprague Dawley adultes âgés de 3 à 4 mois et pesant 401 ± 41 g (moyenne géométrique ± écart-type). Une valeur moyenne de 3,8 g de tissu adipeux pérididymaire et périrénal correspondait à l’analyse de 15 extractions expérimentales. Après 24 h de culture, les populations cellulaires sont restées collées à la surface plastique et présentaient une morphologie hétérogène. Le premier passage a été réalisé à 8 ± 2 jours, avec un rendement de 1,4 ± 0,6 x 10⁶ cellules dans.......

Discussion

Au cours des quatre dernières décennies, depuis la découverte des CSM, plusieurs groupes de chercheurs ont décrit des procédures pour obtenir des CSM à partir de différents tissus et espèces. L’un des avantages de l’utilisation de rats comme modèle animal est leur facilité d’entretien et leur développement rapide, ainsi que la facilité d’obtenir des CSM à partir de tissu adipeux. Différentes sources tissulaires ont été décrites pour obtenir des ASC, telles que la graisse viscérale, périrénale, épididymaire et sous-cutané.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Amphotéricine B	HyClone	SV30078.01
Balance analytique	Sartorius	AX224
Anticorps anti-CD9 (C-4)	Santa Cruz	Sc-13118
Anticorps anti-CD34 (C-18)	Santa Cruz	Sc-7045
Anticorps anti-C63	Santa Cruz	Sc-5275
Anticorps anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594	Santa Cruz	Sc-18838A594
Anticorps anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680	Santa Cruz	Sc-18916AF680
Anticorps de chèvre anti-rabitt IgG (H+L) Cy3	Novus	NB 120-6939
Anticorps Âne anti-chèvre IgG (H+L) DyLight 550	Invitrogen	SA5-10087
Anticorps anti-souris IgG FITC chèvre conjuguée F (ab´ ;)	Systèmes RD.	N° F103B
Filtre supérieur pour bouteille stérile	CORNING	10718003
Fioles de culture cellulaire et tissulaire	BIOFIL	170718-312B
Compteur de cellules Bright-Line Hémacytomètre avec lames de chambre de comptage cellulaire	SIGMA Aldrich Z359629
Puits de cellules : 6 puits avec couvercle	CORNING	25810
Centrifugeuse Tubes	coniquesHeTTICH	ROTANA460R
Centrifugeuse eppendorf tubes	Fischer Scientific	M0018242_44797
Collagen IV	Worthington	LS004186
Cryovial	SPL Life Science	43112
Tubes de culture	Greiner Bio-One	191180
CytExpert 2.0	Beckman Coulter	Version
Cytomètre CytoFlex LX	Beckman Coulter	FLOW-2463VID03.17
DMEM	GIBCO	31600-034
DMSO	SIGMA Aldrich	67-68-5
DraQ7	Colorant Thermo Sc.	D15106
EDTA	SIGMA Aldrich	60-00-4
Éosine jaunâtre	Hycel	300
Éthanol 96 %	Baker	64-17-5
Tubes Falcon 15 mL	Greiner Bio-One	188271
Tubes Falcon 50 mL	Greiner Bio-One	227261
Sérum fœtal bovin	CORNING	35-010-CV
Gélatine	SIGMA Aldrich	128111163
Gentamicine	GIBCO	15750045
Glycérine-Haute Pureté	Herschi Trading	56-81-5
Hématoxyline	AMRESCO	0701-25G
Heracell 240i CO2 Incubateur	Thermo Sc.
Ketamin Pet (Kétamine clorhidrate)	Aranda	SV057430
L-Glutamine	GIBCO/ Thermo Sc.	25030-081
LSM software Zen 2009 V5.5		Version
Biological Safety Cabinet Class II	NuAire	12082100801
Microscope épifluorescent	Zeiss Axiovert 100M	21.0028.001
Microscope inversé	Olympus CK40	CK40-G100
Acides aminés non essentiels 100X	GIBCO	11140050
Microtubes 2 mL	Sarstedt	72695400
Microtubes 1,5 mL	Sarstedt	72706400
Micropipettes 0.2-2 &mu ; L	Finnpipette	E97743
Micropipettes 2-20 &mu ; L	Finnpipette	F54167
Micropipettes 20-200 &mu ; L	Finnpipette	G32419
Micropipettes 100-1000 &mu ; L	Finnpipette	FJ39895
Réservoir d’azote liquide	Taylor-Wharton	681-021-06
Paraformaldéhyde	SIGMA Aldrich	SLBC3029V
Pénicilline / Streptomycine	GIBCO/ Thermo Sc.
Boîte de Pétri Culture cellulaire	CORNING Inc	480167
Pointes de pipette	Axygen Scientific	301-03-201
Pisabental (pentobarbital sodique)	PISA Agropecuaria	Q-7833-215
Chlorure de potassium	J.T.Baker	7447-40-7
Phosphate de potassium dibasique	J.T Baker	2139900
S1 Pipette Fillers	Thermo Sc	9531
Pipette sérologique 5 mL	PYREX	L010005
Pipette sérologique 10 mL	PYREX	L010010
Bicarbonate de sodium	J.T Baker	144-55-8
Chlorure de sodium	J.T.Baker	15368426
Phosphate de sodium dibasique anhydre	J.T Baker	7558-79-4
Pyruvate de sodium	GIBCO BRL	11840-048
Filtre à seringue stérile	CORNING	431222
Spectrophotomètre	PerkinElmer Lambda 25	L6020060
Agitateur à plaque de titrage	LAB-LINE	1250
Pipettes de transfert	Samco/Thermo Sc	728NL
Trypan Blue coloration	GIBCO	1198566
Trypsine du pancréas porcin	SIGMA Aldrich	102H0234
Tween 20	SIGMA Aldrich	9005-64-5
Réactif de blocage universel 10x	BioGenex	HK085-GP
Xilapet 2 % (chlorhydrate de xylazine)	Pet' s Pharma	Q-7972-025