Un protocole efficace pour l’analyse CUT&amp;RUN de cellules satellites de souris isolées par FACS

Kamar Ghaibour; Joe Rizk; Claudine Ebel; Tao Ye; Muriel Philipps; Valérie Schreiber; Daniel Metzger; Delphine Duteil

doi:10.3791/65215

Article de méthode

Un protocole efficace pour l’analyse CUT&RUN de cellules satellites de souris isolées par FACS

DOI :

10.3791/65215

⸱

7 juillet 2023

Kamar Ghaibour^*¹ , Joe Rizk^*¹ , Claudine Ebel¹ , Tao Ye¹ , Muriel Philipps¹ , Valérie Schreiber¹ , Daniel Metzger¹ , Delphine Duteil¹

¹CNRS, Inserm, IGBMC UMR 7104- UMR-S 1258, Université de Strasbourg

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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Un protocole efficace pour le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) est présenté ici des cellules satellites musculaires des membres de souris, adapté à l’étude de la régulation de la transcription dans les fibres musculaires par clivage sous cibles et libération par nucléase (CUT&RUN).

Résumé

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Les analyses à l’échelle du génome avec des populations de petites cellules constituent une contrainte majeure pour les études, en particulier dans le domaine des cellules souches. Ce travail décrit un protocole efficace pour l’isolement des cellules satellites du muscle du membre, un tissu à haute teneur en protéines structurelles. Les muscles des membres disséqués de souris adultes ont été perturbés mécaniquement par hachage dans un milieu complété par de la dispase et de la collagénase de type I. Lors de la digestion, l’homogénat a été filtré à travers des tamis cellulaires et les cellules ont été mises en suspension dans un tampon FACS. La viabilité a été déterminée à l’aide d’une coloration de viabilité réparable, et les cellules satellites immunocolorées ont été isolées par FACS. Les cellules ont été lysées avec Triton X-100 et les noyaux libérés ont été liés à des billes magnétiques de concanavaline A. Des complexes noyau/billes ont été incubés avec des anticorps contre le facteur de transcription ou les modifications d’histones d’intérêt. Après les lavages, les complexes noyau/billes ont été incubés avec la protéine A-micrococcique nucléase, et le clivage de la chromatine a été initié avec CaCl₂. Après l’extraction de l’ADN, des banques ont été générées et séquencées, et les profils de liaison aux facteurs de transcription à l’échelle du génome et de modifications des histones covalentes ont été obtenus par analyse bioinformatique. Les pics obtenus pour les différentes marques d’histones ont montré que les événements de liaison étaient spécifiques aux cellules satellites. De plus, l’analyse des motifs connus a révélé que le facteur de transcription était lié à la chromatine via son élément de réponse apparenté. Ce protocole est donc adapté pour étudier la régulation des gènes dans les cellules satellites musculaires des membres de souris adultes.

Introduction

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Les muscles striés squelettiques représentent en moyenne 40 % du poids de l’ensemble du corps humain¹. Les fibres musculaires présentent une capacité remarquable de régénération en cas de blessure, qui est décrite par la fusion des myocytes nouvellement formés et la génération de nouvelles myofibres qui remplacent celles endommagées². En 1961, Alexander Mauro a signalé une population de cellules mononucléées qu’il a appelées cellules satellites³. Ces cellules souches expriment le facteur de transcription apparié boîte 7 (PAX7), et sont situées entre la lame basale et le sarcolemme des fibres muscu....

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Protocole

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Les souris ont été gardées dans un bâtiment d’élevage accrédité, conformément aux directives nationales en matière de soins aux animaux (directive 86/609/CEE de la Commission européenne ; Décret n°87-848) relatif à l’utilisation d’animaux de laboratoire pour la recherche. Les manipulations envisagées ont été soumises au comité d’éthique (Com’Eth, Strasbourg, France) et au Ministère de la Recherche (MESR) pour évaluation éthique et autorisation conformément à la directive 2010/63/UE sous le numéro APAFIS #22281.

1. Préparation d’une suspension cellulaire pour l’isolement de cellules satellites par tri cellulaire activé par fluorescence....

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Résultats

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Des cellules satellites provenant de muscles squelettiques de souris ont été isolées en combinant les protocoles de Gunther et al. (ci-après le Protocole 1)¹² et de Liu et ^al.23 (ci-après le Protocole 2). Étant donné que des fibres musculaires non digérées ont été observées après la digestion lors de l’utilisation de la concentration de collagénase et de dispase proposée dans le protocole 1, la quantité d’enzymes a été augmentée pour améliorer la dissociation des fibres mus.......

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Discussion

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La présente étude fait état d’une méthode standardisée, fiable et facile à réaliser pour l’isolement et la culture de cellules satellites de souris, ainsi que l’évaluation de la régulation transcriptionnelle par la méthode CUT&RUN.

Ce protocole comporte plusieurs étapes critiques. Le premier est la perturbation musculaire et la digestion des fibres pour assurer un nombre élevé de cellules collectées. Malgré l’augmentation de la concentration enzymatique, plus de cellules vivantes ont été obten.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

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Nous remercions Anastasia Bannwarth pour son excellente assistance technique. Nous remercions l’animalerie de l’IGBMC, la culture cellulaire, l’Institut Clinique de la Souris (ICS, Illkirch, France), l’imagerie, la microscopie électronique, la cytométrie en flux, et la plateforme GenomEast, membre du consortium France Génomique (ANR-10-INBS-0009).

Ces travaux de l’Institut Thématique Interdisciplinaire IMCBio, dans le cadre du programme ITI 2021-2028 de l’Université de Strasbourg, du CNRS et de l’Inserm, ont été soutenus par l’IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002) et par le projet SFRI-STRAT’US (ANR 20-SFRI-0012) et l’EUR IMCBio (ANR-17-EURE-0023....

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Microtube de 1,5 mL	Eppendorf	2080422
Microtube de 2 mL	Star Lab	S1620-2700
Tubes de 5 mL	CORNING-FALCON	352063
Tubes de 50 mL	Falcon	352098
anti-AR	abcam	ab108341
anti-CD11b	eBioscience	25-0112-82
anti-CD31	eBioscience	12-0311-82
anti-CD34	eBioscience	48-0341-82
anti-CD45	eBioscience	12-0451-83
anti-CXCR4	eBioscience	17-9991-82
anti-DMD	abcam	ab15277
anti-H3K27ac	Active Motif	39133
anti-H3K4me2	Active Motif	39141
anti-ITGA7	MBL	k0046-4
anti-PAX7	DSHB	AB_528428
anti-TER119	BD Pharmingen ^TM	553673
Perles	Polysciences	86057-3	BioMag® ; Plus Concanavalin A
Cell Strainer 100 & micro ; m	Corning® ; ;
431752 Cell Strainer 40 & micro ; m	Corning® ; ;	431750
Crépine à cellules 70 & micro ; m	Corning® ; ;		Centrifugeuse 431751
1	Eppendorf	521-0011	Centrifugeuse 5415 R
Centrifugeuse 2	Eppendorf	5805000010	Centrifugeuse 5804 R Système
lames de chambre ;	ThermoFischer	171080	Systè ; moi Nunc&trade ; Lab-Tek&trade ;
Agent de nettoyage de	Sigma ; ;	SLBQ7780V	RNaseZAPTM
Collagénase, type I ;	Thermo Fisher	17100017	10 mg/mL
Dispase ;	STEMCELL technologies	7913	5 U/mL
DynaMag&trade ;-2 Aimant	Invitrogen	12321D
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	565388
Cytomètre	en flux BD FACSAria&trade ; Cytomètre en flux de fusion	23-14816-01
Fluoromount G avec DAPI	Invitrogen	00-4959-52
Genome browser ;	IGV		http://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glycérol ;	Sigma-Aldrich	G9012
Hydrogel	Corning® ; ;	354277	matrice qualifiée Matrigel hESC
Logiciel de traitement d’images	Image J® ;		V 1.8.0
Film de laboratoire	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	PARAFILM® ; M
Liberase LT	Roche	5401020001
gallate de propyle	Sigma-Aldrich	2370
	Illumina Hiseq 4000	SY-401-4001
Bain-marie	vibrant Bioblock Scientific polytest 20	18724

de lames de chambre Séquenceur de

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal ....

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Mots-clés

CUT and RUN isolement par FACS muscle du membre de souris clivage de la chromatine analyse l chelle du g nome liaison des facteurs de transcription modifications des histones cellules souches musculaires analyse du cistrome

Un protocole efficace pour l’analyse CUT&RUN de cellules satellites de souris isolées par FACS

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