Article de méthode

Une méthode précise et quantifiable pour recueillir l’hémolymphe de petits arthropodes

DOI :

10.3791/65250

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28 avril 2023

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1State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 2CAS Center for Excellence in Biotic Interactions, University of Chinese Academy of Sciences, 3University of Chinese Academy of Sciences

Dans cet article

Résumé

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Nous décrivons une méthode pour recueillir efficacement l’hémolymphe quantifiable de petits arthropodes pour une analyse ultérieure.

Résumé

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Les arthropodes sont connus pour transmettre une variété de virus d’importance médicale et agricole par leur hémolymphe, qui est essentielle à la transmission du virus. La collecte d’hémolymphe est la technologie de base pour étudier les interactions virus-vecteur. Ici, nous décrivons une méthode nouvelle et simple pour la collecte quantitative de l’hémolymphe de petits arthropodes en utilisant Laodelphax striatellus (la petite cicadelle brune, SBPH) comme modèle de recherche, car cet arthropode est le principal vecteur du virus de la bande du riz (VRS). Dans ce protocole, le processus commence par pincer doucement une jambe de l’arthropode congelé avec une pince à épiler à pointe fine et presser l’hémolymphe hors de la plaie. Ensuite, une micropipette simple composée d’un capillaire et d’un bulbe de pipette est utilisée pour recueillir l’hémolymphe transsudative de la plaie selon le principe des forces capillaires. Enfin, l’hémolymphe recueillie peut être dissoute dans un tampon spécifique pour une étude plus approfondie. Cette nouvelle méthode de collecte de l’hémolymphe de petits arthropodes est un outil utile et efficace pour la poursuite des recherches sur les arbovirus et les interactions vecteur-virus.

Introduction

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Les virus animaux et végétaux peuvent être transmis par les arthropodes, et ces virus constituent une grave menace pour la santé humaine et causent d’énormes pertes économiques dans l’agriculture 1,2,3. Il est important de noter que l’hémolymphe des arthropodes, qui sert de système circulatoire et d’élément vital du système immunitaire chez les arthropodes, joue un rôle important dans la régulation de la transmission des arboviraux. Les virus acquis par les intestins des arthropodes ne sont transportés vers d’autres tissus qu’après avoir réussi à s’échapper de l’environnement....

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Protocole

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1. Élevage d’insectes

  1. Augmenter les SBPH utilisés dans cette expérience dans les plants de riz (Oryza sativa cv. Nipponbare). Planter 20 plants de riz dans un incubateur (65 mm x 200 mm) et pousser à 25 °C sous une photopériode de 16 h de lumière / 8 h d’obscurité.

2. Dissection des SBPH pour le prélèvement de l’hémolymphe

  1. Mettez les SBPH dans un tube à centrifuger et placez-les dans un bain de glace pendant 10-30 min.
    REMARQUE: Ne placez pas les SBPH dans le bain de glace pendant moins de 10 minutes, sinon les insectes pourraient revivre.
  2. Placer une SBPH cong....

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Résultats

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Modèle de micropipette et collecte d’hémolymphe
Nous avons développé une micropipette simple dont l’action est basée sur les forces capillaires du tube capillaire. La micropipette est composée d’un tube capillaire et d’une ampoule de pipette (Figure 1A). Les tubes capillaires sont disponibles en différentes tailles de volume allant de 1 μL à 20 μL, et les volumes de tubes capillaires sont sélectionnés en fonction des exigences. Les tubes capillaires avec des volumes plus .......

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Discussion

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L’hémolymphe est le milieu du système circulatoire chez les arthropodes, et les arbovirus ne peuvent envahir d’autres tissus d’arthropodes que s’ils sont capables de survivre à l’environnement hostile de l’hémolymphe. La collecte d’un échantillon d’hémolymphe de haute qualité est la première étape de l’étude des interactions vecteur-virus qui se produisent dans l’hémolymphe. Il a été rapporté que l’hémolymphe d’insecte peut être obtenue à partir de plusieurs sites sur le corps de l’insecte, y compris une plaie sur la pat.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par le National Key R&D Program of China (No. 2022YFD1401700) et par la National Science Foundation of China (No. 32090013 et No. 32072385).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
10 % SDS-PAGE Gel protéiqueBio-rad4561035Séparation et détection
des protéines 4 % paraformaldéhydeSolarbioP1110Pour la fixation des cellules ou des tissus  ;
Réactif de colorant BradfordBio-rad5000205Détection de concentration en protéines
CapillaireHirschmann9000101Pour la collecte de l’hémolymphe
Chambre de comptageACMECAYA0810Comptage des hémocytes
Lamede verre Gitoglas10127105APour la rétention des insectes
Lame de verre recouverte de silaneSigmaS4651-72EAPour la conservation d’échantillons de microscope
Réactif anti-décoloration en or avec DAPIInvitrogenP36935Coloration du noyau
Verre de couverture du microscopeGitoglas10212424CPour l’observation microscopique
Poire de pipetteHirschmann9000101Pour la collecte de l’hémolymphe
Logiciel Prism 8.0 LogicielGraphPad/Analyses statistiques
StéréomicroscopeMoticSMZ-168Pour la dissection d’insectes
Pince à épilerTianldP5622Pour la dissection
d’insectes Microscope inversé ZeissZeissObserver Z1Observation des hémocytes
cellulaire

Références

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  1. Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
  2. Ray, S., Casteel, C. L. Effector-mediated plant-virus-vector interactions. Plant Cell. ....

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Mots-clés

Collecte d h molympheInteractions virus vecteurTransmission d arbovirusMicropipette capillairePetit cicadelle bruneSt r omicroscopeQuantification des prot inesAnalyse des h mocytesSDS PAGE

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