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Article de méthode

Dissection de la strie vasculaire de souris adulte pour le séquençage mononucléaire ou l’immunomarquage

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DOI :

10.3791/65254

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21 avril 2023

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1Auditory Development and Restoration Program, National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health

Dans cet article

Résumé

La strie vasculaire est vitale pour la génération du potentiel endocochléaire. Ici, nous présentons la dissection de la strie vasculaire de la souris adulte pour le séquençage mononucléaire ou l’immunomarquage.

Résumé

Le potentiel endocochléaire, qui est généré par la strie vasculaire, est essentiel pour maintenir un environnement propice à une mécanotransduction appropriée des cellules ciliées et, finalement, à l’audition. Les pathologies de la strie vasculaire peuvent entraîner une diminution de l’audition. La dissection de la strie vasculaire adulte permet la capture focalisée d’un seul noyau, puis le séquençage et l’immunomarquage d’un seul noyau. Ces techniques sont utilisées pour étudier la physiopathologie de la strie vasculaire au niveau unicellulaire.

Le séquençage mononucléal peut être utilisé dans le cadre de l’analyse transcriptionnelle de la strie vasculaire. Pendant ce temps, l’immunomarquage continue d’être utile pour identifier des populations spécifiques de cellules. Les deux méthodes nécessitent une dissection appropriée de la strie vasculaire comme condition préalable, ce qui peut s’avérer techniquement difficile.

Introduction

La cochlée se compose de trois chambres remplies de liquide, la scala vestibuli, la scala media et la scala tympan. La scala vestibuli et la scala tympani contiennent chacune de la périlymphe, qui a une forte concentration de sodium (138 mM) et une faible concentration de potassium (6,8 mM)1. La scala media contient de l’endolymphe, qui a une forte concentration de potassium (154 mM) et une faible concentration de sodium (0,91 mM)1,2,3. Cette différence de concentration ionique peut être appelée potentiel endocochléaire (EP) et est principalement générée par le mouvement des ions potassium à travers divers canaux ioniques et jonctions lacunaires dans la strie vasculaire (SV) le long de la paroi latérale de la cochlée 4,5,6,7,8,9,10,11 . Le SV est un tissu hétérogène hautement vascularisé qui tapisse la face médiale de la paroi latérale de la cochlée et contient trois principaux types de cellules : les cellules marginales, intermédiaires et basales12 (Figure 1).

Les cellules marginales sont reliées par des jonctions serrées pour former la surface la plus médiale du SV. La membrane apicale fait face à l’endolymphe de la scala moyenne et contribue au transport des ions potassium dans l’endolymphe en utilisant divers canaux, y compris KCNE1 / KCNQ1, SLC12A2 et Na+-K+-ATPase (NKA)5,10,13,14. Les cellules intermédiaires sont des cellules pigmentées qui résident entre les cellules marginales et basales et facilitent le transport du potassium à travers le SV en utilisant KCNJ10 (Kir 4.1)15,16. Les cellules basales se trouvent à proximité de la paroi latérale de la cochlée et sont étroitement associées aux fibrocytes du ligament spiralé pour favoriser le recyclage du potassium de la périlymphe12. La pathologie du SV a été impliquée dans de nombreux troubles otologiques17,18. Les mutations dans les gènes exprimés dans les principaux types de cellules SV, tels que Kcnq1, Kcne1, Kcnj10 et Cldn11, peuvent causer la surdité et le dysfonctionnement de SV, y compris la perte de EP 19,20,21,22,23. En plus des trois principaux types cellulaires, il existe d’autres types de cellules moins étudiés dans le SV, tels que les cellules fusiformes 22, les cellules racinaires12,24, les macrophages 25, les péricytes 26 et les cellules endothéliales 27, qui ont des rôles incomplètement définis impliquant l’homéostasie ionique et la génération de EP 28.

Par rapport au séquençage de l’ARN en vrac, le séquençage de l’ARN à noyau unique (sNuc-Seq) fournit des informations sur l’hétérogénéité cellulaire, plutôt qu’une moyenne de l’ARNm dans un groupe de cellules29, et peut être particulièrement utile lors de l’étude de l’hétérogène SV30. Par exemple, sNuc-Seq a produit une analyse transcriptionnelle qui suggère qu’il pourrait y avoir un rôle pour les cellules fusiformes et racinaires dans la génération de PE, la perte auditive et la maladie de Ménière18. Une caractérisation transcriptionnelle plus poussée des différents types de cellules SV peut nous fournir des informations précieuses sur la physiopathologie sous-jacente aux différents mécanismes et sous-types de fluctuation auditive et de perte auditive liée à la SV. La récolte de ces structures délicates de l’oreille interne est d’une importance primordiale pour une analyse tissulaire optimale.

Dans cette étude, l’approche de microdissection pour accéder à la strie vasculaire et l’isoler de la cochlée de souris adulte pour sNuc-Seq ou immunomarquage est décrite. La dissection de la SV de souris adulte est nécessaire pour comprendre divers types de cellules SV et caractériser davantage leur rôle dans l’audition.

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Protocole

Toutes les expériences et procédures sur les animaux ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Institut national des maladies neurologiques et des accidents vasculaires cérébraux et l’Institut national sur la surdité et autres troubles de la communication, National Institutes of Health. Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Institut national des maladies neurologiques et des accidents vasculaires cérébraux et l’Institut national sur la surdité et autres troubles de la communication, National Institutes of Health. Toutes les méthodes ont été appliquées conformément aux directives et règlements pertinents du Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Institut national des maladies neurologiques et des accidents vasculaires cérébraux et de l’Institut national sur la surdité et autres troubles de la communication, National Institutes of Health.

1. Euthanasie animale

  1. Utilisez des souris transgéniques C57BL/6J ou Kcnj10-ZsGreen, jour 30+ postnatal (P30+), qui pèsent entre 15 et 20 g.
  2. Euthanasier une souris adulte (âge P30 ou plus) en utilisant un protocole approuvé (ici l’asphyxie au CO2 ). Effectuez la décapitation comme étape secondaire.
    REMARQUE: En cas d’immunomarquage, certains anticorps peuvent avoir un signal de fond en raison d’une liaison non spécifique au sang dans les capillaires de la SV. La perfusion cardiaque avec fixateur peut résoudre ce problème en retirant le sang des capillaires du SV. Cependant, la plupart des anticorps peuvent obtenir de bons résultats sans cette méthode, et elle ne sera pas couverte par ce protocole.

2. Exposer le labyrinthe osseux

  1. Nettoyez la souris en pulvérisant avec de l’éthanol à 70% et en l’essuyant avec une serviette en papier. Portez une attention particulière à la région de la tête pour réduire le risque de contamination. Enlevez la peau du crâne en tirant la peau vers le nez.
  2. À l’aide de ciseaux tranchants, fendez le crâne le long du plan médio-sagittal pour séparer les parties gauche et droite.
  3. Retirez le cerveau du crâne pour exposer le labyrinthe osseux.

3. Extraction de l’oreille interne

  1. Identifiez l’oreille interne dans l’os temporal (Figure 2A) et grattez les nerfs crâniens à l’aide d’une pince #55.
    REMARQUE: L’utilisateur doit stabiliser l’échantillon avec sa main non dominante à l’aide d’un deuxième jeu de pinces #55. Différentes zones de l’échantillon peuvent être saisies avec la pince stabilisatrice tout au long de la dissection si les zones critiques de l’échantillon sont évitées (p. ex., ne pas écraser la cochlée).
  2. À l’aide de la pince #55, disséquez la bulle et la capsule, en les détachant de l’os environnant. Retirez tous les tissus mous restants de la surface de l’oreille interne.
  3. Transférer l’échantillon dans une boîte de culture tissulaire transparente contenant 1x PBS froid (solution saline tamponnée au phosphate), pH 7,4, et placer sous une lunette de dissection (figure 2B).

4. Dissection SV

REMARQUE: Avec de la pratique, il est possible de disséquer le SV comme une longue pièce ressemblant à un ruban. Le SV est fragile, donc s’il se brise en morceaux, ceux-ci peuvent être stockés ensemble. Alternativement, ceux-ci peuvent être stockés dans des puits étiquetés séparément en fonction de leur tour (par exemple, basal, moyen, apical).

  1. Si les sources lumineuses de la lunette de dissection peuvent être déplacées, placez une lumière au-dessus de l’antenne parabolique et la deuxième source lumineuse sur le côté, parallèlement à la surface de dissection. Cela permet un meilleur contraste du tissu sous l’os cochléaire.
  2. À l’aide d’une pince #55, tenez le spécimen par la partie vestibulaire avec la cochlée tournée vers le haut.
  3. À l’aide de la pince #55, percez l’os cochléaire à l’apex.
    REMARQUE: Les pinces #5 sont plus épaisses que #55 et peuvent être utilisées pour casser les os, mais l’augmentation de la taille / force sacrifie la finesse des pinces et la capacité de manipuler de petits tissus. Envisagez d’utiliser des pinces fabriquées avec un matériau tel que l’inox ou le dumostar pour éviter les dommages qui pourraient survenir aux pinces plus délicates. Évitez d’enfoncer la pince trop profondément sous l’os pour éviter d’endommager le SV.
  4. À l’aide de la pince #55, gratter le long du tour apical (Figure 2C), en appliquant une force douce pour détacher de petits morceaux de la couche osseuse externe. Soulevez doucement l’os et détachez-le de la paroi latérale.
    NOTE: Il peut être utile de penser à cette dissection comme « enlever tout du SV », plutôt que de « disséquer le SV hors de la cochlée ».
  5. Continuez à utiliser les pinces #55 pour retirer les morceaux d’os cochléaire des tours apical et moyen (Figure 2D,E). En poussant doucement le long de la paroi latérale, soulevez et retirez les morceaux de paroi osseuse vers le virage du milieu pour exposer la paroi latérale des virages apical et moyen.
  6. En continuant à utiliser la pince #55, poussez doucement la paroi latérale du virage apical de côté pour exposer le ganglion en spirale. Détachez la paroi latérale des spires apicales et moyennes du ganglion en spirale le long de la couche externe des cellules ciliées. Retirez des morceaux de ganglion en spirale de l’intérieur de la cochlée.
    REMARQUE: Les pinces #55 sont plus petites et offrent un avantage lors de la manipulation de tissus petits et délicats. Des précautions supplémentaires doivent être prises pour éviter de les plier ou de les endommager.
  7. Pour avoir un meilleur accès à la paroi latérale du tour basal, détachez la cochlée de la partie vestibulaire de l’os temporal à l’aide d’une pince #55. Placez la pince #55 dans la fenêtre ronde et ovale et poussez vers le bas vers le vestibule. La cochlée se détachera. Retirez la partie vestibulaire de l’oreille interne.
  8. En continuant à utiliser les pinces #55, retirez maintenant les morceaux d’os cochléaire basal, en commençant par la zone de virage du milieu. Poussez doucement la couche de paroi latérale sous l’os pour le détacher.
  9. Enlevez la partie basale la plus éloignée de la paroi latérale en retirant et en tirant doucement le tissu. L’os dans cette région peut être trop épais pour être enlevé sans endommager les tissus mous en dessous.
  10. Maintenant, avec la partie basale de la paroi latérale détachée, séparez autant que possible la paroi latérale de la cochlée. Cela peut être fait en traçant la pince #55 le long de la paroi latérale. Brossez doucement la pince entre l’os et la paroi latérale restante. Cela peut être fait jusqu’au sommet en un seul morceau si l’utilisateur est expérimenté. Déplacez la paroi latérale vers un nouveau PBS.
    REMARQUE : Bien que les plus gros morceaux de SV puissent être plus faciles à imager, étant donné la nature délicate des tissus, des morceaux plus petits peuvent être prélevés (Figure 2F, G) et, selon la taille, peuvent également fonctionner pour l’imagerie.
  11. Utilisez des pinces #55 pour poser la paroi latérale à plat. Le SV doit être visible sous la forme d’une couche de tissu plus foncée sur le côté interne de la paroi latérale.
    REMARQUE : Les utilisateurs peuvent constater, particulièrement près de l’extrémité apicale, qu’une partie du tissu SV se détache accidentellement de la paroi latérale tout au long de la dissection.
  12. Retirez doucement la couche SV pour la détacher de la paroi latérale à son extrémité basale (Figure 2H). Écartez doucement le SV détaché et déplacez la pince plus loin vers l’extrémité apicale de la paroi latérale, en détachant le SV comme un long ruban si possible (Figure 2I). Ne pressez pas le SV avec une pince pour le tirer. Si le tissu est trop fragile pour être saisi, il peut également être prélevé à l’aide d’une cuillère de tissu, telle qu’une curette chalazion.
    REMARQUE: Le déplacement du SV doit toujours être effectué sous microscopie optique pour s’assurer qu’il n’est pas perdu. Soyez toujours prudent lorsque vous saisissez à l’aide de forceps en raison du risque de dommages. Les utilisateurs peuvent constater que l’utilisation de chalazion curette atténue le risque de dommages aux tissus SV. Pour le séquençage mononoyau, passez à la section 5. Pour l’immunocoloration par SV, passez à la rubrique 7.

5. Suspension mononoyau SV

REMARQUE: Ce protocole est adapté pour le tissu SV spécifiquement à partir d’un protocole de suspension mononoyau publié par le fabricant. Des plates-formes de différents fabricants peuvent être utilisées31. Compte tenu des variations propres à la plate-forme, il est recommandé de revoir le protocole spécifique au fabricant fourni avec l’équipement. Pour obtenir des résultats optimaux pour sNuc-Seq et minimiser la dégradation de l’ARN, plus la dissection tissulaire est rapide, mieux c’est (recommandé dans les 15 à 20 minutes suivant l’euthanasie). Il peut être utile d’euthanasier un animal à la fois et seulement lorsqu’il est prêt à le disséquer. Le fait que plusieurs personnes travaillent simultanément sur les dissections peut également éliminer le temps de dégradation (p. ex., un membre du personnel de laboratoire travaille sur l’oreille gauche tandis qu’un autre travaille sur l’oreille droite).

  1. Si le tissu SV doit être utilisé pour le sNuc-Seq, placer le tissu dans un tampon de lyse réfrigéré (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,005% nonidet P40 dans de l’eau sans nucléase).
    REMARQUE : Si le séquençage doit être effectué immédiatement après la dissection, poursuivez le protocole. Si l’on souhaite mettre en pause le protocole, la préservation de SV est possible en plaçant le SV dans RNAlater. Conserver toute la nuit à 4 °C, puis congeler dans de l’azote liquide et conserver à -80 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à être utilisé. Lorsque vous êtes prêt à l’emploi, décongeler et laver deux fois dans du PBS pendant 5 minutes chacun, puis procéder à l’homogénéisation (étape 5.2).
  2. Homogénéiser le tissu dans un homogénéisateur de rebond de 2 ml avec 10-20 coups sur la glace.
    REMARQUE: Le cylindre de verre entrera en contact manuellement avec le fond du tube de verre, fragmentant le SV. Le SV est délicat, donc 20 coups permettent généralement une homogénéisation réussie.
  3. Lyser le tissu sur la glace pendant 25 min.
    REMARQUE: Le temps de lyse varie selon le type de tissu. Une lyse de 25 minutes dans le tissu SV peut atteindre une faible viabilité cellulaire (moins de 4%), mais le temps peut être adapté si la viabilité cellulaire est trop élevée (étape 5.8).
  4. Filtrer à travers un filtre de 30 μm et faire tourner le filtrat à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
  5. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de tampon de lavage et de remise en suspension des noyaux (1x PBS, albumine sérique bovine à 1 % [BSA], inhibiteur de la RNase 0,2U/μL).
  6. Filtrer les cellules à travers un filtre de 10 μm et centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
  7. Retirer le surnageant et remettre en suspension dans 50 μL de tampon de lavage et de remise en suspension des noyaux.
  8. Compter les noyaux à l’aide d’un compteur de cellules et d’une coloration bleue au trypan. Diluer 5 μL de la suspension cellulaire dans 50 μL de 1x PBS pour le comptage cellulaire; La viabilité devrait être minime (3 % à 4 %) à ce stade. Si la viabilité s’avère plus élevée, adapter le protocole pour l’étape 5.3 (lyse) et normaliser le temps de lyse pour assurer une lyse adéquate des cellules.
    REMARQUE: Une viabilité cellulaire élevée dans une préparation à un seul noyau signifie qu’il y a plus de cellules intactes que souhaité, et qu’une digestion supplémentaire peut être nécessaire.
  9. Chargez l’échantillon avec la densité nucléaire souhaitée sur l’appareil/puce du fabricant (voir le guide du fabricant). Les captures à noyau unique sont maintenant prêtes.
    REMARQUE : À partir d’une souris adulte SV, on obtient habituellement 50 μL de la suspension à une concentration de 150 000 noyaux/mL.

6. Séquençage mononoyau SV

  1. Envoyez les échantillons à l’installation centrale pour le séquençage.
    REMARQUE: Cette partie du protocole suit les étapes générales de (1) la génération et le codage à barres de l’émulsion de billes de gel (GEM), (2) le nettoyage post-GEM-RT et l’amplification de l’ADNc, et (3) la construction de la bibliothèque d’expression génique 3'. Le reste du protocole sNuc-Seq est relativement long, et il est recommandé aux lecteurs d’utiliser leur protocole spécifique au fabricant. Le guide du fabricant décrira probablement les étapes avec des détails spécifiques et des images d’accompagnement. Il peut également y avoir des vidéos pratiques sur le site Web du fabricant. Les ensembles de données générés peuvent être représentés de manière dimensionnelle réduite, telle qu’une approximation et une projection de variété uniforme (UMAP; Graphique 3). De nombreux laboratoires utilisent un noyau de séquençage qui peut exécuter ce protocole pour les utilisateurs.

7. Immunomarquage SV et montage tissulaire

  1. Si le tissu doit être utilisé pour l’immunomarquage, transférez-le dans une plaque de 24 puits, immergée dans 200 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 4% dans 1x PBS et incuber pendant 20 minutes à température ambiante.
    REMARQUE: Il est utile d’effectuer tout l’élimination des liquides, le lavage et l’immunocoloration sous un microscope. La visualisation lors du pipetage du tissu garantira qu’il n’est pas perdu accidentellement lors de l’élimination du liquide. Les volumes des anticorps et des lavages peuvent être ajustés tant que le volume est suffisamment important pour immerger le tissu SV dans la solution.
  2. Après l’étape de fixation, retirer le PFA en effectuant deux courts lavages dans 1x PBS (environ 500 μL) à 4 °C pendant 5 minutes chacun sur un agitateur orbital à bas régime (30-50) RPM. En cas de stockage, le tissu peut être stocké dans 1x PBS à 4 °C.
  3. Retirer le PBS et perméabiliser et bloquer pendant au moins 1 h à température ambiante dans environ 300 μL de solution PBS-T (0,05 Tween20 dans 1x PBS avec 10% de sérum fœtal bovin).
    REMARQUE : Les anticorps primaires et secondaires doivent être dilués dans cette solution bloquante.
  4. Colorer le tissu avec l’anticorps primaire selon les spécifications de l’anticorps particulier utilisé, généralement pendant une nuit à 4 ° C. Retirez le PBS restant et ajoutez l’anticorps primaire dilué.
    NOTA: La dilution doit être choisie en fonction des suggestions du fabricant, des données publiées, de l’expérience antérieure, etc. Habituellement, la première concentration à tester est une dilution de 1:100-200. Pour l’exemple présenté dans cet article, les anticorps GS-IB4 et DAPI ont chacun été dilués à 1:200. En cas de coloration pour plus d’une protéine, plusieurs anticorps primaires peuvent être combinés dans la même solution, à condition que chaque anticorps primaire ait un hôte différent pour éviter la réactivité croisée des anticorps secondaires.
  5. Laver l’anticorps primaire du tissu en utilisant environ 500 μL de 1x PBS deux fois pendant 10 minutes chacun sur un agitateur orbital à bas régime.
    REMARQUE : Continuez à vous assurer que le tissu SV est immergé dans la solution et non coincé sur le côté du puits.
  6. Coloration avec un anticorps secondaire selon les spécifications de l’anticorps particulier utilisé, généralement pendant 2 h à température ambiante sur un agitateur orbital à bas régime. Couvrir la plaque de 24 puits afin que l’anticorps secondaire marqué par fluorescence soit protégé de la lumière.
    REMARQUE : Si plus d’un anticorps secondaire est nécessaire, combinez les anticorps secondaires dans la même solution. Assurez-vous d’éviter l’étiquetage croisé.
  7. Laver l’anticorps secondaire du tissu en utilisant environ 500 μL de 1x PBS quatre fois pendant 5 minutes chacun sur un agitateur orbital à bas régime. Gardez la plaque de 24 puits couverte pour la protéger de la lumière.
  8. Préparez la plus grande lame microscopique (75 mm x 25 mm) en plaçant deux petites traînées de colle le long de l’axe de 25 mm, juste plus petites que la lamelle de verre plus petite de 18 mm x 18 mm. Placez une goutte de réactif de montage (environ 50 μL) entre les traînées de colle.
    REMARQUE: La colle crée une petite quantité d’espace vertical de sorte que lorsque le deuxième couvercle est placé sur le dessus, l’échantillon de tissu SV peut exister en toute sécurité, mais continuer à rester en place. Bien que l’épaisseur de la strie soit de 30 à 40 microns, il faut éviter de presser le tissu entre les surfaces vitrées pour préserver la morphologie. Alternativement, du ruban adhésif transparent peut également être utilisé.
  9. À l’aide de pinces #55, saisir le moins de tissu possible à une extrémité du SV et transférer du PBS à la goutte de réactif de montage sur la plus grande microlame (75 mm x 25 mm). Placez une extrémité d’une petite glissière de verre (18 mm x 18 mm) sur la glissière où une traînée de colle a été placée et relâchez-la doucement pour éviter de créer des bulles d’air. Le couvercle tombera sur l’autre traînée de colle et couvrira le tissu SV.
  10. Scellez le support en tamponnant une goutte de vernis à ongles transparent sur chaque coin du support. Étiquetez l’échantillon en conséquence sur le couvercle en verre loin du champ de visualisation. Il est maintenant prêt pour la microscopie confocale (Figure 4).
  11. Visualisez le tissu SV à l’aide d’un microscope à dissection pour vous assurer qu’il est posé à plat et non près de bulles d’air. Si le tissu SV n’est pas orienté correctement, l’utilisateur peut tenter d’expulser les bulles d’air ou retirer soigneusement le plus petit capot en verre et repositionner le SV. Cela doit être fait doucement pour éviter de casser les lamelles de couvercle.

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Résultats

Nous présentons une méthode pour isoler le SV à utiliser pour le sNuc-Seq ou l’immunomarquage. L’anatomie pertinente (Figure 1) de la cochlée par rapport à la SV peut aider les utilisateurs à mieux comprendre l’organisation de la SV et les étapes du protocole de dissection.

Chaque étape de cette microdissection de SV à partir d’une souris P30 est détaillée dans la vidéo associée, et des instantanés des étapes clés de cette dissection et de l’isolement de SV sont p...

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Discussion

Avant l’avènement du séquençage unicellulaire, de nombreux chercheurs utilisaient l’analyse tissulaire en vrac, qui ne permettait que d’analyser les transcriptomes moyennés entre les cellules. En particulier, single-cell et sNuc-Seq ont permis d’isoler le transcriptome d’une seule cellule ou d’un seul noyau, respectivement32. Dans ce cas, les transcriptomes mononucléaux peuvent être identifiés pour les cellules marginales, intermédiaires et basales, ainsi que pour les cellules fusiformes

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette recherche a été financée en partie par le programme de recherche intra-muros des NIH, NIDCD to M.H. (DC000088)

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
10 et micro ; m filtre (polyéthylentérétalate)PluriSelect#43-50010-01Tissu filtrant pendant sNuc-Seq
18 x 18 mm verre de couvertureFisher Scientific12-541AHousse pour montage SV
30-µ ; Filtre m (Polyéthylentérphétalate)PluriSelect#43-50030-03Filtrer le tissu pendant le sNuc-Seq
75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus MicroslideDaiggerEF15978ZMicroslide pour monter SV sur
souris C57BL/6JThe Jackson Laboratory RRID : IMSR_JAX :000664Souche de souris à usage général dont le pigment est plus facilement visible dans les cellules intermédiaires du SV.
Compteur de cellulesLogos BiosystemsL20001Utilisé pour le comptage cellulaire
Curette Chalizon 5'', taille 3 2,5 mmInstruments de recherche biomédicale15-1020Utilisé pour le transfert
Chromium Next GEM Single Cell 3' GEM Kit v3.1ChromiumPN-1000141Génère des bibliothèques d’expression génique single cell 3'
Vernis à ongles transparentFisher ScientificNC1849418Utilisé pour l’étanchéité
boîtes de culture tissulaire standard Corning Falcon à monture SV, 24 puitsCorning08-772BBoîte de culture utilisée pour maintenir l’échantillon lors de la dissection
DAPIInvitrogenD1306, RRID : AB_2629482Teinture utilisée pour l’étiquetage des noyaux
Dounce homogénéisateurSigma-AldrichD8938Utilisé pour homogénéiser les tissus pour les pinces Dumont #5 sNuc-seq
Fine Science Tools11252-30Pince générale pour dissection
Dumont #55 Forceps FineScience Tools11255-20Pince à pointe fine qui facilite la manipulation
de SV Sérum fœtal bovinThermoFisher16000044Utilisé pour les étapes de sNuc-Seq Bâton de
colleFisher ScientificNC0691392Utilisé pour le montage
GS-IB4 AnticorpsMoléculaire SondesI21411, RRID : AB-2314662Anticorps utilisé pour le marquage capillaire
KCNJ10-ZsGreen Sourisn/an/a souristransgénique qui exprime KCNJ10-ZsGreen, en particulier dans les cellules intermédiaires de la SV.
MgCl2ThermoFisherAM9530GUtilisé pour les étapes de sNuc-Seq Réactif de
montageThermoFisher#S36940Réactif de montage pour
SV Multiwell 24 puits PlaqueCorning#353047Plaque utilisée pour l’immunomarquage
NaClThermoFisherAAJ216183Utilisé pour les étapes de sNuc-Seq
Nonidet P40Sigma-Aldrich9-16-45-9Utilisé pour les étapes de sNuc-Seq
Eau sans nucléaseThermoFisher4387936Utilisé pour les étapes de l’agitateur orbital sNuc-Seq
Silent ShakeSYC-2102AUtilisé pour les étapes de l’immunocoloration
PBSThermoFisherJ61196. APUtilisé pour les étapes d’immunocoloration et de dissection
de l’ARNInvitrogenultérieur AM7021Utilisé pour la préservation de SV pour les scizzors sNuc-Seq
Fine Science Tools14058-09Utilisé pour fendre le crâne de souris
Tris-HClSigma-Aldrich15506017Utilisé pour les étapes de sNuc-Seq
Trypan blue stainGibco15250061Utilisé pour le comptage cellulaire
Tween20ThermoFisherAAJ20605APUtilisé pour les étapes de sNuc-Seq
Stéréomicroscope Zeiss STEMI SV 11 ApoMicroscope Zeissn/aUtilisé pour les dissections
les SV des SV

Références

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