Système de pseudo-îlots humains pour l’évaluation synchrone de la dynamique des biocapteurs fluorescents et des profils de sécrétion hormonale

Tiffany M. Richardson; Yasminye D. Pettway; John T. Walker; Heather A. Nelson; Matthew Ishahak; Gregory Poffenberger; Radhika Aramandla; Conrad Reihsmann; Ashutosh Agarwal; Alvin C. Powers; Marcela Brissova

doi:10.3791/65259

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Article de méthode

Système de pseudo-îlots humains pour l’évaluation synchrone de la dynamique des biocapteurs fluorescents et des profils de sécrétion hormonale

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DOI :

10.3791/65259

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3 novembre 2023

Tiffany M. Richardson^*¹ , Yasminye D. Pettway^*¹ , John T. Walker¹ , Heather A. Nelson² , Matthew Ishahak³ , Gregory Poffenberger² , Radhika Aramandla² , Conrad Reihsmann² , Ashutosh Agarwal³ , Alvin C. Powers¹^,²^,⁴ , Marcela Brissova²

¹Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University School of Medicine, ²Division of Diabetes, Endocrinology and Metabolism, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center, ³Department of Biomedical Engineering, University of Miami, ⁴VA Tennessee Valley Healthcare System

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une méthode d’acquisition synchrone et de co-enregistrement d’événements de signalisation intracellulaire et de sécrétion d’insuline et de glucagon par des pseudo-îlots humains primaires en utilisant l’administration adénovirale d’un biocapteur d’adénosine monophosphate cyclique (AMPc), d’un détecteur de différence d’AMPc in situ (cADDis) et d’un système de micropérifusion.

Résumé

Les îlots pancréatiques de Langerhans, qui sont de petites collections 3D de cellules endocriniennes et de soutien spécialisées disséminées dans tout le pancréas, jouent un rôle central dans le contrôle de l’homéostasie du glucose par la sécrétion d’insuline par les cellules bêta, ce qui abaisse la glycémie, et de glucagon par les cellules alpha, qui augmente la glycémie. Les voies de signalisation intracellulaires, y compris celles médiées par l’AMPc, sont essentielles à la sécrétion régulée d’hormones alpha et bêta des cellules. La structure 3D des îlots pancréatiques, bien qu’essentielle à la coordination de la fonction des îlots pancréatiques, présente des défis expérimentaux pour les études mécanistiques des voies de signalisation intracellulaires dans les cellules primaires des îlots pancréatiques humains. Pour surmonter ces défis et ces limitations, ce protocole décrit une plate-forme intégrée d’imagerie et de microfluidique de cellules vivantes utilisant des pseudo-îlots humains primaires générés à partir de donneurs non diabétiques qui ressemblent à des îlots natifs dans leur morphologie, leur composition et leur fonction. La taille de ces pseudo-îlots est contrôlée par le processus de dispersion et de réagrégation des cellules primaires des îlots pancréatiques humains. À l’état dispersé, l’expression des gènes des cellules des îlots pancréatiques peut être manipulée ; par exemple, des biocapteurs tels que le biocapteur d’AMPc génétiquement codé, cADDis, peuvent être introduits. Une fois formés, les pseudo-îlots exprimant un biocapteur génétiquement codé, en combinaison avec la microscopie confocale et une plateforme de micropérifusion, permettent l’évaluation synchrone de la dynamique des biocapteurs fluorescents et des profils de sécrétion des hormones alpha et bêta des cellules alpha et bêta afin de mieux comprendre les processus et la fonction cellulaires.

Introduction

Les îlots de Langerhans sont des mini-organes disséminés dans tout le pancréas dont la fonction est cruciale pour le maintien de l’homéostasie du glucose. L’insuline est sécrétée par les cellules bêta à la suite du métabolisme du glucose, d’une augmentation du rapport ATP/ADP, de la fermeture des canaux potassiques sensibles à l’ATP, d’une dépolarisation de la membrane plasmique et de l’afflux de calcium extracellulaire¹. La sécrétion de glucagon par les cellules alpha est moins comprise, mais il a été postulé que les voies intracellulaires et paracrines contribuent à l’exocytose des granules de glucagon ^2,3,4....