Perfusion sanguine rapide efficace chez Xenopus

Résumé

Un protocole efficace de perfusion sanguine rapide est présenté ici pour préparer des échantillons de tissus de grenouilles à griffes africaines pour des études transcriptomiques et protéomiques.

Résumé

Les Xénopes sont de puissants organismes modèles pour comprendre le développement des vertébrés et les maladies depuis plus de 100 ans. Ici, un protocole de perfusion sanguine rapide dans Xenopus, visant à une réduction cohérente et drastique du sang dans tous les tissus, est défini. La perfusion est réalisée en insérant une aiguille directement dans le ventricule du cœur et en pompant une solution saline héparinée tamponnée au phosphate (PBS) à travers le système vasculaire. La procédure peut être complétée en environ 10 minutes par animal. Le sang est dominé par quelques protéines et types de cellules très abondants, créant de nombreux problèmes car ces protéines masquent la plupart des autres molécules et types de cellules d’intérêt. La caractérisation reproductible des tissus Xenopus adultes avec la protéomique quantitative et la transcriptomique unicellulaire bénéficiera de l’application de ce protocole avant l’échantillonnage d’organes. Les protocoles d’échantillonnage tissulaire sont définis dans des documents d’accompagnement. Ces procédures visent à normaliser les pratiques chez Xenopus de sexe, d’âge et d’état de santé différents, en particulier X. laevis et X. tropicalis.

Introduction

La perfusion du corps entier des amphibiens est systématiquement complétée à des fins de préservation et de fixation 1,2,3,4,5,6. Cependant, ces procédures se produisent à un rythme qui limite le nombre d’échantillons frais qui peuvent être prélevés par animal. Le but de ce travail est de développer un protocole de perfusion sanguine efficace chez Xenopus, en priorisant la vitesse de la technique. Le protocole prend moins de 10 minutes par animal pour X. tropi....

Protocole

Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux règles et règlements de la Harvard Medical School IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (IS 00001365_3).

REMARQUE : Bien que la principale méthode d’euthanasie décrite soit considérée comme une technique acceptable pour l’euthanasie par l’American Veterinary Medical Association¹², il n’a pas été constaté qu’elle entraînait l’arrêt d’un battement de cœur¹³. Même la méthode secondaire fréquemment utilisée de double pithing n’empêche pas cela, pas plus que le retrait du cœur de l’animal. L’exsanguination des animaux anesthési....

Résultats

Après une perfusion réussie, tous les tissus (à l’exception du foie dans Xenopus pigmenté) seront nettement plus légers et moins saturés de sang. Les principaux vaisseaux sanguins deviendront moins visibles (figure 10) et les tissus (à l’exclusion du foie) se rinceront proprement dans le tampon après avoir été échantillonnés. Bien que la réussite de l’exécution du protocole ne puisse finalement être confirmée que par la qualité des données provenant d’échantillons de tissus exsangui.......

Discussion

Ce protocole décrit les techniques de dissection traditionnelles pour accéder à la cavité cœlomique. D’autres techniques sont également acceptables, à condition qu’elles causent des dommages minimes aux tissus, que le cœur soit accessible et que les poumons et l’estomac soient visibles. De même, la plupart des outils de dissection énumérés peuvent être facilement remplacés par des éléments comparables.

Bien que des tentatives aient été faites pour optimiser l’efficacité de cette procédure, les.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
5x Loupe avec lumière LED et support	amazon.com	la	lumière B08QJ6J8P1 ne doit pas produire de chaleur
Pipettes de transfert jetables	VWR	414004-036
Dissection pince à pointe fine	Fisher Scinetific	08-875
Ciseaux de dissection piont pointus, droits 6.5"	VWR	76457-374
Plateau de dissection	Fisher Scinetific	14-370-284	Les feuilles de polystyrène sont une alternative acceptable
Récipient d’euthanasie	Article en plastique US	; 2860	contenants opaques alternatifs acceptables
Couvercle de récipient d’euthanasie	US Plastic	Item  ; 3047
Broches de dissection fine	Living Systems Instrumentation	PIN-#3
Aiguilles hypodermiques à usage général, 22 G	Fisher Scientific	14-826-5A	pour X. laevis
Aiguilles hypodermiques à usage général, 25 G	Fisher Scientific	14-826AA	pour X. tropicalis
Héparine, muqueuse	intestinale porcineCiseaux d’iridectomie MilliporeSigma	37-505-410MG
6"	vwr	470018-938	ciseaux à iris sont une alternative acceptable
Adaptateur Luer à barbe mâle Luer avec bague de verrouillage	amazon.com	B09PTX6M2Z	taille dépendra de l’arrosage de la pompe utilisé
Porte-aiguille Mayo-Hegar	Fisher Scinetific	08-966	pince moustique sont une alternative acceptable
MS-222 : Syncaine (anciennement tricaïne)	Pentair AES	TRS1
PBS 1x	Corning	21-040-CV
Pompe doseuse de liquide péristaltique 5&ndash ; 100 mL/min		amazon.com	B07PWY4SM6 toute pompe péristaltique capable de pomper 5-10 mL/min est acceptable
Pierre à aiguiser	VWR	470150-112	en option ; pour émousser les aiguilles
Bicarbonate de sodium, poudre, USP	Fisher Scientific	18-606-333
Pince à échantillons, dentelée	VWR	82027-442
Broches en T pour la dissection	Fisher Scinetific	S99385
Seringues à insuline courtes ultra-fines, 31 G	VWR	BD328438
Coupe-fil, coupe-coupe latéral ultra tranchant et puissant de 6 pouces	amazon.com	B087P191LP

Les