Ce protocole se concentre sur la néovascularisation cornéenne induite par les brûlures alcalines chez la souris. La méthode génère un modèle de maladie cornéenne reproductible et contrôlable pour étudier l’angiogenèse pathologique et les mécanismes moléculaires associés et pour tester de nouveaux agents pharmacologiques pour prévenir la néovascularisation cornéenne.
Article de méthode
Un modèle murin pour la néovascularisation cornéenne par brûlure alcaline
Dans cet article
Résumé
Résumé
La néovascularisation cornéenne (CoNV), une forme pathologique d’angiogenèse, implique la croissance des vaisseaux sanguins et lymphatiques dans la cornée avasculaire à partir du limbe et affecte négativement la transparence et la vision. La brûlure alcaline est l’une des formes les plus courantes de traumatisme oculaire qui conduit à la CoNV. Dans ce protocole, le CoNV est induit expérimentalement à l’aide d’une solution d’hydroxyde de sodium de manière contrôlée pour assurer la reproductibilité. Le modèle de brûlure alcaline est utile pour comprendre la pathologie de CoNV et peut être étendu à l’étude de l’angiogenèse en général en raison de l’avascularité, de la transparence et de l’accessibilité de la cornée. Dans ce travail, le CoNV a été analysé par examen direct au microscope à dissection et par immunomarquage de cornées à montage plat à l’aide d’anticorps monoclonaux anti-CD31. La lymphangiogenèse a été détectée sur des cornées à montage plat par immunomarquage à l’aide d’anticorps monoclonaux anti-LYVE-1. L’œdème cornéen a été visualisé et quantifié à l’aide de la tomographie par cohérence optique (OCT). En résumé, ce modèle permettra de faire progresser les tests de néovascularisation existants et de découvrir de nouvelles stratégies de traitement de l’angiogenèse oculaire et extraoculaire pathologique.
Introduction
La cornée est un tissu avasculaire qui maintient sa transparence en établissant un privilège angiogénique 1,2. Les dommages à la cornée peuvent entraîner une inflammation et le développement de vaisseaux sanguins et lymphatiques, ainsi qu’une fibrose3. La néovascularisation cornéenne (CoNV) entraîne une déficience visuelle et est la deuxième cause de cécité dans le monde4. Le CoNV touche environ 1,4 million de personnes aux États-Unis chaque année5. Le CoNV peut être induit par divers facteurs, notamment des brûlures chimiques, des infections, de l’inflammation et de l’hypoxie 3,6. Les brûlures chimiques sont l’une des urgences oculaires les plus courantes, et elles représentent environ 13,2 % des traumatismes oculaires et nécessitent une évaluation et un traitement immédiats7. Les brûlures chimiques peuvent être des brûlures alcalines ou acides, mais les brûlures alcalines causent des blessures plus graves, car l’alcali pénètre plus profondément dans les tissus8.
Les modèles murins de brûlures alcalines sont largement utilisés pour étudier la CoNV et la cicatrisation des plaies. Par rapport au modèle 9,10 d’angiogenèse de poche cornéenne, les modèles de brûlures alcalines sont relativement simples à créer et peuvent également être utilisés pour étudier l’inflammation, la fibrose et la prolifération épithéliale de la cornée. Ces modèles sont également plus étroitement liés aux brûlures chimiques cliniques que les modèles de suture cornéenne de l’angiogenèse11. En cas de brûlure alcaline, la cornée, autrement avasculaire, développe des vaisseaux sanguins en raison de l’inflammation et d’un déséquilibre des facteurs anti-angiogéniques et pro-angiogéniques 1,2. Les inconvénients des modèles de brûlures alcalines cornéennes sont les difficultés à contrôler la zone et la gravité de la brûlure alcaline, la variation de la néovascularisation cornéenne et la brûlure involontaire des tissus adjacents due à un excès de solution alcaline. Le but de cette étude est de décrire un modèle de brûlure alcaline cornéenne contrôlée chez la souris à l’aide d’un papier filtre pré-imbibé d’une solution d’hydroxyde de sodium. Ce modèle pourrait être utilisé pour étudier les facteurs angiogéniques, les réactifs thérapeutiques anti-angiogéniques et d’autres facteurs et réactifs qui pourraient moduler l’inflammation et la fibrose.
Protocole
Tous les travaux sur les animaux, y compris les procédures expérimentales et l’euthanasie, ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC) du Baylor College of Medicine sous le numéro de protocole AN-8790.
1. Préparation de 1 N NaOH
- Ajouter 4 mL d’eau stérile déminéralisée dans un tube à centrifuger de 15 mL. Pesez 400 mg d’hydroxyde de sodium (NaOH) et ajoutez-les soigneusement dans le tube.
- Dissoudre le NaOH en remuant lentement la solution à l’aide d’une tige de verre. Augmentez le volume à 10 ml en ajoutant de l’eau déminéralisée stérile dans le tube, puis mélangez à nouveau en retournant doucement le tube de haut en bas. Fermez hermétiquement le bouchon et conservez la solution à température ambiante.
- Préparez la solution fraîche tous les mois car la concentration de la solution de NaOH peut être réduite par la solution absorbant le dioxyde de carbone dans l’air.
- Mélangez toujours délicatement la solution de NaOH avant utilisation.
ATTENTION : Préparez la solution à l’intérieur d’une hotte chimique et portez un équipement de protection individuelle (EPI) approprié.
2. Préparation de la solution de paraformaldéhyde (PFA) à 4 %
- Ajouter 30 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1x dans un bécher en verre. Pesez 4 g de paraformaldéhyde (PFA) et ajoutez-le au bécher.
- Maintenez le bécher sur une plaque chauffante à 60 °C en remuant. Ajouter la solution de NaOH 1 N goutte à goutte pour augmenter le pH jusqu’à ce que la solution s’éclaircisse.
- Vérifiez et ajustez le pH à 7,4 à l’aide de 1 N d’acide chlorhydrique (HCl). Ajustez le volume final à 50 mL avec 1x PBS.
- Refroidir et filtrer la solution. Conserver la solution à 4 °C.
ATTENTION : Préparez la solution dans une hotte tout en portant un EPI approprié.
3. Préparation du cocktail kétamine/xylazine
- Préparer le cocktail kétamine/xylazine en ajoutant 0,8 mL de kétamine (concentration de base : 100 mg/mL) et 0,16 mL de xylazine (concentration de base : 100 mg/mL) à 9,4 mL de solution saline.
- Conservez le cocktail dans des flacons d’injection stériles à température ambiante (RT).
4. Brûlure alcaline sur la cornée de la souris
- Injecter du méloxicam (4 à 6 mg/kg de poids corporel) par voie sous-cutanée 30 minutes avant l’intervention pour soulager la douleur. Anesthésier les souris (C57BL/6J, 6-8 semaines, mâles) à l’aide d’une injection i.p. du cocktail kétamine/xylazine (kétamine 80 mg/kg et xylazine 16 mg/kg de poids corporel).
- Vérifiez la réponse réflexe (retrait de la pédale) en pinçant les orteils de la souris, et confirmez l’absence du réflexe. Appliquez une goutte d’anesthésique topique, 0,5 % de proparacaïne, sur la surface cornéenne d’un œil et une goutte de larmes artificielles sur l’autre œil.
- À l’aide d’un poinçon de biopsie de 2 mm, découpez des disques de papier filtre Whatman.
- Ajouter 2 μL de NaOH 1N dans une boîte de Pétri propre. Placez le disque de papier filtre de 2 mm sur la goutte de NaOH 1 N et laissez-la tremper pendant 15 s.
- Prenez le papier filtre à l’aide d’une pince et appliquez-le sur l’œil traité à la proparacaïne au centre de la cornée pendant 30 s.
REMARQUE : Le papier filtre ne doit toucher que le centre de la cornée et des précautions doivent être prises pour éviter le mouvement du papier filtre une fois placé, car déplacer le papier filtre peut provoquer des brûlures aux tissus adjacents. - Laver l’œil en rinçant avec 20 mL de solution saline stérile dans une seringue stérile.
REMARQUE : Des précautions doivent être prises pour s’assurer que la cornée, ainsi que le sac conjonctival, sont soigneusement lavés pour éviter d’endommager davantage la cornée ou les tissus environnants. Le lavage du sac conjonctival empêchera davantage le symblépharon. - Essuyez délicatement l’excès de sérum physiologique des yeux et de la zone environnante à l’aide de lingettes douces jetables. Ensuite, gardez les souris dans une cage de récupération sur un coussin chauffant chaud jusqu’à ce qu’elles soient ambulatoires.
REMARQUE : Les souris sont surveillées quotidiennement après la brûlure alcaline pendant 3 jours. Si des symptômes de douleur ou de stress sont observés, le méloxicam (4-6 mg/kg de poids corporel) est administré par voie sous-cutanée.
5. Examen et évaluation de la néovascularisation et de l’opacité
- Chez les souris anesthésiées, examiner les yeux au microscope à dissection le 10e jour après la brûlure et obtenir des images à l’aide d’une caméra fixée à la lunette de dissection pour évaluer l’opacité et la néovascularisation.
REMARQUE : Un endoscope de dissection ordinaire avec une caméra attachée est suffisant. - Lors de l’observation de la cornée au microscope de dissection, notez l’opacité après la brûlure en fonction de l’échelle12 suivante :
0 = Pas d’opacité ; cornée claire
1 = Légère opacité ; léger flou dans les régions de l’iris et de la pupille ; L’iris et la pupille sont bien visibles
2 = Opacité modérée ; L’iris et la pupille sont à peine visibles
3 = Opacité sévère ; L’iris ou la pupille ne sont pas visibles
4 = Cornée opaque ; L’iris et la pupille ne sont pas visibles - Lors de l’observation de la cornée à l’aide du microscope de dissection, notez le CoNV sur la base de l’échelle suivante12 :
0 = Pas de néovascularisation ; Pas de nouveaux vaisseaux du limbe
1 = Néovascularisation légère ; Nouveaux vaisseaux provenant du limbe
2 = Néovascularisation modérée ; Les vaisseaux sanguins provenaient du limbe et se développaient vers le centre de la cornée
3 = Néovascularisation sévère ; vaisseaux sanguins provenant du limbe et atteignant et/ou traversant le centre de la cornée - Utilisez un test t de Student pour comparer statistiquement les scores d’opacité et de néovascularisation entre les groupes de brûlures alcalines et d’yeux sains.
- Euthanasier les souris au jour 10 par exposition à l’isoflurane à 5 % jusqu’à 1 minute après l’arrêt de la respiration, suivie d’une luxation cervicale, et prélever les cornées pour une imagerie à montage plat.
6. Imagerie par tomographie par cohérence optique (OCT)
- Prenez des images OCT du segment antérieur des yeux chez des souris anesthésiées le 10e jour après la brûlure. Effectuez l’acquisition d’images OCT sous forme de balayage de volume en mode IR + OCT avec un champ de vision de 30° et une intensité IR de 100 %.
- Quantifier l’épaisseur des cornées à l’aide du logiciel ImageJ.
- Pour mesurer l’épaisseur, utilisez l’outil Sélection de ligne du logiciel ImageJ pour créer une ligne droite entre les surfaces antérieure et postérieure au niveau de la cornée centrale.
- Cliquez sur Analyser > Mesurer dans les outils logiciels pour transférer les valeurs dans la fenêtre de données.
- Copiez les valeurs dans un fichier de feuille de calcul et comparez statistiquement l’épaisseur de la cornée entre les groupes oculaires de brûlure alcaline et d’œil sain à l’aide d’un test t de Student.
REMARQUE : L’épaisseur de la cornée est la distance entre un point de la surface cornéenne antérieure et le point le plus proche de la surface cornéenne postérieure au centre de la cornée.
7. Immunomarquage pour CoNV sur les cornées à montage plat
- Euthanasiez les souris au 10e jour après une brûlure alcaline et énucléez les yeux par dissection contondante.
- Écartez les paupières à l’aide du pouce et de l’index, et placez une pince sous le globe oculaire. Fermez la pince et retirez doucement le globe oculaire de l’orbite.
- Placez les globes oculaires dans 1x PBS. Pour chaque globe oculaire, retirez la cornée du globe oculaire en pratiquant d’abord une incision à l’aide d’une aiguille de 30 G sous la zone du limbe.
- Coupez autour de la zone du limbe à l’aide de micro-ciseaux cornéens, avec l’incision comme point de départ, et séparez lentement la cornée et le limbe du globe.
- Nettoyez délicatement les cornées à l’aide d’un pinceau fin pour enlever l’iris. Fixez les cornées dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 1 h.
- Lavez les cornées trois fois pendant 20 minutes chacune dans 1x PBS à température ambiante (RT).
- Incuber dans un tampon bloquant (1 PBS complété par 0,1 % de Triton-X 100 et 5 % d’albumine sérique bovine [BSA]) pendant 1 h à RT.
- Transférez les cornées dans une solution d’anticorps contenant des anticorps primaires. Préparez la solution d’anticorps dans 1x PBS complété par 1 % de BSA, 0,1 % de Triton-X 100, un anticorps monoclonal anti-CD31 conjugué Dylight550 (1 :100) et un anticorps monoclonal anti-LYVE-1 conjugué Alexa Fluor488 (1 :100).
- Incuber pendant 3 jours à 4 °C. Lavez les cornées dans 1x PBS trois fois pendant 20 min chacune.
- Colorer les noyaux à l’aide de la solution colorante Hoechst (1 :1 000) pendant 5 min dans l’obscurité.
- Aplatissez les cornées avec des coupes radiales et montez-les sur une lame de verre pré-nettoyée à l’aide d’un support de montage et de lamelles. Scellez les lamelles avec du vernis à ongles transparent et séchez les lames pendant la nuit dans l’obscurité avant de les analyser par microscopie confocale.
- Imager les cornées à montage plat à l’aide de la microscopie confocale en assemblant des images individuelles de la pile en Z ; Utilisez un objectif 10x, des lasers de 488 nm et 561 nm et une résolution de 512 pixels x 512 pixels par tranche sur les scanners Galvano non résonants.
- Quantifier la densité du sang CD31+ et des vaisseaux lymphatiques LYVE-1+ à l’aide du logiciel ImageJ.
- Pour déterminer la densité vasculaire, convertissez les images confocales en une image 8 bits.
- Choisissez Vascular Density dans les plugins.
- Choisissez la région qui vous intéresse sur l’image, puis cliquez sur OK. Les mesures s’ouvriront dans une nouvelle fenêtre de données.
- Copiez les valeurs dans un fichier de feuille de calcul et comparez statistiquement la densité vasculaire entre les groupes d’yeux de brûlure alcaline et d’yeux sains à l’aide d’un test t de Student.
REMARQUE : CD31, également appelé molécule d’adhésion des cellules endothéliales plaquettaires-1 (PECAM-1), est une molécule d’adhésion cellulaire impliquée dans l’angiogenèse et est fortement exprimée dans les cellules endothéliales des vaisseaux sanguins précoces et matures13. LYVE-1 (récepteur hyaluronique endothélial des vaisseaux lymphatiques-1) est un marqueur de surface cellulaire sur les cellules endothéliales lymphatiques et peut être utilisé comme marqueur de lymphangiogenèse14.
Résultats
Cette étude décrit une méthode pour induire l’angiogenèse cornéenne dans l’œil de la souris par brûlure alcaline. Les images obtenues au microscope à dissection (Figure 1A,B) ont montré des scores de néovascularisation et d’opacité significativement élevés dans les cornées du groupe des brûlures alcalines (P < 0,05 ; Graphique 1C et D). Les cornées prélevées au jour 10 ont été immunocolorées avec des anticorps monoclonaux anti-CD31 pour les vaisseaux sanguins et des anticorps monoclonaux anti-LYVE-1 pour les vaisseaux lymphatiques, respectivement (figure 2A-I). Le groupe des brûlures alcalines a montré des densités significativement plus élevées de vaisseaux sanguins et lymphatiques après 10 jours (P < 0,001 et P < 0,05, respectivement ; Graphique 2J et K). On a observé que l’épaisseur de la cornée, telle qu’elle a été imagée et quantifiée à l’aide de l’OCT (Figure 3A,B), était significativement plus élevée dans le groupe présentant une brûlure alcaline (P < 0,01 ; Graphique 3C).
Figure 1 : Néovascularisation et opacité cornéennes induites par les brûlures alcalines. (A,B) La néovascularisation cornéenne a germé des vaisseaux du limbe vers le centre cornéen dans l’œil de souris brûlé par l’alcali (B) (A) mais pas dans l’œil sain 10 jours après la blessure. (C,D) Quantification de la néovascularisation cornéenne (C) et de l’opacité (D) dans les panels A et B (± MEB ; test t ; *P < 0,05 ; n = 3 yeux, 1 œil/souris). Les flèches rouges représentent le limbe, et la flèche jaune indique la germination de nouveaux vaisseaux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Néovascularisation cornéenne et lymphangiogenèse provoquées par une brûlure alcaline. L’immunohistochimie a révélé la présence de vaisseaux lymphatiques (A, D, G) sanguins et lymphatiques (B, E, H) à l’aide des anticorps monoclonaux anti-CD31 et anti-LYVE-1, respectivement. (A-C) La cornée saine de la souris. (D-I) La cornée brûlée par l’alcali 10 jours après la blessure. (C,F,I) Images superposées des signaux CD31 et LYVE-1. (G-I) Images agrandies pour les panneaux D-F. Barres d’échelle = (A-F) 200 μm et (G-I) 500 μm. (J,K) Quantification de la densité des vaisseaux sanguins et lymphatiques dans les panneaux A-F, comme indiqué (± MEB ; test t ; *P < 0,05 ; ***P < 0,001 ; n = 3 yeux, 1 œil/souris). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Augmentation de l’épaisseur de la cornée causée par une brûlure alcaline. (A) Une image OCT d’un œil de souris en bonne santé. (B) Une image OCT de la cornée de la souris 10 jours après la brûlure alcaline. (C) Quantification de l’épaisseur cornéenne dans les panneaux A et B, mesurée au centre de la cornée (± MEB ; test t ; **P < 0,01 ; n = 3 yeux, 1 œil/souris). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Discussion
La cornée est un excellent tissu pour étudier l’angiogenèse et l’inflammation car elle est accessible et avasculaire, ce qui signifie que la néovascularisation peut être facilement détectée et documentée. La brûlure cornéenne chez les lapins, les rats et les souris a été utilisée pour étudier l’angiogenèse cornéenne, l’inflammation et l’opacité, l’ulcération, la perforation de la cornée et la fibrose15,16,17. De plus, le modèle murin de brûlure cornéenne est précieux pour tester diverses stratégies thérapeutiques pour l’angiogenèse et l’inflammation, car les souris ont un système immunitaire étroitement lié à celui des humains18. La disponibilité de techniques de manipulation génétique du génome de la souris fait également de l’espèce un excellent choix pour ce type d’étude19. Le défi de cette recherche a été de mettre au point une méthode de brûlure cornéenne qui fournit une physiopathologie cohérente et reproductible.
Le modèle de brûlure alcaline est particulièrement utile pour le criblage pharmacologique de médicaments qui modulent l’angiogenèse, l’inflammation et la fibrose. Les exigences minimales en réactifs et en ressources, la simplicité d’exécution de la brûlure alcaline, les avantages de la courte durée du protocole et de l’observation directe des résultats font de la brûlure alcaline sur la cornée de souris un choix de premier choix pour le criblage pharmacologique des médicaments. Cependant, quelques précautions doivent être prises en compte lors de l’exécution de cette procédure pour assurer la cohérence et la reproductibilité. Tout d’abord, le papier filtre doit être placé au centre de la cornée pour éviter de brûler d’autres zones de l’œil, en particulier le limbe, les paupières et la conjonctive ; deuxièmement, le volume et la concentration de NaOH doivent être appropriés pour obtenir des résultats cohérents de la brûlure alcaline sur la cornée. Le filtre ne doit pas être mouillé mais doit avoir été trempé dans la solution de NaOH. La taille et le type de filtre, ainsi que la normalité et le volume de la solution utilisée dans cette méthode sont optimisés pour éviter un débordement de NaOH. L’utilisation d’un papier filtre de taille différente ou d’un volume plus ou moins élevé de NaOH entraînerait des incohérences dans la néovascularisation. Troisièmement, il est important d’empêcher la solution de NaOH d’absorber le CO2 dans l’air ambiant en serrant immédiatement le bouchon du tube de la solution après utilisation et en réduisant le rapport air/solution. Il faut veiller à utiliser des solutions alcalines fraîches pour éviter les incohérences dans la néovascularisation et éviter l’ulcération cornéenne. Enfin, un lavage approfondi de toute la solution de NaOH de l’œil et de la conjonctive avec une solution saline est nécessaire pour éviter d’autres dommages à la cornée et aux tissus environnants de l’œil. Le lavage en profondeur de la cornée et des tissus adjacents permettra également d’éviter le symblépharon.
Le protocole décrit ici est une méthode efficace et fiable pour étudier la physiopathologie de l’angiogenèse cornéenne. Ce protocole peut être utilisé pour étudier l’inflammation cornéenne, la fibrose et la cicatrisation des plaies.
Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par la SRB Charitable Corporation, les National Institutes of Health (NIH) P30EY002520 et une subvention institutionnelle sans restriction de Research to Prevent Blindness (RPB) au département d’ophtalmologie du Baylor College of Medicine. W.L. est soutenu par la Fondation de l’œil des Templiers en ophtalmologie.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Chlorure de sodium 0,9 | Hospira | KL-7302 | |
| 30 G Aiguille | McKesson | 16-N3005 | |
| A1R Confocal | Nikon Instruments | ||
| Anti-CD31 | Novus Biologicals | NB100-1642R | |
| Anti-LYVE-1 | Life technologies | 53-0443-82 | |
| Module ASM | Heidelberg Ingénierie | Objectif du segment antérieur | |
| Biopsie Punch | McKesson | 16-1309 | |
| BSA | Thermoscientific | 9048-46-8 | |
| Coverslip | VWR International | 22X22-1-601640G | |
| Dissection Microscope | AmScope | SM-4TZ-30WY-10M3 | |
| Fluoromount-G | Microscopie électronique Sciences | 17984-25 | |
| Pince | Outils pour les sciences fines | 15000-02 | |
| Pince | pour les sciences fines | 11049-10 | |
| Pince | Fisherbrand | 12-000-157 | |
| Pinces ; | Roboz | RS-4905 | |
| Gonak Hypromellose ; | Akorn | 17478006412 | |
| GraphPad Prism 9 | GraphPad Sotware, Inc | ||
| Coussin chauffant | K& H Pet Products | 100213018 | |
| Hoescht | Life Technologies | 62249 | |
| HRA + OCT Spectralis | Heidelberg Engineering | ||
| Seringue à insuline | Mckesson | 102-SN310C31516P | |
| Kimwipe Kimberly Clark Professional | 34155 | ||
| Micro Cover Glass | VWR | 48366-067 | |
| Microciseaux | Roboz | RS-5110 | |
| Lame microscopique | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | 55881-500G | |
| Sulfates de néomycine et polymyxine B et dexaméthasone ; | Bausch & Lomb | 24208-0795-35 | |
| Sérum normal | Jackson Immuno | 008-000-121 | |
| Paraformaldéhyde | Sigma Aldrich | 158127-500G | |
| PBS | Gibco | 20012-027 | |
| Proparacaïne HCl | Bausch & Lomb | 24208073006 | |
| Saline | Henry Schein | 1531042 | |
| SMZ125 | Nikon Instruments | ||
| Seringue 10 mL | McKesson | 16-S10C | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | TX1568-1 | |
| Whatmann Papier Filtre | Cytiva | WHA1003323 |
Références
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Réimpressions et autorisations
